基因芯片技术在病原微生物耐药性检测中的应用讲座.doc

基因芯片技术在病原微生物耐药性检测中的应用上海交通大学医学院 李擎天基因芯片的概念、原理和特点是什么？基因芯片技术的主要研究步骤是什么？他在病原体耐药检测中的应用是怎样的？基因芯片技术的芯片制备、样本制备过程是怎样的？一、基因芯片技术的概念和原理（一）概述基因芯片技术是将成千上万个代表着不同的寡核苷酸探针，顾向华在支持无的表面上成为芯片，然后将待测的样品，包括像DNA、RNA CDNA等进行标记，标记的方式有同位素和银光标记，然后将待测无和同样的探针进行杂交，通过对杂交信号的监测和处理而得到待测，五种相关的表达信息之所以讲到相关基因的表达信息，因为相当一部分基因芯片是来做基因的表达研究的，基因芯片技术是建立在探针和再叫测序上的一种高质量的序列分析手段。她通过将大量的探针分子固定在支持物上，与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度以及杂交信号的分布来进行分析，基因芯片技术可以在一块一平方厘米大的小芯片上，根据需要固定成千上万的基因，以此形成密集的基因方阵，来实现对千万个基因的同步检测。（二）基因芯片基本原理基因芯片技术主要涵盖了一个固相的核酸序列，作为他的靶点而以一种或多种标记的样本，也就是说探针与芯片进行杂交，还有一个检测系统开进行定量检测，基因芯片的基本原理也就是利用基因互补配对的原则，在一个载体上来进行基因检测，实际上是一个高密度的杂交技术。由此我们可以得到基因芯片技术包括以下四个主要的基本步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。（三）基因芯片的特点和优势基因芯片的特点和优势，主要在于速度快。最新的基因芯片技术她主要在于杂交时间可以缩短在一分钟以内；效率高。在一张芯片上可以固化检测数千个基因；成本降低就是使芯片更小，检测更多样化；制动化程度高，减少人为误差。（四）基因芯片的检测过程基因芯片的检测过程，首先是寡核苷酸的合成，也就是基因芯片的制备，基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列，因此制造基因芯片，首先要解决的问题是：要如何在基因芯片上定位，合成高密度的核酸探针，目前基因芯片的合成主要有三种方法：光控化学合成技术；雅典印刷发；点样发其中前两种实验为合成光控化学合成技术，是将故乡化学合成个光科技书，有机地合成在一起，首先将支持物表面按计划或者羟基化。接下来的过程是荧光标记与同位素相比，荧光的优势是：他的低污染可以同时检测不同的荧光，不同银光的颜色可能是不一样的，不同银光的耐光不同，随着外界环境的干扰和时间的延伸存在着银光崔灭现象；第三点需要注意的是：过度标记的问题也就是过于高浓度的标记，可能是这些银光集团的距离过大而影响最后的检测效率。基因芯片的样本。包括DNA和RNA芯片DNA准备相对比较简单耳RNA就要注意以下几点1减少RNA的降解2优选RNA纯化方法3在标记前检测RNA的量4在标记前检测RNA的质量5使用统一的样本方案以确保检测的可重复性因为生物样品的成分比较复杂为了提高准确性需要先对样品进行处理比如说来自血液和组织中的DNA或者LRNA样本要先扩征然后再用银光素来标记探针。在芯片这一步要注意的是：要通过预杂交来优化杂交的条件和缓冲液另外芯片杂交过程与我们熟悉的很多面性过程比较类似也就是说严格的洗涤对实验的成功是至关重要的。基因芯片的检测技术最后一步就是数据处理，她包括信号检测质量评估数据整理和聚类分析。首先是原始数据的获取、提取生物样本的MANA并且反转录成CDMA在压箱中与探针进行杂交这一类的实验过程。细末以后用扫描一部或芯片上的信号这个信号图像的基因芯片原始数据，当前已经有许多图片处理的分析软件，他们能够定位并且识别芯片上的每个杂交点，通过背景调整或者分割技术，除去图像上各种噪声在顶两个钟信号轻度比，最后决定基因的变化情况数据处理，还包括数据处理和分析原始的数据化和标准化，并且转化成矩阵以后，通过统计学分析可以重中揭示一些化学分析，目前大致有两类分析方法：也就是差异分析法和聚类分析法。当前对于基因芯片的分析像纯粹和结果的交流这些方面还缺乏一些大家公认的方法。（五）基因芯片的技术应用在基因芯片技术上的应用方面，主要有以下几个方面的应用：基因表达分析这是最主要的一点，还有单核苷酸多态性检测重复序列检测蛋白质的分析以及基因测序分析，像DNA的测序分析就是通过大量的固话花核苷酸探针和技术样品的靶序列进行杂交产生杂交图谱，并且排列出靶，DNA的序列将银光标记的待测DNA样品与芯片上的一帧序列片段杂交，假如说二者完全相配则杂交信号较强；如果不配对，信号较弱，经表达分析是一个方面，它的主要优势是：自动化分析快速，表达水平的检测一般用平行对比的方法。基因芯片在临场上的一般应用举了两个例子一是药物代谢，二是白血病的分型。上图中右面的图显示的是药物代谢，他解释的是CUYP450基因和差异性用药的关系，他和许多的药物在机体内的代谢有关系，这也符合我们目前临场商议中，根据病人的遗传背景差异来进行差异化用药的一个发展趋势；而左图揭示的是白血病的分型，可以通过基因芯片来分出一些像急性淋巴细胞白血病急性粒细胞白血病以及混合细胞的白血病。二、基因芯片技术在病原微生物耐药性检测的应用（一）必要性他的必要性也就是病原性微生物的耐药性问题日趋严重，接下来分三点：基因芯片技术在细菌病毒、寄生虫、耐药性监测中的应用主要的核心内容是在细菌耐药性检测中的应用。首先我们来看：病原性的耐药问题日趋严重，这里举了两个例子一个是金黄色葡萄球菌；另一个是结合诊治杆菌。左图显示的葡萄杆菌，他显示的是世界卫生组织在2007年发布的卫生报告，在1928年菌霉素被发现；1942年青霉素得到应用而随后不断地增长。下面我们来看：基因芯片技术在细菌耐药性检测的应用分论。首先看结合分支杆菌。首先我们看结核分枝杆菌这张片子，现实的是对于结核分枝杆菌和异烟肼耐药性的监测，这里多于一些阳性的、阴性的点，提示的是核苷酸乃至氨基酸的变异而导致了它的耐药，而我们另外应当注意的一点，包括后面的片子里同时注意的一点，就是在同样一个片子上，还加上了不同的对照点，像空白阳性和阴性对照，包括我们在B图和C图的右下角看见的IS6110的插入片段的。上图是另一个米抚平和异烟肼耐药的结核分枝杆菌的耐药检测。第一行显示的是单个基因的变异，而第二行揭示的是多个基因的变异引起的耐药。上图显示的是结核杆菌利福平的耐药检测，她检测了29处耐药突变，他的检测敏感度达到百分之八十，特异性100%，他检测的是RDR这个特意的区段发生的区段和缺失的免疫。接下来继续关注的是结核分枝杆菌，这里显示的是一种叫PCA这个基因的分型，而这种基因适合结合分支杆菌对必行酰胺耐药的有关系，这里给出了一些数据是不同的菌株，它不同的抗性是否对必行酰胺有抗性，以及基因序列的变化和相应的氨基酸序列的变化。我们转到第二个致菌，也就是金黄色葡萄球菌，这里显示的对金黄色葡萄球菌对所氧氟沙星的抗性，以及甲氧西林抗性基因MARKA的检测，这里这个芯片的特点是它是一个三维芯片，也就是不同层的芯片，它包括一个外壳，然后将第一层、第二层的芯片采用面对面的方式重叠，芯片之间留下0.1到20mm高的空隙，而在芯片不同的芯片层之间设置有密封圈。上图研究做的是金黄色葡萄球菌对象甲氧西林、四环素类、红霉素以及万股霉素的耐药基因检测，也就是检测了这个九个基因。继续葡萄球菌，这个研究做得是葡萄球菌对青霉素、甲氧西林、氨基糖苷类、大环内酯类、以及林可酰胺类抗性基因的检测，我们也可以从芯片的图上看到它对不同抗生素的抗性基因的分布情况。我们转到肠杆菌科，这里做得一个是对肠杆菌科细菌的超广光谱内酰胺酶，以及治理接到的内酰胺酶的抗性基因检测。上图显示的是尿大肠I细菌中对佛喹诺酮类抗性的检测，我们在右上角看到的三维图则是检测的项目和尿大肠I细菌的不同的浓度也有关系。利用基因芯片技术高同亮的特性，这里对大肠I细菌对三十种抗性基因进行检测，这些检测对于大肠I细菌对环境的影响以及他的病原学和流行病学的研究都有很重要的意义。（二）利用基因芯片的技术这一页设施一抗生素为主题的系还发能看见环境诶就是你卡机发放你的希勒对于等抗性基因。（三）基因芯片技术在病毒，寄生虫，耐药性检测性的应用首先来看流感病毒对金刚烷耐药性基因的检测，我们看到为了显示的需要，用蓝色表示敏感基因的系列，用红色表示耐药性基因的系列。上图是在我国流行很广的乙肝病毒，乙肝病毒对拉美夫定抗性基因的研究，许多研究都是关注与180和204这两个位点的核苷酸的突变，在左上角的A图芯片图中用白色的框来表示突变的点，B图则是相应的测序结果总结