《半薄超薄切片技术》PPT课件.ppt

半薄/超薄切片技术 背景： 肉眼 光学显显微 镜镜 透射电镜电镜 分 辨 率 0.2mm0.2m0.2nm 应应 用 范 围围 可观观察 头发丝头发丝 、双面 刀刀刃 的厚度 可观观察细细 胞的结结构 (最大有效倍数 :1000) 可观观察细细胞内的 结结构,分辨DNA、 蛋白质质等生物大 分子、单单个金属 原子（放大倍数可 达百万倍） 观观察半薄切片观观察超薄切片 半薄切片 超薄切片 ？ 一、超薄切片技术介绍 固定地好 渗透包埋地好 切地好 载网膜做地好 染地好 超薄切片的基本要求: 超薄切片主要步骤 取材 固定 漂洗、脱水 渗透、包埋 超薄切片 超薄切片染 色 每一步都是关 键,任何环节的 疏忽都会导致 制片的失败 1 取材 1.1 取材的基本要求 (1)动作迅速，取材后快速放入固定液中； (2)体积要小，一般13，如果来不及，例如野外取 材，也可将组织修成（112）mm大小长条形 ，之后再进行分割。 (3)减小损伤，切割器械锋利，操作轻，避免牵拉 、挫伤与挤压组织。 (4)低温操作，最好在低温(04)下进行，降 低酶的活性。所用器具和固定液都应预冷。 (5)取材部位要准确。 1.2 取材方法 材料放在洁净的韧性较大的纸上 滴上预冷的固定液 用刀片将组织切下并修小 用牙签或镊子将组织块移至盛有预冷 的固定液的小瓶中。 植物材料的取材可以先切成薄片，经适 当固定后再切成小方块继续固定。 2 固定 (抽气) 2.1 固定的目的 采用物理、化学等方法迅速杀死细胞的 过程称之为固定。 目的是尽可能使细胞中的各种细胞器以 及大分子结构保持生活状态，牢固地固定 在它们原来所在的位置上，不发生位移。 良好的固定是获得精细结构的形态学图 象的关键。 2.2 常用固定剂 (1)四氧化锇 (OsO4)- OSMIUM TETRAOXIDE 强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、 蛋白质、磷酸脂蛋白； 固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原 ； 具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好； 酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定； 与乙醇/醛类反应生产沉淀漂洗 分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25； 固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难； 锇酸固定液常用浓度：12; 极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心! (2)戊二醛 ( C5H8O2)-glutaraldehyde 有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好； 渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管 、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡 等； 保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究； 对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度 :0.51mm ,04可长时间固定(几周甚至12个月) 不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材; 缺点:不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显 示较差，没有电子染色作用。 (3)甲醛-Formaldehyde 渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组 织（种子）固定作用好； 细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶 活性的保存优于戊二醛； 缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后 大部分细胞基质将丢失； 常用多聚甲醛戊二醛的混合固定液。 (4)高锰酸钾 强氧化剂，较好固定脂蛋白; 对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结 构的研究均可作为固定剂； 只用于某些常用固定剂难以固定的植 物和酵母样品，且一般不需要用锇酸 后固定. 3漂洗、脱水 3.1漂洗 漂洗的目的: 组织固定后脱水前的漂洗: 清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间 的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察. 双重固定中,在锇酸固定前的漂洗: 避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的 饿沉淀，破坏细胞结构. 常 用 缓缓冲液 优优 点缺 点 pH 磷酸盐盐 缓缓冲液 对细对细 胞无毒性作 用,缓缓冲能力强 固定时时易产产生 沉淀,易长细长细 菌 植物材 料一般 6.87.2 二甲砷 酸盐缓盐缓 冲液 不易长细长细 菌,与低 浓浓度钙质钙质 1-3mM 不发发生沉淀反应应 有毒(通风风橱) 醋酸 巴比妥 缓缓冲液 固定时时不产产生沉 淀 易长细长细 菌,只 适于配锇锇酸固 定液,不适合配 醛类醛类 (缓缓冲失 效) 3.2 脱水 目的 将组织内的游离水彻底清除,保证 包埋介质完全渗入组织内部。 方法 用一种和水及包埋剂均能相混溶 的液体来取代水,常用的脱水剂是 乙醇和丙酮。 注意事项 脱水梯度逐级进行, 急剧脱水会引起细胞 收缩。（ 30% 50%70%80%95%100%100%）; 更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会 在组织内外产生微小气泡，影响渗透； 脱水过程中应在70%脱水剂中4停留或 过夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提， 而且会使样品发脆，造成切片困难; 置换用脱水剂：环氧丙烷（Epon812）、 二甲苯（石蜡）。 4 渗透和包埋、聚合 4.1渗透 渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部 取代脱水剂的过程。 包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体 ，能够渗入组织内，当加入某些催化 剂，经加温或其他条件，能聚合成固 体，以便进行超薄切片。 4.2 包埋、聚合 包埋操作： 将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中 或胶囊中，一定条件下可聚合硬化， 形成包埋块。 包埋板 1 包埋管 胶囊 常用的包埋剂 Epon812 渗透效果好，切片的图图像对对比度强 ，电电子束照射下稳稳定 吸潮性很强， 潮湿和炎热热的 环环境下，树树脂 会变软变软 Spurr 黏度低，可较较好地渗透具有硬的木 质质化细细胞壁的植物细细胞、脂肪含 量很高的内胚乳、高度液泡化的成 熟果实实,电电子束照射下稳稳定 图图像对对比度较较 弱 Araldite 聚合均匀，收缩缩量很小，超薄切片 可直接沾在没有支持膜的载载网上， 电电子束照射下十分稳稳定，用重金属 染色时时易着色。 环氧树脂(epoxy resin) 水溶性树脂丙烯酸类树脂 LR White、 Lowicryls、GMA、PEG 等 ，适于进行组织化学和细胞化学研究的样 品制备。 适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的 制备。 包埋操作中的注意事项 所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中； 所用器皿应烘干； 配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀； 包埋时动作要轻巧，防止产生气泡； 盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净. 皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎； 5 超薄切片 5.1修块 削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组 织的四周以和水平面成45度的角度削去包 埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长 方形，每边的长度为0.2mm0.3mm。 5.2 超薄切片 超薄切片机：LEICA ULTRACUT R 超薄切片厚度: 100nm,一般 50-70nm 5.3 载网和支持膜 载网(超薄) 载网 铜网 (常用) 不锈钢网镍网 (免疫电镜) 直径：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm 5.3 载网和支持膜 (2) 载网支持膜 膜的要求:透明无结构,并能承受电子束的轰 击. 支持膜的种类: 火棉胶膜 聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜) 碳膜 膜的厚度:10nm20nm 6 超薄切片的染色 目的: 增强样品的反差,提高图象的清晰度. 常用染色剂: 重金属盐 各种染料 常用的染色剂: 醋酸铀和柠檬酸铅。 染色方法： (1) 组织块染色 在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用 70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色 时间2小时以上，或在冰箱中过夜。 超薄切片染色 (2)超薄切片后染色 醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染 铀染:细胞核及结缔组织染色 铅染:提高细胞质成分的反差 1）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积） 3%戊二醛 in 0.1M PBS ,ph7.2，室温5-6h，后4C保存 2）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 3）后固定 1%锇酸固定 in 0.1M PBS，4C overnight 4）漂洗： 0.1M PBS Ph7.2 充分漂洗3-4次，20-30Min/次 5）系列脱水：30%-50%-70%（4C, overnight,可以停下）-80%- 95%-100%-100%） 用丙酮置换乙醇： 乙醇:丙酮=1:1，纯丙酮2次， 每级20-30分钟 6）渗透 丙酮:树脂=2:1， 1:1（可以停下了，overnight） ，1:2 2-3h/级 纯树脂12h， 换纯树脂12h （从进入树脂开始更要严格防潮！） 7）包埋聚合 60C 24hr 注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂， 固定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛 in 0.1M PBS Ph 7.2 超薄切片图片 二、半薄切片技术介绍 半薄切片主要步骤 取材 固定 漂洗、脱水 渗透、包埋 半薄切片 半薄切片染 色 每一步都是关 键,任何环节的 疏忽都会导致 制片的失败 FAA固定液 （福尔马林5-冰醋酸5-70%酒精90）半薄/石蜡切 片 一般固定根、茎、叶、花药、子房组 织切片。 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精， 防止材料收缩； 加入5%甘油可防固定液蒸发和材料 变硬。 卡诺固定液 12 纯酒精15ml30ml 氯仿5ml 冰醋酸5ml1ml 渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟， 但固定时间不能太久，一般不超过一天 切片厚度：0.55um 切片捞到载玻片上 半薄切片 半薄切片染色 染色方法现现 象 番红红固绿对绿对 染法 木质质化的细细胞壁及细细胞核红红 纤维纤维 素的细细胞壁及细细胞壁 绿绿 铁矾苏铁矾苏 木精法 细细胞一般结结构及细细胞分裂时时期 的优优良染剂剂，细细胞分裂时时期的 染色体染成黑色 高碘酸席夫反应应法 （PAS法） 植物组织组织 染成不同程度的红红色 ，可将纤维纤维 素细细胞壁及淀粉粒 染成红红色 染料介绍 细细胞壁的染料 酸性