[农学]水稻穗发芽抗性鉴定方法筛选、生理学研究及配合力分析----廖泳祥.doc

分类号 S511.01 学 号 S20071851 四川农业大学 硕士学位论文 水稻穗发芽抗性鉴定方法筛选、生理学研究水稻穗发芽抗性鉴定方法筛选、生理学研究 及配合力分析及配合力分析 廖泳祥廖泳祥 指导教师指导教师 吴吴 先先 军军 教教 授授 学科专业学科专业 作作 物物 遗遗 传传 育育 种种 研究方向研究方向 水水 稻稻 遗遗 传传 育育 种种 2009 年年 6 月月 Sichuan Agricultural University A Thesis Submitted for the Master Degree Studies on Screening of Identification Method, Physiological Characteristics and Combining Ability Analysis of Pre-harvest Sprouting Tolerance in Rice By Yongxiang Liao Directed by Prof.Xianjun Wu In Sichuan Agricultural University Yaan, Sichuan, P.R.China, 625014 Jun,2009 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得 的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它 教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 年 月 日 导师签名: 年 月 日 i 目目 录录 中文摘要I 英文摘要III 第一章 作物穗发芽研究综述1 1 研究方法1 2 作物穗发芽生理生化机制2 2.12.1 淀粉酶淀粉酶.3 2.22.2 内源赤霉素（内源赤霉素（GAGA）和脱落酸（）和脱落酸（ABAABA）3 2.32.3 穗部及籽粒特征与穗发芽穗部及籽粒特征与穗发芽 5 2.42.4 环境因素环境因素 6 3 作物穗发芽化学调控6 3.13.1 外源外源 ABAABA.6 3.23.2 穗萌抑制剂和穗芽克穗萌抑制剂和穗芽克 7 3.33.3 多效唑和植物提取物多效唑和植物提取物.8 4 作物穗发芽抗性的遗传机制8 5 作物穗发芽抗性的分子生物学研究9 5.15.1 作物穗发芽抗性相关基因研究作物穗发芽抗性相关基因研究.9 5.25.2 作物穗发芽抗性分子标记作物穗发芽抗性分子标记10 6 目的与意义 .11 第二章 杂交水稻制种不育系穗发芽抗性鉴定方法的研究12 1 材料与仪器.12 1.11.1 材料材料 .12 1.21.2 仪器仪器 .12 2 方法.12 2.12.1 田间试验田间试验 .12 2.22.2 穗发芽抗性鉴定穗发芽抗性鉴定 .13 2.32.3 种子吸水速率测定种子吸水速率测定13 2.42.4 统计分析方法统计分析方法 .13 3 结果与分析 .14 3.13.1 水稻不育系（同型保持性代替）穗发芽抗性初步鉴定水稻不育系（同型保持性代替）穗发芽抗性初步鉴定 14 3.23.2 鉴定方法的评价鉴定方法的评价 14 3.33.3 吸水速率与穗发芽相关分析吸水速率与穗发芽相关分析 18 4 讨 论.19 第三章 水稻制种中杂交种子穗发芽生理特性研究20 1 材料、药品和仪器.20 ii 1.11.1 材料材料 .20 1.21.2 主要试剂主要试剂 .20 1.31.3 主要仪器主要仪器 .21 2 2 试验方法试验方法 .21 2.12.1 田间试验田间试验 .21 2.22.2 人工雨室诱导穗发芽人工雨室诱导穗发芽21 2.32.3 淀粉酶活性测定淀粉酶活性测定 .22 2 2. .4 4 赤赤霉霉素素和和脱脱落落酸酸含含量量测测定定 .22 2.4.12.4.1 样品中激素的提取样品中激素的提取22 2.4.22.4.2 激素含量测定激素含量测定 .22 3 3 结果与分析结果与分析 .24 3.13.1 杂交种子成熟过程中淀粉酶活性的变化杂交种子成熟过程中淀粉酶活性的变化24 3.23.2 杂交种子内源赤霉素含量和脱落酸含量的变化杂交种子内源赤霉素含量和脱落酸含量的变化25 4 4 讨讨 论论 .26 第四章 水稻发芽敏感性配合力分析27 1 1 材料与仪器材料与仪器 .27 1.11.1 供试材料供试材料27 1.21.2 主要仪器主要仪器 .28 2 2 试验方法试验方法 .28 2.12.1 田间试验田间试验 .28 2.22.2 穗发芽敏感性测定穗发芽敏感性测定 .28 2.32.3 分析分析方方法法 .28 3 3 结果与分析结果与分析 .28 3.13.1 配合力方差分析配合力方差分析28 3.23.2 一般配合力和特殊配合力分析一般配合力和特殊配合力分析 .29 3.33.3 亲本表型与一般配合力和特殊配合力关系亲本表型与一般配合力和特殊配合力关系 .30 3.43.4 群体配合力方差估算群体配合力方差估算 .30 3.53.5 遗传率的估算遗传率的估算 .31 4 4 讨讨 论论 32 参考文献参考文献：.33 致 谢.39 在读期间发表或撰写的论文.41 I 中文摘要 水稻杂交种子收获前穗发芽是一个较为普遍的现象，严重影响杂交水稻种子产 量和质量，制约着杂交水稻的推广。目前，我国生产上应用的大部分不育系对穗发 芽敏感性较高，收获期遇到阴雨天气极易引起穗发芽。如何控制水稻穗发芽已经成 为水稻育种中一个重要课题。本试验对水稻穗发芽抗性鉴定方法进行筛选，探讨了 杂交种子穗发芽过程中的生理特性，并对杂交水稻发芽敏感性配合力进行分析。主 要结果如下： 1. 水稻穗发芽抗性鉴定方法筛选 采用 3 种方法，即塑料袋整穗保湿发芽、籽粒培养皿发芽和人工雨室诱导穗发 芽，对冈 46A、D69A 等 10 个水稻不育系和蜀恢 527 配制的杂交水稻制种组合杂交 种子进行穗发芽抗性鉴定。初步鉴定出 D23A 和 D65A 等较抗穗发芽的不育系。塑 料袋整穗保湿发芽、籽粒培养皿发芽和人工雨室诱导穗发芽，均能对水稻穗发芽抗 性进行评价。相比之下，以塑料袋整穗保湿发芽更为准确、适用，适合对育种材料 进行大规模鉴定。利用籽粒培养皿发芽鉴定水稻不育系穗发芽抗性时，以授粉后 15d 和 20d 为适当的时期，以两次发芽率加权值为鉴定指标较为合适。利用塑料袋 整穗发芽鉴定不育系穗发芽抗性时，以授粉后 25d、30d 和 35d 为适当的时期，以 3 次整穗发芽率加权值为鉴定指标较为合适。 2. 水稻制种中杂交种子穗发芽生理特性 利用易于穗发芽和不易穗发芽不育系 D69A 和 D23A 分别与蜀恢 527 杂交，测 定杂交种子发育过程中淀粉酶和内源激素的含量变化。制种组合 D69A/蜀恢 527 杂交 种子穗发芽率为 44.84%,比 D23A/蜀恢 527(穗发芽率为 5.59%)易于穗发芽。授粉后 15d 至完熟的籽粒灌浆期，杂交种子经 10d 穗发芽诱导处理过程中，D69A/蜀恢 527 杂交种子 -淀粉酶活性和 -淀粉酶活性均明显高于 D23A/蜀恢 527；D69A/蜀恢 527 杂交种子 ABA/GA 含量比先上升后下降，呈抛物线趋势变化，而 D23A/蜀恢 527 杂 交种子 ABA/GA 含量比的变化与此相反。由此认为，在杂交水稻制种中，杂交种子 内源激素组成中 GA 含量优势和高水平的淀粉酶活性是穗发芽主要的生理基础。 3. 杂交水稻发芽敏感性配合力分析 以穗发芽抗性不同的 6 个水稻不育系和 5 个恢复系为亲本，采用不完全双列杂 II 交设计，以发芽指数为指标，对亲本配合力进行分析。结果表明，蜡熟期水稻发芽 敏感性受基因加性效应和非加性效应共同作用，以基因加性效应为主。亲本发芽敏 感性与一般配合力效应关系较为密切，相关系数为 0.6189，呈显著正相关关系，因 此可以根据亲本发芽敏感性表现选配杂交组合。杂种 F1发芽敏感性受母本的影响大 于父本的影响。水稻发芽敏感性遗传力较高，广义遗传率和狭义遗传率分别是 92.75%和 54.64%，可以在早代-中世代对其进行选择。 关键词关键词：水稻；穗发芽；鉴定方法；内源激素；淀粉酶；配合力 III Abstract The phenomenon of pre-harvest sprouting (PHS) exists widely before the hybrid rice harvested. It brings bad effects on seed quality and comercial value and limits the exploitation of hybrid rice. At present, the most of male sterile lines in seed production are sensitive to PHS. It is even worse if meeting the rainy days before harvesting. It has been one of the most important problems to control the PHS in rice breeding. In this study, we reported the screening of the identification methods of PHS tolerance, the study of PHS physiological characteristics of hybrid seeds and the analysis of combining ability of PHS. The detail results were summarized just as follows: 1. The screening of the identification methods of PHS tolerance Three methods, the plastic sack sprouting test, the grains petri dish sprouting test and artificially induced sprouting test, were selected to identify the resistance of PHS of the hybrid seeds of 10 combinations. The result indicated that all the three methods were able to identify the resistance of PHS in rice, but the plastic sack sprouting test was the most simple and reliable one. While using the plastic sack sprouting test to identify PHS resistance, the best period was in 20 days, 25 days and 30 days after pollination and three times weighted germination percentage was the appropriate identification indexs. While using the grains petri dish sprouting test to identify PHS resistance, the best period was in 15 days and 20 days after pollination and two times weighted germination percentage was the appropriate identification indexs. 2. The studies of physiological characteristics of PHS Two combinations, D69A (a high-sprouting CMS)/R527 (a restorer line) and D23A (a low-sprouting CMS)/R527, were used to study the physiological characteristics of PHS. The results indicated that the hybrid seeds of D69A / Shuhui 527 that pre-harvest sprouting percentage was 44.84% , was higher than that of D23A/Shuhui527(5.59%). The amylase activity of the hybrid seeds of D69A / Shuhui 527 were higher than that of D23A/Shuhui527, while in the treatment of higher temperature and higher humidity. And also indicated that ABA/GA content ratio of D69A/Shuhui527 was shown a parabolic IV trend, but that of D23A/Shuhui527 was shown anti-parabolic trend. During late stage of maturity, GA content advantage of endogenous ABA/GA and a higher level of amylase activity in grains may be the major physiological basis of PHS in the production of hybrid rice. 3. Analysis of combining ability of susceptibility of pre-harvest germination The combining ability for susceptibility of pre-harvest germination was studied with 6 male sterile lines and 5 restorer lines by the method of p q incomplete diallel cross design. The results indicated that the susceptibility of pre-harvest germination was affected by additive and non-additive gene effect, but the effect of additive genes was predominantThe correlation coefficients between susceptibility of pre-harvest germination value of parents and GCA effects was 0.6189In other words, the higher susceptibility of pre-harvest germination value of parents, the greater the GCA effect in progeny populationThe susceptibility of pre-harvest germination was influenced more greatly by female than that of male. The estimates of broad-sense and narrow-senes heritability were 92.75% and 54.64%, respectively, which indicated that selection for the resistance could be carried out in early-middle generation of the hybrids. Key words: rice; pre-harvest spouting; identification method; endogenous hormones; amylase activity; combining ability 1 第一章第一章 作物穗发芽研究综述作物穗发芽研究综述 穗发芽（Pre-harvest Sprouting, PHS）是指作物在收获前遇到连连阴雨或在潮湿 环境下，种子在穗上发芽的现象1。在水稻、玉米、小麦等禾谷类作物中均有发生， 严重影响作物的产量、品质和种用价值。据报道，日本、美国、加拿大、澳大利亚、 巴西、德国等地区也时常遭受穗发芽危害。1973 年成立了国际谷物穗发芽组织委员 会，至今已举办 10 届国际谷物穗发芽研讨会。 在水稻繁殖制种中，由于不育系的休眠性浅、种子裂颖等生物学特点，加上“九 二0”的大量施用加重了穗发芽的发生。长江流域和西南地区困扰杂交水稻种子生产 的“穗芽”问题，几乎每三年一遇，曾因“穗芽”而减产10%20%，严重时达50%以上。 据调查，平均每年杂交稻种子因穗发芽导致种子活力下降10%以上2，严重影响杂交 水稻种子质量，制约杂交水稻的推广。如何控制水稻穗发芽早已经成为杂交水稻育 种中一个重要的课题。小麦穗发芽最为严重。我国长江流域、西南地区、东北春麦 区和北部冬麦区经常遭受穗发芽危害。穗上发芽籽粒由于籽粒内部的-淀粉酶活性 升高，贮存物质开始降解，不仅降低了小麦产量和种用价值，而且面粉的品质也严 重恶化3。沈正兴等研究发现小麦穗发芽因-淀粉酶活性上升，促使籽粒淀粉降解 造成籽粒品质劣化，同时蛋白酶的水解活动使蛋白酶降解为麦谷朊和小分子氨基酸， 从而导致筋力下降4。同时，穗发芽还造成蛋白质酶活性、脂肪酶活性、酚氧化酶 活性和过氧化氢酶活性升高，导致加工品质被破坏5。另外穗发芽率高的小麦品种 产量、千粒重和容重更低6。据报道，1998年解放军总后勤部嫩江农场 2104hm2小 麦发生严重穗发芽，受灾面积达 100%，第二年因断种而必须从外地调种。 国内外研究表明，作物穗发芽抗性是一个极为复杂的生物学性状，既受遗传因 子控制，同时与种子的发育程度、生理生化特性、生物学特性和环境因素均有关系。 1 1 研究方法研究方法 小麦穗发芽抗性鉴定方法一般有三种，即整穗发芽试验、籽粒发芽试验和延期 收获田间自然鉴定。鉴定指标：形态指标，包括基于粒色、穗型、角度、芒型等鉴 定抗性的间接指标；生化指标，包括a-淀粉酶活性、胚对外源ABA的反应和面粉的 2 沉降值等评价品种的抗性；直接用种子的发芽率或发芽指数作为品种的穗发芽抗性 的表型值。小麦发芽试验一般在开花后25d、30d和35d进行，7d后检查穗上发芽率。 籽粒发芽试验是在穗发芽抗性的敏感时期即蜡熟期取样，手工脱粒，测定种子的发 芽率。整穗发芽试验包括6种方法，即湿润室测定穗发芽、沙中测定穗发芽、发芽纸 中测定穗发芽、塑料袋保湿法测定穗发芽、人工模拟降雨诱导穗发芽和纱布保湿测 定穗发芽。其中塑料袋保湿法由于对穗发芽的选择压力小，与田间的自然选择压相 近，因而所测定的穗发芽率与田间穗发芽率较为一致，且简便可靠。延期收获田间 自然鉴定法就是在作物成熟后延迟收获,使其在田间自然发芽。由于气候的不可控性， 该方法重复性差。 测定-淀粉酶活性的方法，常用的包括降落值法（FN）、3，5-二硝基水杨酸法、 底物染色法（凝胶扩散法）、酶联免疫吸附测定法、和黏度参数法（RVA）等7。 降落值法（FN）是目前国际上测定小麦-淀粉酶活性的常用方法，能够反映淀粉 受到淀粉酶降解后其黏度下降的程度，是多种降解酶的综合反映，能够比较全面反 映小麦穗发芽后的损害程度。3，5-二硝基水杨酸法是利用 3,5-二硝基水杨酸与还原 糖，如葡萄糖或麦芽糖等反应后其产物的浓度与吸光值之间的线性关系来测定 -淀 粉酶活性。底物染色法，利用-淀粉酶催化底物降解，根据产生蓝色反应产物的特 性，然后直接通过目视或比色计检测颜色的深浅推测-淀粉酶活性。酶联免疫吸附 测定法是免疫技术的一种，对收获前发生穗发芽的籽粒和含有迟熟-淀粉酶 （LMA）基因的籽粒中所合成的高等电点的-淀粉酶同工酶的检测具有专一性，是 目前批量鉴定LMA最为理想的方法。黏度参数法，由于受穗发芽损害的小麦籽粒中 -淀粉酶活性的急剧增加，导致 RVA（Rapid Visco Analyser）峰值黏度的降低，所 以黏度参数变化可以反映小麦穗发芽的损害程度。不同品种种胚对外源 ABA 的敏 感性差异与穗发芽抗性具有密切的关系，因而可用籽粒胚对外源ABA的反应来鉴定 穗发芽抗性。 总之，无论是发芽试验还是生理测定，都存在一定的误差，并且年份间和重复 间也有变异，因而穗发芽抗性鉴定应根据实际条件灵活采用多个指标和多年鉴定相 结合，最后对品种的穗发芽抗性作出综合评价。 3 2 2 作物穗发芽生理生化机制作物穗发芽生理生化机制 作物穗发芽过程是一个复杂的生理过程, 它与种子的后期成熟同步，光合产物 的积累与分解交错。其影响的因素很多，主要包括淀粉酶、内源激素、穗部和籽粒 性状、水分、温度等。 2.1 淀粉酶 高水平-淀粉酶活性是造成小麦穗发芽严重的主要原因之一，即种子成熟后期 -淀粉酶活性水平越高，品种越易穗发芽；相反，-淀粉酶活性水平越低，品种越 抗穗发芽2,4,8,9,10。杨俊等研究了水稻穗发芽与籽粒内可溶性糖和-淀粉酶活性间的 关系，发现籽粒内可溶性糖和-淀粉酶活性与水稻穗发芽之间密切相关，并提出可 溶性糖含量可以作为穗发芽抗性的选择指标11。沈正兴等研究发现-淀粉酶与发芽 率呈显著正相关。浸润后的籽粒-淀粉酶活性及其增量与发芽率具有极显著正相关 关系，相关系数分别为0.8059* 和0.8080*，说明-淀粉酶活性的增强导致种子发 芽。淀粉酶的活化是小麦籽粒品质下降的主要原因 ，劣化的程度取决于促使淀粉 降解的-淀粉酶活性4。陶龙兴研究水稻穗发芽生理特性发现，-淀粉酶活性高于 -淀粉酶活性2，且证实-淀粉酶也具有降解淀粉的功能12。但廖宇静等研究发现， 种子萌动前期-淀粉酶活性的增长速度快于-淀粉酶。抑制穗发芽，应首选抑制-淀 粉酶活性，从而抑制种子萌动13。这也似乎说明了-淀粉酶在种子萌发的过程中也 很重要。由于前人利用浸润的种子和发芽种子测定其-淀粉酶活性，所以不能反映 穗发芽发生的真实情况。 目前的研究结果表明在小麦籽粒形成过程中伴随着营养物质的积累，-淀粉酶 也随之合成，不过未成熟的籽粒与成熟籽粒中的 -淀粉酶种类和分布位置不同。 Marchylo14等用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 5 个小麦栽培品种未成熟籽粒和成熟籽粒 中 -淀粉酶同工酶，发现至少有 22 种，并将这些同工酶分成 3 组，即 GI 组、GII 组和 GIII 组。GI 组位于 PI 值较低的区域，GII 介与两组之间。GIII 位于 PI 值较高 区域。同时观察到 GI 组主要存在于未成熟籽粒的外果皮、种皮和胚乳，糊粉层中有 少量存在，这组同工酶对淀粉的分解能力弱。GIII 组主要存在于邻近成熟籽粒的胚 乳和发芽的籽粒中，少部分存在于种皮和盾片中，果皮和胚中也有少量存在，这组 4 同工酶对淀粉的分解能力较强，约占籽粒发芽时 -淀粉酶活性的 84。GII 组同工 酶强度很弱，主要存在于胚乳和糊粉层中。 2.2 内源赤霉素（GA）和脱落酸（ABA） 植物内源激素对植物生长发育起重要的调控作用，通过研究内源激素动态变化 可以反映植株发育状况。研究表明，种子内源GA和ABA对种子穗发芽具有重要作用。 种子萌发时，胚中产生的GA诱导糊粉层细胞合成水解酶（主要是淀粉酶） ，以水解 胚乳中的贮存物质，为种子萌发提供能量和底物，这一过程称为糊粉细胞内的GA响 应事件15。GA能够促进胚乳中储藏物代谢，可以解除种子休眠，从而诱导种子萌发， 而ABA的作用正好相反。GA和ABA在种子萌发过程中相互作用。ABA可以直接干 预GA的合成而抑制萌发，如ABA抑制SbGA-20ox基因的表达16。GA可以促进水解 酶的合成，而ABA则起抑制作用。 在小麦籽粒内，具有生物活性的GA主要包括低极性的 GA9、GA15、GA20、GA24；高极性的GA19、GA44和5个C-1-OH的 GA（GA54、GA55、GA60、GA61、GA62），其中GA54的含量最多，平均每粒种子中 约含10ng。小麦的胚和外果皮主要包含高极性的GA，而在胚乳和外层种皮中主要含 低极性的GA（GA15、GA20、GA24等）7。GA是胚乳储藏物代谢的触发因子，种子 的休眠反应是由于胚乳中GA的缺乏。ABA能阻止小麦籽粒胚萌发，并保持胚的正常 发育。休眠和无休眠种子胚中ABA含量差异很小，表明它对休眠的影响是通过胚对 外源ABA的敏感性来反映的17。在GA氧化酶的合成过程中，GA20氧化酶的合成受 一个基因位点调控。从高粱中把编码 GA20氧化酶的cDNA克隆在弱休眠的高粱品 种中表达后，结果发现在种子吸胀后产生了大量的特殊mRNA（SbGA20ox） ；相反 在休眠的颖果中几乎没有这种现象的发生。同时，发现内源的GA的变化水平与 SbGA20ox mRNA的变化一致，表明 GA的产生可能受这个基因不同转录水平的调 控16。Bhatt等对小麦品种抗穗发芽研究认为，籽粒胚对GA不敏感的品种抗穗芽， 对GA敏感的品种易穗芽；并且Neill等人提出-淀粉酶活性的出现可能是由萌发中新 合成的GA所诱导，早萌种子萌发时伴随ABA下降有一个GA峰值出现，随着GA含量 的增加，最终打破种子休眠而过早萌发。ABA可抑制离体种胚体外培养过程中的过 早萌发，促使贮藏蛋白质的积累和胚的发育，也是造成许多种子休眠的原因18。 5 在禾谷类种子中，ABA的主要作用是对萌发进行调节，保持种子胚的发育，抑 制萌发，抑制水解酶（主要是-淀粉酶）的合成；在未成熟种子中启动休眠和导致 成熟种子的休眠；保持成熟种子的休眠19。在一般情况下，ABA在未成熟胚中是大 量存在的，小麦籽粒储藏物积累的过程中，ABA含量最高20。ABA可以影响禾谷类 籽粒糊粉层中酶的转录，在阻碍-淀粉酶积累的同时抑制GA控制的相关转录。萌发 后的大麦种子在水分胁迫下，胚乳中的ABA含量也会升高，并且诱导了-淀粉酶抑 制因子产生21 。ABA在诱导休眠和保持休眠上起着重要的作用，是种子发育和休 眠的一个潜在的调节因子22。虽然外源ABA不能对与小麦胚发育相关的某些基因正 常的时空表达进行调节，但是外源的ABA能明显抑制几个与萌发后储藏物降解有关 的酶，如 -淀粉酶、麦芽糖酶、异柠檬酸裂解酶和核糖核酸酶的活性22。内源ABA的水平与 萌发能力呈负相关，成熟时ABA含量与休眠性的强弱一致23。Neill和Fong等对玉米 早萌突变品种籽粒内ABA合成进行了研究，发现发生早萌玉米种子内ABA含量下降 的原因是作为ABA生物合成途径的前体类胡萝卜素的合成途径早期步骤受到 抑制。由于类胡萝卜素的合成受到抑制，抑制了种子中ABA的合成，从而导致种子 早萌18。据报道，方军等对水稻穗上发芽突变体研究发现，突变基因均与类胡萝卜 合成途径相关，而类胡萝卜正好是ABA合成前体；并且证明了ABA在穗上发芽中具 有重要作用。在种子发育过程中GA/ABA含量比变化是造成水稻穗发芽一个重要的 生理原因。陶龙兴等研究发现容易穗发芽的水稻品种伴随着穗发芽的发生而GA含量 升高，反之亦然。而ABA的含量变化正好与GA相反2。 杂交水稻制种产量的大幅度提高离不开赤霉素的广泛使用，正常情况下每亩使 用赤霉素16g左右，由于赤霉素的大剂量使用导致种子的休眠被打破或解除，为种子 发芽创造了条件，一旦温湿度适宜，种子立即穗发芽，这是杂交水稻制种容易产生 穗发芽的一个重要原因24。朱旭东研究表明在多数情况下外源GA具有促进穗发芽的 作用25。 2.3 穗部及籽粒特征与穗发芽 穗部结构及籽粒特性与穗发芽的发生及发生程度存在一定的关系。在小麦等禾谷 类作物中，穗粒的大小、密度、弯曲程度、蜡质状态、绒毛和芒的有无、颖壳的坚韧 6 度、形状、包裹籽粒紧实度对穗发芽的发生均有不同程度的影响26。穗大、着粒密度 小、弯曲程度低、穗枝梗和小梗较挺拔、有蜡质、无绒毛和无芒、颖壳坚韧、包裹紧 密的小麦品种穗上发芽率低；反之，穗上发芽率偏高。芒与颖壳的内含抑制物对穗上 发芽也有一定的作用27,28。谷壳对米粒的发育起模型作用，对糙米有机械保护作用， 其所含的发芽抑制物(比如脱落酸和过氧化物酶等)还决定着种子的休眠29。杂交水稻 种子普遍存在裂颖现象，在成熟期易发生穗上发芽30。种皮色泽与穗上发芽关系比较 密切，一般来说，白粒小麦较红粒小麦容易穗发芽，种皮颜色与穗上发芽抗性呈正相 关，粒色越深，抗性越强。种皮色素是小麦种子发育后期沉积在表皮组织，其实质是 类黄酮多聚物。研究表明小麦成熟籽粒种皮中存在水溶性发芽抑制物质，这类抑制物 质主要是儿茶素和单宁类物质，是种皮色素合成的前体物质31，这类物质在红粒小麦 中的含量是白粒小麦中的2倍32。小麦色素合成是由位于小麦第3同源群长臂上的粒色 R基因控制，具有粒色R基因一般休眠性强，不易穗上发芽。但有研究认为小麦种皮 色级与穗发芽率之间相关性不显著。花后30d40d籽粒含水量与穗发芽率相关性不显 著，但是籽粒的吸水速率与穗发芽率呈极显著正相关4,33。 2.4 环境因素 影响穗发芽的环境因素主要是光照、温度、湿度等。光周期可以调节籽粒发育 期间种皮的厚度，导致种子中的激素水平含量变化从而影响种子休眠。温度与湿度 是引发水稻穗发芽的主导环境因子。一般籼稻在12以上，粳稻在10以上就能引 起发芽，最适温度在25-30范围内成熟水稻种子休眠程度逐渐降低，甚至没有休 眠。南方稻区杂交种子成熟后期温度一般在30左右，多为阴雨天气，种子极易穗 发芽。水稻种子如果较长时间处于40以上高温，种子发芽能力也会降低。低温一 般使籽粒的休眠程度加深而不利于发芽。潮湿气候环境使田间收获前水稻籽粒休眠 期明显缩短；相反，干燥天气则能够适当延长水稻种子休眠期。因此，种子的贮藏 对含水量都有一定的要求。 3 作物穗发芽化学调控 植物生长调节剂在农业上的应用源于20世纪30年代，该技术通过影响植物内源 7 激素系统而调节作物的生长发育过程，使其朝着人们预期的方向和程度发生变化。 近年来植物生长调节剂在水稻、小麦、玉米等粮食作物提高产量和改善品质等方面 发挥了重要作用。利用植物生长调节剂控制穗发芽一直是相关研究者孜孜以求的目 标，这类物质主要包括脱落酸（ABA）、穗萌抑制剂、穗芽克和多效唑等。 3.1 外源 ABA 随着穗发芽生理机制研究的不断深入，利用外源ABA控制穗发芽技术越来越被 人们所认识。ABA作为一种生长抑制剂，具有促进种子休眠，抑制种子萌发的作用。 王熹等利用外源ABA对水稻杂交种子穗发芽抑制效应进行了研究。结果表明，外源 ABA对杂交种子、不育系繁种种子以及常规稻种子均有抑制穗芽的作用。齐穗后 21d28d施用ABA为宜，有效浓度为75mg/L。此外，杂交水稻制种田为破除不育系 包颈使用外源GA，抽穗期间雨日多寡等均影响外源ABA抑制穗芽的效果。外源 ABA处理过的种子经贮藏，未发现其种子活力下降34。雍太文等利用外源ABA对水 稻不育系冈46A在不同喷施时期进行不同浓度的处理，结果表明，在各个喷施时期 喷施ABA均能显著降低冈46A的穗芽率，并且喷期不同要求ABA的有效浓度也不相 同，早喷(授粉末期)要求ABA浓度较高(90 mg/L)，迟喷(灌浆中期或乳熟末期)要求 ABA浓度较低(50mg/L)。此外喷施ABA，结实率与千粒重均有不同程度的增加。处 理后的种子经贮藏，未见种子活力下降。在杂交水稻繁殖制种中种子的灌浆中期喷 施50 mg/L的ABA是防治穗发芽的有效方法35。刘晓冰等对春小麦穗发芽抑制效应 研究发现，在开花期对春小麦进行喷洒ABA，浓度为10mg/L、50mg/L、100mg/L均 能有效控制穗发芽，且以50mg/L最佳。外源ABA能有效防止穗发芽，并且ABA系植 物内源激素，不会污染环境，但高浓度ABA对作物种子结实率是否具有负面影响有 待进一步研究36。 3.2 穗萌抑制剂和穗芽克 穗萌抑制剂有效成份含30%的青鲜素和60%的延滞性有机酸。生产成本低，每 亩药剂成本相当于0.5kg种子价格，一般穗发芽率减少75以上。蒋士宋研究喷施穗 萌抑制剂对提高种子质量、产量具有重要作用。生产上，一般在水稻乳熟末期和黄 熟初期各喷施1次，浓度10mg/L，抑制效果较佳。小麦在开花后20d-25d，喷洒1次， 8 浓度为10mg/L，在此浓度范围内浓度越高效果越好37。穗萌抑制剂在生产应用过程 中也有一些不足，比如由穗萌抑制剂导致的种子的休眠加深，其有效成分青鲜素有 致癌致畸的嫌疑，阻碍了在生产上的推广。 淡惠娟等对穗芽克防控杂交稻制种中杂交种子穗发芽效果进行了研究。穗芽克 溶液每升含香豆酸（CA）1000 mg和多效唑（PP333）30mg，是一种81.5的可湿性 粉剂，正确使用可抑制杂交稻“穗芽穗率”60% 80% ，抑制“穗芽粒率”40%60%， 且不影响种子活力。此外，“穗芽克”还能增加种子千粒重0.20.4g38。 3.3 多效唑和植物提取物 胡晋39、崔志顺40、韩云民41、张建奎42和林海柱43等人通过多效唑控制穗发 芽试验表明，多效唑不仅能有效抑制穗发芽，而且在一定程度上能提高结实率和产 量，并且抑制效应比较容易在贮藏过程中消除，不会影响下一年播种质量。喷施的 时期一般在穗后10d(小麦)15d(水稻)进行叶面喷施12次，喷施量300750g/hm2, 抑 制效果可达70%，并在此用量范围内随着浓度的增加，抑制效果明显提高。由于多 效唑使用效果好，在一定时期内得到了广泛推广，但随着应用技术的推广，也发现 了一些不足，表现在使用量太大，成本较高，作用缓慢持续，不能根据天气变化灵 活采取措施。 另据付金锋44、薛香45等研究报道利用植物提取物对小麦穗发芽防治效果进行 了研究，天然物质避免了化学物质的负面影响，但在生产上未见大面积推广。总之, 目前包括上述的几种植物生长调节剂防治穗发芽效果好的报道和效果差的报道都有， 在生产上的应用不够广泛和深入，可能有2个原因:(1)施用方法不当。(2)某些复合型 植物生长调节剂的有效成分在施用后的不良后效问题，如青鲜素等。 4 4 作物穗发芽抗性的遗传机制作物穗发芽抗性的遗传机制 作物穗发芽抗性涉及的因素很多，由于不同研究者在分析穗发芽抗性遗传时所 选材料的不同，其遗传方式表现为多种多样。 兰秀锦等认为穗发芽抗性主效基因为隐性表达46。Lawson等研究认为穗发芽抗 性表现为简单遗传，抗性由2对独立基因控制47。Roy J K 认为穗发芽抗性是由2对 9 互补的基因控制48。 Silvin Zanetti 用176个RFLP探针和10个小麦的微卫星标记，以-淀粉酶和降落 值为衡量穗发芽的指标，研究结果表明分别有12和13个与穗发芽有关的QTL位点49。 兰海等利用普通玉米自交系R08与A318组配的F2群体共331个单株，采用复合区间作 图法对F2-3家系种子休眠性数据进行分析，共检测到7个QTL位点50。James A Anderson用195个RFLP探针对NY6432-18/ClarkCream和NY6432-18 /NY6432-10两 个小麦组合进行筛选，找到8个与穗发芽关联的基因组区域 51。这些研究结果说明 禾谷类作物穗发芽抗性受染色体上多个位点的影响。 杂交水稻种子穗发芽遗传效应受种子直接显性和母体加性效应的影响，且以种 子直接效应为主，不受细胞质和母体显性效应的影响。在育种中田间穗上发芽率以 单粒选为宜，而穗萌指数同时受种子直接遗传效应、母体效应和细胞质效应的影响 52。赵明等利用强休眠水稻品种和弱休眠品种对籼稻收获时休眠性遗传特点进行了 研究。结果表明，大多数组合后代收获时休眠性分布呈严重的偏斜分布，休眠性偏 向于弱休眠(易穗发芽)材料，且呈连续性单峰分布，即收获时休眠性基本属于多基 因控制的数量性状。在大多数组合中，强休眠表现为隐性，对应的弱休眠为显性或 部分显性，因此，在选择的早期世代中，对休眠性的选择标准不宜太高，应随着世 代的增加逐步提高选择压力53。据张海峰 54、陈兆夏 55等报道，抗性不同的亲本 杂交（抗/不抗）F1的穗发芽率与中亲值的差值大多数组合为负值，呈负向中亲优势， 说明正交F1的抗穗发芽性大多偏向抗性亲本。而反交(不抗/抗) F1穗发芽率多数组合 大于中亲值，说明其抗穗发芽性偏向于不抗亲本。由此可见，杂种一代的抗穗发芽 性遗传在大多数情况下具有明显的母体效应，大多数组合中不抗穗发芽性呈部分显 性，少数组合抗穗发芽性呈部分显性，说明穗发芽抗性的显隐性常因组合而不同。 5 5 作物穗发芽抗性的分子生物学研究作物穗发芽抗性的分子生物学研究 5.1 作物穗发芽抗性相关基因研究 McCarty等利用玉米穗萌突变体Viviparous-1为材料，研究发现与休眠相关的一 种转录因子(Viviparous-1，VP-1)，能促进胚成熟，加速胚休眠和抑制萌发的功能 56。此后，根据VP-1序列，从水稻57、小麦58、高粱59等植物中克隆得到了同 10 源基因。测序分析表明，该基因保守性很强。水稻VP-1编码一个长约728个氨基酸 的序列，比玉米VP-1基因编码的氨基酸序列稍长。经功能分析发现水稻 VP-1基 因功能与玉米VP-1基因功能相似 57。Shingo Nakamura等从休眠和无休眠小麦品 种中分离得玉米VP-1同源基因。该基因在休眠和无休眠小麦品种成熟胚中均有表达， 并且表达的水平与种子的休眠性和胚对外源ABA敏感性呈正相关关系58。 Fernando Carrari 等从高粱中分离得到了玉米VP-1的同源基因(SbVP-1)，该基因在花后20d开 始表达，并且在易穗发芽的高粱品种中SbVP-1 mRNA水平高于抗穗发芽的品种。两 者表达时间也不尽相同，前者表达峰值出现在花后 20d，后者表达峰值出现在种 子接近成熟的时候 59。 5.2 作物穗发芽抗性分子标记 培育抗穗发芽的作物品种是控制穗发芽危害最有效的途径。利用分子标记辅助 选择能够有效地加快育种进程。目前，利用分子标记辅助育种已经成为作物育种中 重要的手段，各种分子标记的开发成为近年来国内外作物育种研究的重点领域之一。 Gale等将穗发芽抗性相关的-淀粉酶基因(Amy-1)定位于第6和第7同源群染色体 的长臂上60。后来发现，在灌浆后期，籽粒接近成熟时产生的“迟熟-淀粉酶(LMA )” 为同属于Amy-1基因所控制的高等电点淀粉酶同工酶，也是造成容易穗发芽的重要原 因。Mrva和Mares研究发现与穗发芽有关的LMA受隐性单基因控制61。QTL分析发 现，7BL上有一个主要的QTL位点，3B上有一个次要位点62。Anderson等利用 NY6423-18 /ClarmsCream和NY642318/NY6423-16两个小麦组合的后代进行RFLP标记，结果发 现两个组合分别有6个和4个RFLP标记与穗发芽抗性紧密连锁63。Roy等利用选择性 扩增微卫星多态性位点(Selective Amplification of Microsatellite Polymorphic Loci，SAMPL)技术对55份小麦品种进行标记，在1185条带中有568条带具有多态性， 其中7条与穗发芽抗性连锁64。Roy等利用100个重组近交群体(RIL)进行微卫星标记 和STS (Sequence Tagged Site)标记对穗发芽抗性进行分析，分别发现位于6B (Xwmc104)和7D (XmstIOI)染色体上与穗发芽抗性紧密连锁的标记65。Zanetti 等用 普通小麦(Triticum aestivum)品种Fomo与斯卑尔脱小麦(Tspelta)品种Oberkulmer杂交 11 的226个F5株系进行QTL定位发现，来自Fomo的5AL和来自Oberkulmcr的6A、3B和 7B上的QTL位点与穗发芽抗性紧密连锁66。Mares等QTL分析揭示，3D、2AL、2DL 和4A上存在着与穗发芽抗性紧密连锁的分子标记67。Bailey等研究发现控制小麦胚 胎发育与休眠的taVpl位于第3同源群上，分别距着丝点和皮色基因30cM68。Groos 等利用红粒的Renan与白粒Recital杂交，通过SSR、RFLP和AFLP分析，认为有3个穗 发芽抗性位点正好位于Renan的第三同源群长臂上，与红皮基因R紧密连锁。同时， Recital的5AS上也有一个抗性位点69。Osa等以3A染色体为对象，对控制小麦休眠的 基因进行QTL定位发现皮色基因位于3A长臂的中部，控制休眠的主效基因QPhs.ocs- 3A.1则位于短臂上，另一个次效基因QPhs.ocs-3A.2虽然位于其长臂上，但与皮色基 因相距约50cM70。 杨燕等根据小麦种子休眠相关的转录因子VP-1（AJ400713）在中国小麦品种中 开发出一个STS标记Vp1B3，该标记在抗穗发芽品种中能扩增出845 bp或569 bp两种 片段类型，而在易穗发