固定化酶制备及应用的研究进展.doc

固定化酶制备及应用的研究进展摘要：本文主要从分析酶单独应用中的不足、酶的固定化载体、固定化方法等方面介绍了固定化酶制备中的研究进展情况，并且从医药、食品、环保、化学工业、能源等方面其在其中的新应用出发，对固定化酶在新领域中的应用作了综述，给固定化酶研究的发展前景进行了展望，并且指出了今后酶固定化研究的主要方向是多酶的固定化及制备高活性、高负载、高稳定性的固定化酶。关键字：酶；酶的固定化；载体；酶固定化应用领域酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶（immobilized enzyme）这个术语是在1971 年酶工程会议上被推荐使用的。随着固定化技术的发展，出现固定化菌体。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。固定化酶技术为这些问题的解决提供了有效的手段，从而成为酶工程领域中最为活跃的研究方向之一。本文将从酶生物催化剂固定化载体、固定化方法和技术及固定化酶的应用等几个方面出发，归纳和综述这些方面近年来的研究进展。1酶固定化的传统方法关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体以及稳定性研究、改进。 1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。显著特点是：工艺简便及条件温和，包括无机、有机高分子材料，吸附过程可同时达到纯化和固定化；酶失活后可重新活化，载体也可再生。但要求载体的比表面积要求较大，有活泼的表面。1.2 包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中，而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触。这个方法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性被破坏的程度低，但此法对大分子底物不适用。1) 网格型将酶或包埋在凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。2) 微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶。由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊化法。1.3 结合法酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法，叫离子键结合法。其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法。共价键结合法结合力牢固，使用过程中不易发生酶的脱落，稳定性能好。该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较强烈，所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶。1.4 交联法交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联，使酶分子和多功能试剂之间形成共价键，得到三向的交联网架结构，除了酶分子之间发生交联外，还存在着一定的分子内交联。多功能试剂制备固定化酶方法可分为：( 1) 单独与酶作用；( 2) 酶吸附在载体表面上再经受交联；( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体，再连接酶。交联剂的种类很多，最常用的是戊二醛，其他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二联苯胺、N，N-乙烯马来酰亚胺等。交联法的优点是酶与载体结合牢固，稳定性较高；缺点是有的方法固定化操作较复杂，进行化学修饰时易造成酶失活。各类固定化方法的特点比较:比较项目吸附法结合法交联法包埋法物理化学方法分类物理吸附化学共价键结合物理离子键结合化学键连接物理包埋制备难易易难易较难较难固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载体再生可能不可能可能不可能不可能费用低高低中等低底物专一性不变可变不变可变不变适用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶2固定化载体的要求固定化酶载体应具备以下要求大体上有1：1) 在酶催化反应过程的惰性：载体应不与底物、产物及介质发生反应。2) 有良好的渗透性：制备成柱子后，能使底物和产物能快速通过减少吸附。3) 有生物亲和性和相容性，有利于酶活力发挥和稳定。4) 有较高酶负载量，载体表面能提供多个活性位点利于酶分子偶联。 3新型固定化技术传统酶的固定化方法虽在一定程度上可以增强生物催化剂的稳定性，但增强幅度有待进一步提高，并且在此过程中，生物催化剂酶催化活力通常损失严重。运用当代高新技术和设计合成新型载体以及两者的有机结合是引人注目的研究动向。因此目前不断地有新的载体和技术引入每的固定化领域，如：无载体固定化、微波/超声辅助的固定化、阳光照射、离子液体，电辅助固定化等等，且固定化生物催化剂的应用也越来越广泛地应用于医疗、生物医药、环境保护、食品工业、化学工业、能源领域等。121.2.3.3.1. 酶固定化过程中的新载体1.2.3.3.1.3.1.1 介孔材料孔道的结构和尺寸对酶活力及稳定性有着明显的影响，合适的孔道中酶固定化后其活力提高到游离酶的2倍，且三维及大孔道有利于固定化与催化过程中酶蛋白和底物、产物的传输，从而能提高酶的固定化和催化效果2。目前，大孔道、高比表面和孔容的新型介孔材料不断被引入酶固定化领域，因为大孔道、高比表面、高孔容的介孔材料中酶的负载量大（图3），且酶的负载能快速完成，负载量显著提高。 图3 孔道大的酶介孔材料的酶负载量大明显提高3.1.2 纳米管碳纳米管( carbon nanotube，CNT)是由Iijima于1991年发现的一种新型纳米材料。它是由石墨片层卷曲而成的无缝纳米管3。将生物分子，如氨基酸、蛋白质、酶、DNA 等结合在碳纳米管表面或端口上，可提高它在水溶液中的溶解度，为实现碳纳米管的各种生物应用奠定基础4。纳米管的内表面能够与酶之间存在强烈的相互作用，从而使得管内酶蛋白结构稳定且保留相当的催化活力，并且用其制成电极能够有效实现底物氧化及电子的传递5。硅纳米管用于固定化酶时，能够保持酶的活性，并且提高酶的热稳定性及对PH的耐受性6。3.1.3 磁性高分子微球磁性高分子微球是由无机磁性纳米粒子与有机高分子通过包埋法、单体聚合法合成的具有磁响应性和微球特性的粒子。通过共聚合和表面改性，磁性高分子微球表面可被赋予多种活性功能基团（如-OH、-COOH、-CHO等）。无机磁性纳米粒子应用较多的是Fe3O4，单体聚合法主要包括乳液聚合、无皂乳液聚合、微乳液聚合、种子乳液聚合。磁性微球有良好的表面效应和体积效应：比表面积较大，微球官能团密度较高，选择性吸附能力较强，吸附平衡时间较短；选择磁响应性，可以避免使用中粒子之间发生磁性团聚；物理化学性质稳定，具备一定的机械强度和化学稳定性，能耐受一定浓度的酸碱溶液和微生物的降解；表面本身具有或通过表面改性赋予多种活性的功能基团，这些功能基团可以连接生物活性物质7。3.1.4 离子液体离子液体是一种新的绿色溶剂，在生物催化反应中具有以下特点:在离子液体中酶有良好的选择性、稳定性和反应活性。离子液体可溶解极性大的反应物，产物易分离，酶和离子液体可重复使用8。离子液体是由有机正离子如烷基吡啶离子、季胺盐离子、烷基咪唑离子等和不同的负离子组成的低熔点的有机熔盐，在室温或低温下是液体。离子液体和水、常用有机溶剂可以互溶，但和大多数醚、烷烃不溶，因此可以用醚、烷烃来萃取产物。并且可以通过改变正负离子及烷基碳的长短调节其极性和亲水性，故又被称为可设计溶剂。Erbeldinger9小组首次报道在离子液体BMIMPF6PH2O(95P5 vPv)中用蛋白酶thermolysin成功催化合成了阿斯巴甜(Z2aspartame)(图式4)，开创了在离子液体中生物催化研究的新领域。图式4 离子液体中蛋白酶thermolysin催化的合成阿斯巴甜的反应3.2 酶固定化的新技术、新方法44.24.33.23.2.1 微波/超声辅助固定化微波是一种电磁波，波长为0.1100 cm。微波加热的主要原理是介质材料的极性分子在微波高频电场的作用下反复快速取向转动而摩擦生热，是从物质内部开始，瞬时达到需要的温度。微波加热具有许多传统加热不具备的优点，包括：加热迅速、均匀，不需要热传导过程，内外同时加热，加热时间短；加热质量高，营养破坏少；节能高效；易于控制功能等超声波是指振动频率大于20 kHz以上的一种纵波，在介质中传播时，使介质发生物理的和化学的变化，从而产生一系列超声效应，包括热效应、机械效应、空化效应和化学效应10。研究认为，超声波对液体化学反应速度和产率的影响主要是超声波在液体介质中的空化作用，超声可使液体介质中形成微泡，其破裂伴随能量的释放，可以提高许多化学反应的速度。到目前为止，超声波技术对物质提取，高分子降解，酶解反应等都有很好的促进作用。其中超声波酶解反应具有高效、廉价、无污染，可提高酶促反应速度和有效成分的产率。3.2.2 无载体固定化交联酶晶体（cross-linked enzyme crystals，CLECs）是指通过交联剂，如：戊二醛，将在水溶液中的酶晶体交联成一种稳定结构及性能的晶态物质，其既具有酶的高活性、高选择性、反应条件温和等特点，又具有固相催化剂的环境适应性强、易回收等优势，从而使其在有机合成中应有较广。CLECs是一种无需载体、既有纯蛋白的高度特异活性又对有机溶剂具有高度耐受性的生物催化剂。由于CLECs需要高纯度酶结晶，实验室难以实行，所以其发展受到很大限制。交联酶聚集体(Cross-linked Enzyme Aggregates，CLEAs)技术是一种将蛋白质先沉淀后交联形成不溶性的、稳定的固定化酶，是通过基本纯化的、高浓度的蛋白质样品的共价交联来实现的。具有对酶的纯度要求不高、不需要结晶等复杂步骤、可可获得稳定性好、活性高、成本低、易于推广、空间效率高等特点，因此是一个很有发掘潜力的固定化方法。4固定化酶的应用固定化酶的研究和应用不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且因为具有节省能源与资源、减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求，目前固定化酶已被广泛应用于医药领域、食品行业、化工行业、材料科学、环保领域、能源领域、蛋白质组学等领域。4.4.1. 医药领域固定化脲酶：脲酶是专一性催化尿素水解的酶，应用于尿素生产控制、产品检验，也广泛用于临床医学、医学检验等，脲酶的固定化在血液透析中有着极佳的应用前景。固定化磷酸酯酶：磷酸酯酶的作用是催化水解低密度脂蛋白上的磷脂的酶，加速体内低密度脂蛋白的代谢。人体中的低密度脂蛋白是主要的血浆胆固醇载体，由于其在体内代谢缓慢，易形成高血浆胆固醇，以至引起心血管疾病，因此磷酸酯酶的固定化可以应用于心血管疾病的治疗。固定化葡聚糖酶：葡聚糖酶常用于水解在血液替代品的制备过程中产生的右旋糖酐。4.2. 食品行业固定化酶应用于食品检测：固定化酶技术的发展使生物传感器也得到相当大的发展，它不仅使食品成分的高选择性、快速、低成本分析测定成为可能，而且生物传感器技术的持续发展将很快实现食品生产的在线质量控制，降低食品生产成本，并可以保证安全可靠及高质量的食品11。4.3. 生物传感器方面的应用在医学领域，生物传感器因快速、灵敏、专一、响应快等优点发挥着越来越重要的作用。目前，在检测多种细菌、病毒及其毒素等多个方面生物传感器已有较广泛应用。比如高精度血糖分析仪是采用固定化酶的生物传感分析仪，其分析精度可以达到0. 5% 2%，比家用保健类生物传感器几乎高一个数量级，比目前医用生化分析仪的精度也高2% 3%。这在血糖分析领域是非常重要的。酶电极现已用于测定各种糖类、抗生素、氨基酸、有机酸、脂肪、醇类、胺类以及尿素、尿酸等。4.4. 环境保护在环境监测方面，固定化酶也可以用于测定有毒物质含量以进行环境监测。杨雪梅等选用硅胶、活性炭、大孔树脂，在一定条件下用物理吸附法固定蛋白酶，3种载体固定的蛋白酶对含高浓度蛋白质的淀粉黄浆废水进行水解实验，发现大孔树脂对蛋白酶的效果良好，并对含高浓度蛋白质的废水处理效果最好12。在废水处理中，固定化酶也受到了越来越多科学家的关注。生活污水和工业废水中有害成分主要是氯酚，将辣根过氧化物酶大量吸附在磁石上，可以保证其100%的活力，且净化效果是粗酶的20多倍。4.5. 能源利用近年来不少学者为了解决能源紧缺问题致力于利用固定化的脂肪酶催化合成生物柴油。高阳等研究了利用多孔渗水物质为载体固定脂肪酶，使其可在低水环境中合成生物柴油13。氢气作为一种清洁能源已引起人们的关注。有学者利用聚丙烯酰胺凝胶包埋丁酸梭状芽孢杆菌IFO3847菌株，可以利用葡萄糖生产氢气，并且稳定性好，无需隔氧。5 结论与展望（1） 制备高稳定、高负载、高活性的固定化酶是酶固定化研究的主