DBS13004—2016创伤弧菌检验.doc

DBS13河北省地方标准DBS13/0042016食品安全地方标准创伤弧菌检验（征求意见稿）河北省卫生和计划生育委员会 发布2016-实施2016-发布附件1DBS13/0042016前言本标准附录A为规范性附录。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2016年月日首次发布。3食品安全地方标准创伤弧菌检验1 范围本标准规定了水产品中创伤弧菌（Vibrio vulnificus）的检验方法。本标准适用于水产品中创伤弧菌的检验。2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 1 、39.5 0.5 ；2.2 冰箱：2 5 、7 10 ； 2.3 恒温水浴箱：45 1 ； 2.4 均质器或无菌乳钵；2.5 天平：感量0.1 g； 2.6 无菌试管：18 mm180 mm、15 mm100 mm； 2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头； 2.8 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL、1000 mL； 2.9 无菌培养皿：直径90 mm； 2.10 无菌手术剪、镊子等；2.11 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂3.1 3氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。3.2 改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）琼脂：见附录A中A.2。 3.3 纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂：见附录A中A.3。 3.4 3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.4。 3.5 3氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.5。 3.6 嗜盐性试验培养基：见附录A中A.6。3.7 3氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。 3.8 3氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。 3.9 3氯化钠溶液：见附录A中A.9。 3.10 氧化酶试剂：见附录A中A.10。 3.11 革兰氏染色液：见附录A中A.11。 3.12 邻硝基酚-D-半乳糖苷（ONPG）试剂：见附录A中A.12。 3.13 Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.13。 3.14 生化鉴定试剂盒。4 检验程序创伤弧菌检验程序见图。样品25 g（mL） +225 mL 3% 氯化钠碱性蛋白胨水36 1 ，18 h24 hmCPC或CC平板39 40 ，18 h24 h 挑取可疑菌落，接种于3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂36 1 ，18 h24 h筛选试验氧化酶试验，革兰氏染色，3%氯化钠三糖铁琼脂，嗜盐性试验生化试验或选用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统结果报告图1 创伤弧菌检验程序5 操作步骤5.1 样品制备5.1.1 非冷冻样品采集后应立即置7 10 冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45 以下不超过15 min或在2 5 不超过18 h解冻。5.1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液。甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。5.1.3 以无菌操作取样品25 g（mL），加入3氯化钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋转刀片式均质器以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 min，或拍击式均质器拍击1 min2 min，制备成1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500 mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品12次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。5.2 增菌 将上述1:10样品匀液于36 1 培养18 h24 h。5.3 分离 5.3.1 对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1 cm内沾取一环增菌液，于mCPC或CC平板上划线分离。于39 40 培养18 h24 h。5.3.2 典型的创伤弧菌在mCPC和CC平板上呈圆形、扁平、中心不透明边缘透明的黄色菌落，直径1 mm2 mm。5.4 纯培养 挑取3个或以上可疑菌落，划线接种3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 1 培养18 h24 h。5.5 初步鉴定 5.5.1 氧化酶试验：挑选纯培养的单个菌落进行氧化酶试验，创伤弧菌为氧化酶阳性。 5.5.2 涂片镜检：将可疑菌落涂片，进行革兰氏染色，镜检观察形态。创伤弧菌为革兰氏阴性，呈棒状、弧状、卵圆状等多形态，无芽胞，有鞭毛。 5.5.3 挑取纯培养的单个可疑菌落，转种3%氯化钠三糖铁琼脂斜面并穿刺底层，36 1 培养24 h观察结果。创伤弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色变黄。5.5.4 嗜盐性试验：挑取纯培养的单个可疑菌落，分别接种0%、3%、6%、8%和10%不同氯化钠浓度的胰胨水，36 1 培养24 h，观察液体混浊情况。创伤弧菌在无氯化钠、8氯化钠和10%氯化钠的胰胨水中不生长或微弱生长，在3%、6%氯化钠的胰胨水中生长旺盛。5.6 确证鉴定 取纯培养物分别接种含3%氯化钠的赖氨酸脱羧酶试验培养基、MR-VP培养基，36 1 培养24 h48 h后观察结果；3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。创伤弧菌的生化性状见表1，创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别见表2。6 报告 综合以上生化试验的结果，报告25 g（mL）样品中检出或未检出创伤弧菌。表1 创伤弧菌的生化性状试验项目结果 革兰氏染色镜检阴性，棒状或弧状 氧化酶 动力 D-纤维二糖 蔗糖 葡萄糖 分解葡萄糖产气乳糖 硫化氢 赖氨酸脱羧酶 V-P ONPG 注：表示阳性；表示阴性。表2 创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别名称氧化酶赖氨酸精氨酸鸟氨酸明胶脲酶V-P42生长蔗糖D纤维二糖乳糖阿拉伯糖D甘露糖D甘露醇ONPG10gO/129150gO/129嗜盐性试验NaCl含量（%）036810创伤弧菌V.vulnificus+-+-+-+-+V+SS-+-副溶血性弧菌V.parahaemolyticus+-+V-+-V-+-RS-+-溶藻弧菌V.alginolyticus+-+-+-+-RS-+霍乱弧菌V.cholerae+-+-V+-+SS+-拟态弧菌V.mimicus+-+-+-+SS+-河弧菌V.fluvialis+-+-+-V+-+RS-+V-弗氏弧菌V.furnissii+-+-+-+-+RS-+-梅氏弧菌V.metschnikovii-+-+-+V+-+SS-+V-霍利斯弧菌V.hollisae+-nd-+-ndnd-+-嗜水气单胞菌A.hydrophilia+V+-+-VV+VVV+RR+-类志贺邻单胞菌P.shigelloides+-+-SS+-注：表示阳性；表示阴性；R表示耐药；S表示敏感；nd表示未试验；V表示可变。附录A培养基和试剂A.1 3氯化钠碱性蛋白胨水A.1.1成分蛋白胨10.0 g氯化钠30.0 g蒸馏水1000.0mLpH 8.50.2A.1.2制法将成分(A.1.1)溶于蒸馏水中,调节pH，121 高压灭菌10 min。A.2 改良纤维二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）琼脂A.2.1溶液1A.2.1.1 成分 蛋白胨10.0g牛肉粉 5.0g氯化钠20.0g 溴麝香草酚蓝0.04g甲酚红0.04g琼脂15.0g蒸馏水900.0mL pH7.60.2A.2.1.2制法将成分（A.2.1）溶于蒸馏水中，调节pH，加热煮沸至完全溶解。冷至48 55 备用。A.2.2溶液2A.2.2.1 成分 纤维二糖10.0g 多粘菌素B100000U 多粘菌素E400000U蒸馏水100.0mLA.2.2.2制法纤维二糖溶于蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，过滤除菌。将溶液2与溶液1混合，倾注平板备用。A.3 纤维二糖-多粘菌素E（CC）琼脂A.3.1溶液1 A.3.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g氯化钠20.0g 溴麝香草酚蓝0.04g甲酚红0.04g琼脂15.0g蒸馏水900.0mL pH7.60.2A.3.1.2 制法 将成分（A.3.1）溶于蒸馏水中，调节PH，加热煮沸至完全溶解。冷至48 55 备用。A.3.2溶液2 A.3.2.1成分 纤维二糖10.0g 多粘菌素E400000U蒸馏水100.0mLA.3.2.2制法纤维二糖溶于蒸馏水中，轻微加热至完全溶解，冷却后加入抗菌素，过滤除菌。将溶液2与溶液1混合，倾注平板备用。A.4 3氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂A.4.1成分 胰蛋白胨15.0g 大豆蛋白胨5.0g氯化钠30.0g琼脂15.0g蒸馏水1000.0mL pH7.30.2A.4.2制法 将成分（A.4.1）溶于蒸馏水中，调节pH，121 高压灭菌15 min。 A.5 3氯化钠三糖铁琼脂A.5.1成分蛋白胨15.0g 月示蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g酵母粉3.0g氯化钠30.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g 硫酸亚铁（FeSO4）0.2g酚红0.024g 硫代硫酸钠Na2S2O30.3g琼脂12.0g蒸馏水1000.0mL pH7.40.2A.5.2制法将成分（A.5.1）溶于蒸馏水中，调节pH。分装到适当容量的试管中。121 高压灭菌15 min。制成高层斜面，斜面长4cm5cm，高层深度2cm3cm。A.6 嗜盐性试验培养基A.6.1成分 胰蛋白胨10.0g氯化钠按不同量加入蒸馏水1000.0mL pH7.20.2A.6.2制法 将成分（A.6.1）溶于蒸馏水中，调节pH，共配制5瓶，每瓶100 mL。每瓶分别加入不同量的氯化钠：（1）不加;（2）3g; （3）6g;（4）8g;（5）10g。分装试管，121 高压灭菌15 min。A.7 3氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基A.7.1成分蛋白胨5.0g酵母粉3.0g葡萄糖1.0g 溴甲酚紫0.02g L-赖氨酸5.0g氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mL pH6.80.2A.7.2制法除赖氨酸以外的成分（A.7.1）溶于蒸馏水中，调节pH。再按0.5的比例加入赖氨酸，对照培养基不加赖氨酸。分装小试管，每管0.5 mL，121 高压灭菌15 min。A.7.3试验方法从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36 1 培养不少于24 h，观察结果。赖氨酸脱羧酶阳性者由于产碱中和葡萄糖产酸，故培养基仍应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡糖糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。A.8 3氯化钠MR-VP培养基A.8.1成分 多价蛋白胨7.0g葡萄糖5.0g 磷酸氢二钾（K2HPO4）5.0g氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mL pH6.90.2A.8.2制法将成分（A.8.1）溶于蒸馏水中，调节pH，分装试管，121 高压灭菌15 min。A.9 3氯化钠溶液A.9.1 成分氯化钠30.0g蒸馏水1000.0mL pH7.20.2A.9.2制法将氯化钠溶于蒸馏水中，121 高压灭菌15 min。A.10 氧化酶试剂A.10.1成分N,N,N,N,-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g蒸馏水100.0mLA.10.2制法少量新鲜配制，于2 5 冰箱内避光保存，在7 d之内使用。A.10.3 试验方法 用细玻璃棒或一次性接种针挑取新鲜（24 h）菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10 s之内呈现粉红或紫红色，即为氧化酶试验阳性。不变色为氧化酶试验阴性。A.11 革兰氏染色液A.11.1 结晶紫染色液A.11.1.1成分结晶紫1.0g 95乙醇20.0mL 1草酸铵水溶液80.0mLA.11.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.11.2革兰氏碘液A.11.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300.0mLA.11.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。A.11.3 沙黄复染液A.11.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0mL蒸馏水90.0mLA.11.3.2制法将沙黄溶于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.11.4 染色法A.11.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1 min，水洗。A.11.4.2滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。A.11.4.3滴加95%乙醇脱色，约15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.11.4.4滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。A.12邻硝基酚-D-半乳糖苷（ONPG）试剂A.12.1缓冲液A.12.1.1成分 磷酸二氢钠（NaH2PO4H2O）6.9g 用蒸馏水加至50.0mLA.12.1.2制法将磷酸二氢钠溶于蒸馏水中，调节pH值至7.0 。缓冲液置2 5 冰箱保存。A.12.2 ONPG溶液A.12.2.1成分邻硝基酚-D-半乳糖苷（ONPG）0.08g蒸馏水15.0mL缓冲液5.0mLA.12.2.2制法将ONPG在36 1 的蒸馏水中溶解，加入缓冲液。ONPG溶液置2 5 冰箱保存，试验前，将所需用量的ONPG溶液加热至36 1 。A.12.3 试验方法将待检培养物接种3%氯化钠三糖铁琼脂，36 1 培养18 h。挑取1满环新鲜培养物接种于0.25 mL 3%氯化钠溶液，在通风橱中，滴加1滴甲苯，摇匀后置36 1 水浴5 min。加0.25 mL ONPG 溶液，36 1 培养观察24 h。阳性结果呈黄色。阴性结果则24 h不变色。A.13 Voges-Proskauer(V-P)试剂A.13.1 成分甲液 -萘酚5.0g 无水乙醇100.0mL乙液 氢氧化钾40.0g 用蒸馏水加至100.0mLA.13.2 试验方法将3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂生长物接种3%氯化钠MR-VP培养基，361培养48 h。取1mL培养物，转放到一个试管内，加0.6 mL甲液，摇动。加0.2mL乙液，摇动。加入3 mg肌酸结晶，4 h后观察结果。阳性结果呈现伊红的粉红色。 食品安全地方标准 创伤弧菌检验（DBS13/001-2015）编制说明一、 任务来源与编号、参与协作单位、简要起草过程、主要起草人及其所承担的工作等1. 任务来源本标准对食品安全地方标准 创伤弧菌检验进行制定。该项目为河北省卫计委项目，受河北省卫计委地方标准专业委员会委托。项目编号：DBS13/001-2015。2. 承担及参加单位本标准负责起草单位：河北省疾病预防控制中心。本标准主要参加单位：秦皇岛市疾病预防控制中心、唐山市疾病预防控制中心。3. 主要起草人：申志新、关文英、侯凤伶、韩艳青、张淑红、刘兰吉、时晨、王建红、卢俊荣。4. 标准制定的主要过程：（1）收集国内外标准与文献：标准起草负责人组织起草人员收集国内外创伤弧菌检测方法和相关文献共30余篇。（2）召开河北省食品安全地方标准专家论证会：省卫计委于2015年6月23-26日，组织部分省内食品安全专家委员会委员对本项目建议书进行了论证和研讨。与会专家认为本项目建议书思路清晰严谨，科学合理，计划周密，经费预算合理，具有可操作性，并按专家意见对方案进行了修改，经审查合格，同意立项实施。（3）制定检测方法：在参阅国内外标准和文献基础上，确定方法制定原则、主要检测过程和方法验证，草拟实施方案。（4）实验条件的选择和优化：A、增菌液的选择和优化：选择FDA BAM: Vibrio May 2004 “ Bacteriological Analytical Manual Chapter 9 Vibrio 和2007-ISO TS 21872-2-2007 第2部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测两项国际标准和GB4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验和公开发表文献中使用的APW、PNC、PNCC三种增菌液，进行8h、18h、24h增菌效果比对试验，结果表明APW、PNC、PNCC三种增菌液增菌效果无统计学显著差异，增菌时间8h、18h、24h两两比较无显著差异。因此，本标准选择既经济又普遍使用的3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）作为增菌液，增菌时间在18h24h。B、分离培养基的选择和优化：选择FDA BAM: Vibrio May 2004 “ Bacteriological Analytical Manual Chapter 9 Vibrio 和2007-ISO TS 21872-2-2007 第2部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测两项国际标准和GB4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验及公开发表文献中使用的CC、 m CPC 、弧菌显色、 CPC+、 TCBS五种分离培养基进行试验，结果表明，五种培养基对创伤弧菌的选择效率从高到低为CC m CPC 弧菌显色 CPC+ TCBS。因此，本标准采用CC和m CPC作为分离培养基。（5）样品检测：2015年6月-9月，省疾控中心和秦皇岛市疾控中心、唐山市和沧州市疾控中心工作人员对北戴河区及沧州市市售海产品进行了创伤弧菌检测，共采集鱼类、甲壳类和贝类202份，检出11株创伤弧菌，检出率为5.45%，为我省首次检出。6）标准验证：根据项目制定方案，沧州市疾控中心和邯郸市疾控中心对本方法进行了验证试验，并出具正式的验证报告。(7)起草标准文本：参照国际标准、国家标准和实验室验证试验情况撰写食品安全地方标准 创伤弧菌检验标准文本的征求意见稿和标准编制说明等材料。(8)召开研讨会: 2015年10月27日-28日在北戴河河北省气功疗养院召开了河北省地方标准专家论证会，会上邀请了省卫计委综合监督执法局、河北农业大学、河北科技大学、衡水学院生命科学学院、国家葡萄、葡萄酒质量监督检验中心和5个市级疾控中心的15位专家，对本标准进行了全面审核,对需要进一步修改、确认和完善之处提出了建议。（9）提交食品安全地方标准 创伤弧菌检验（送审稿）及编制说明、征求意见汇总表供标委会审议。（10）专家审核：省卫计委组织我省食品安全委员会有关专家对标准征求意见稿进行审核，提出修改意见，标准起草人修改后形成标准报审稿。公开向社会征求意见。（11）标准报批：标准起草人对修改意见进行整理，进一步完善标准，形成标准报批稿。报省卫计委批准、发布、实施。二、 本标准立项背景创伤弧菌（Vibrio vulnificus），也称海洋弧菌，属于弧菌属，是一种革兰氏阴性嗜盐菌，栖息于河口和海洋环境中。能够引起胃肠炎、伤口感染和原发性败血症，发病急，病情发展很快，创伤弧菌为全球重要的海洋致病细菌，与霍乱弧菌、副溶血弧菌并列为造成人类感染疾病的三大弧菌。人类感染创伤弧菌主要是食用生的或半生的受到污染的海产品，或者是伤口接触了带菌的海水或海产品。在美国，创伤弧菌是海产品消费中引起死亡的首要病因，日本每年创伤弧菌败血症病例数约为425例。我国沿海地区也时有创伤弧菌散发病例的报告。WTO检验检疫信息网报道，由于在进口检验中，从泰国产速冻馄饨和饺子中检测出创伤弧菌污染，韩国食品药品管理局（KFDA）于2010年5月13日对泰国含虾馄饨实施禁令并拒绝入境。人食用被上述病原体污染的海鲜产品（如牡蛎、蛤和螃蟹等）后，或开放伤口接触此物污染的海水后，会受到感染。如果是经食物感染的，健康的成年人会犯肠胃炎，而身体虚弱者则可能导致原发性败血症或死亡。我国于2012年将创伤弧菌列入国家食品安全风险监测计划中，对水产品中创伤弧菌进行全国范围的风险监测。目前，我国没有创伤弧菌标准检验方法，给我省开展创伤弧菌风险监测造成方法不统一、监测质量没有保障、监测结果不能比对等诸多困难。因此，制定我省创伤弧菌标准检验方法具有重要的现实意义和社会效益。三、 国内和国际标准情况1、目前没有国家强制性创伤弧菌检测标准方法。2、我国现行2个行业推荐标准：SN/T 1870 食品中致病菌检测方法-实时PCR法。出口食品中致病菌环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第13部分：创伤弧菌（SN/T 2754.13-2011）。上述2个方法均属分子生物学初筛方法，无法获得创伤弧菌菌株。 本标准拟采用创伤弧菌检验经典方法-培养法，与上述方法没有关系。3、本标准参照FDA BAM: Vibrio May 2004 “Bacteriological Analytical Manual Chapter 9 Vibrio ”、“2007-ISO TS 21872-2-2007 第2部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测”和国内外杂志公开报道的创伤弧菌检验方法的文献制定。四、 标准的主要内容及制定情况1. 样品制备参照GB4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验5.1样品制备。1.1 非冷冻样品采集后应立即置7 10 冰箱保存，尽可能及早检验；冷冻样品应在45 以下不超过15 min或在2 5 不超过18 h解冻。1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液。甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃。如为带壳贝类或甲壳类，则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。1.3 以无菌操作取样品25 g（mL），加入3氯化钠碱性蛋白胨水225 mL，用旋转刀片式均质器以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 min，或拍击式均质器拍击1 min2 min，制备成1:10的样品匀液。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵，自225 mL 3氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500 mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品12次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，制备1:10的样品匀液。2. 增菌增菌液的选择和优化：选择FDA BAM: Vibrio May 2004 “ Bacteriological Analytical Manual Chapter 9 Vibrio 和2007-ISO TS 21872-2-2007 第2部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测两项国际标准和GB4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验和公开发表文献中使用的APW、PNC、PNCC三种增菌液，比较8h、18h、24h增菌效果，经试验APW、PNC、PNCC三种增菌液增菌效果无统计学意义，增菌时间8h、18h、24h两两比较无差异，因此选择既经济又普遍使用的3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）作为增菌液，增菌时间在18h24h。3. 分离分离培养基的选择和优化：FDA BAM: Vibrio May 2004 “ Bacteriological Analytical Manual Chapter 9 Vibrio 和2007-ISO TS 21872-2-2007 第2部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测两项国际标准和GB4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验及文献中使用的CC、 m CPC 、弧菌显色、 CPC+、 TCBS五种分离培养基，经试验，五种培养基对创伤弧菌的选择效率从高到低为CC m CPC 弧菌显色 CPC+ TCBS，本标准采用CC和m CPC作为分离培养基。4. 鉴定方法初步鉴定和确证鉴定所选择的生化性状和创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别（表1 创伤弧菌的生化性状、表2 创伤弧菌主要性状与其他弧菌的鉴别）分别参照了FDA BAM: Vibrio May 2004 Bacteriological Analytical Manual Chapter 9 Vibrio 、2007-ISO TS 21872-2-2007 第2部分除副溶血弧菌和霍乱弧菌以外菌种的检测。5. 商品化鉴定系统的应用本标准应用了全自动微生物生化鉴定系统和生化鉴定试剂盒。这些方法都比较成熟，稳定性较好，已被许多国家和组织的标准采用，鉴定效果很好。6. 结果与报告 参照GB4789.7-2013食品安全国家标准 食品微生物检验 副溶血性弧菌检验定性检测报告。五、 主要进行的实验室验证试验1、三种增菌液不同增菌时间分离效果比较（1）试验菌悬液的制备：创伤弧菌ATCC27562来自中国菌种保藏管理中心 、创伤弧菌CS3-83m、创伤弧菌CS1-85m、创伤弧菌10QH027-VV01、创伤弧菌10QH030-VV02和创伤弧菌CS1-16m来自本实验室保存菌株。将创伤弧菌ATCC27562、5株分离株分别接种于3%氯化钠TSA，于( 36 1) 培养24h 后，挑取菌落悬浮于3%无菌盐水中，制备0.5个麦氏单位，10倍稀释成系列菌悬液，并分别计数，得出实际接种菌量，选择含活菌数约为100 CFU /ml 200 CFU /ml的稀释度用于不同增菌时间的测试。（2）吸取1ml菌悬液分别接种于10mlAPW、PNC、PNCC增菌液中。于接种后8h、18h、24 h分别吸取0.1ml三种增菌培养物做10倍递增稀释后，取适当稀释度做平板菌落计数，比较菌株在三种增菌液中的增菌效果。（3）菌落计数方法：取1mL10倍递增稀释后增菌液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿，及时倾注20 mL冷却至46的3%氯化钠TSA，混匀，凝固后翻转平板37培养24h。（4）结果：表1 创伤弧菌标准株及分离菌株在三种增菌液中生长状况菌 株实际接种菌量（CFU/mL）APW增菌液中活菌数（CFU/mL）PNC增菌液中活菌数（CFU/mL）PNCC增菌液中活菌数（CFU/mL）8h18h24h8h18h24h8h18h24h标准菌株(ATCC27562)1.61028.21052.41072.61073.21054.01099.01081.61051.310101.8109分离株（CS3-83m）1.41025.81062.41082.61081.41081.61088.21074.41071.51086.6107分离株（CS1-85m）1.31021.71086.91072.81081.51082.61089.61071.91083.61081.3108分离株（10QH027-VV01）1.41021.81062.31081.61089.61058.11085.71081.71061.21097.5108分离株（10QH030-VV02）1.41022.21046.91061.71085.11045.71087.81085.11033.31071.2109分离株（CS1-16m）1.21023.01084.61082.21081.71098.41075.01071.91098.41076.6107(5)使用统计软件spssV19.0分析结果如下：Leixing：1= APW增菌液中活菌数2= PNC增菌液中活菌数3= PNCC增菌液中活菌数t1=8ht2=18ht3=24hMauchlys Test of SphericityWithin Subjects EffectMauchlys WApprox. Chi-SquaredfSig.EpsilonaGreenhouse-GeisserHuynh-FeldtLower-boundfactor1.15825.8452.000.543.630.500上表是球形假设检验的结果，这是重复测量方差分析重要结果之一。球形检验的无效假设HO=各重复测量数据之间不存在相关性；H1=各重复测量数据之间存在相关性。此处检验水准为保守起见一般设为0.1。本例中计算P=0.0000.1，拒绝HO，接受H1，则认为重复测量数据之间存在相关性。满足重复测量方差分析的条件。Tests of Within-Subjects EffectsSourceType III Sum of SquaresdfMean SquareFSig.factor1Sphericity Assumed9.364E1824.682E181.442.252Greenhouse-Geisser9.364E181.0868.625E181.442.250Huynh-Feldt9.364E181.2617.427E181.442.252Lower-bound9.364E181.0009.364E181.442.248factor1 * leixingSphericity Assumed7.808E1841.952E18.601.665Greenhouse-Geisser7.808E182.1713.596E18.601.573Huynh-Feldt7.808E182.5213.096E18.601.595Lower-bound7.808E182.0003.904E18.601.561Error(factor1)Sphericity Assumed9.739E19303.246E18Greenhouse-Geisser9.739E1916.2855.980E18Huynh-Feldt9.739E1918.9115.150E18Lower-bound9.739E1915.0006.493E18上表即是重复测量方差分析的最主要结果之一，第一行Sphericity Assumed是非矫正的结果，下面三行Greenhouse-Geisser、Huynh-Feldt、Lower-bound给出的是矫正法的结果，F=1.442，P=0.252，说明同种增菌液在不同时间点观察的创伤弧菌活菌数的不存在统计学差异。Tests of Between-Subjects EffectsSourceType III Sum of SquaresdfMean SquareFSig.Intercept2.117E1912.117E195.604.032leixing9.571E1824.786E181.267.310Error5.666E19153.777E18该表即三种创伤弧菌增菌液比较的方差分析结果，F=1.267，P=0.3100.05，说明三组之间差异不明显，无统计学意义。表2 创伤弧菌标准株及分离菌株在三种增菌液中不同时间生长状况比较增菌液APW增菌液PNC增菌液PNCC增菌液8h8h18h8h8h18h8h8h18h18h24h24h18h24h24h18h24h24hp0.1590.1550.90.4290.8410.3170.3830.5720.385(6)实验结果表明，APW、PNC、PNCC三种增菌液增菌效果无差异，增菌时间8h、18h、24h两两比较无差异，因此选择既经济又普遍使用的3%氯化钠碱性蛋白胨水（APW）作为增菌液，增菌时间在18h24h。2、五种分离培养基试验菌株的生长性能测试（1）试验菌悬液的制备：将创伤弧菌ATCC27562、5株分离株分别接种于N TSA，于( 36 1) 培养24h 后，挑取菌苔悬浮于无菌生理盐水中，制备0.5个麦氏单位(109)， 10倍稀释成不同剂量的系列菌悬液，取10-310-6四个稀释度，用于生长性能测试。(2)试验菌悬液的接种各取上述菌悬液01 ml分别涂布接种至mCPC、CC、CPC+、TCBS 、弧菌显色和N TSA平板上。CPC+、mCPC、CC 平板于39.5 0.5 培养18 h 24 h。TCBS、N TSA 平板于( 36 1) 培养18 h 24 h 后进行菌落计数。计数N TSA菌数约为10 2 CFU 103 CFU /ml的菌悬液的各平板数。 (3)结果：表3 五种分离培养基生长性能测试结果菌株编号分离阳性数稀释度mCPC（39.5）CC（39.5）CPC+（39.5）TCBS弧菌显色盐TSAATCC275621062278120009201051408700016010423000581030300030CS3-83m106360440240103400633105200982417102140104231601138103020101CS1-85m10690090037817851012001057330018124126148104304531201710301100010QH027-VV01106451045001104105118000200104010001110300000110QH030-VV0210630142006128001050240035192104010006103000001CS1-16m10617924181030025201056146147911040500117103000005（4）数据分析方法: 采用SPSS V19 0 软件对不同稀释度的6株创伤弧菌在五种培养基上生长的阳性数进行统计，稀释度为10-3的菌液，6株创伤弧菌在mCPC和CC培养基均检出，在CPC+和弧菌显色培养基上检出4株，在TCBS培养基上检2株。随着稀释浓度越来越低，创伤弧菌在各个培养基上的阳性检出均有下降，稀释度为10-6的菌液，创伤弧菌在CC上检出3株，CPC+和TCBS上检出1株，在mCPC和弧菌显色培养基上未检出。见表4：表4 不同稀释度的创伤弧菌在五种培养基上生长的阳性数实际接种菌量（CFU/mL）检测样品（份）mCPCCCCPC+TCBS弧菌显色106666424105656334104636123103603110总计2414188711对表4的数据进行整理后，计算其阳性率得出表5，创伤弧菌在CC培养基上阳性检出率是75%，在TCBS培养基上检出率只有29.2%。综合表1和表2数据得出创伤弧菌在CC培养基上生长最佳，其次是mCPC，在TCBS培养基上生长最差。表5 创伤弧菌在五种培养基上检出的阳性率培养基阳性阴性阳性率CC18675.0%mCPC141058.3%弧菌显色111345.8%CPC+81633.3%TCBS71729.2% 对表5的五种培养基运用统计学软件（spss19.0）进行两两比较结果见表6。表6 创伤弧菌阳性检出数的P值比较两两比较mCPCmCPCmCPCmCPCCCCCCCCPC+CPC+TCBSCCCPC+TCBS弧菌显色CPC+TCBS弧菌显色TCBS弧菌显色弧菌显色2值1.53.0214.1480.7518.39210.1014.2690.0970.7841.422P值0.2210.0820.042*0.3860.004*0.001*0.039*0.7550.3760.233注：*表示有明显差异。（5）试验菌株在CC上的阳性检出率明显高于CPC+、TCBS、弧菌显色，经统计学分析差异有显著性（P0.05），试验菌株在mCPC上的阳性检出率也大于TCBS，有统计学意义（P m CPC 弧菌显色 CPC+ TCBS。六、 征求意见和采纳意见情况：2015年10月27日-28日在北戴河河北省气功疗养院召开了河北省地方标准专家论证会，会上邀请了省卫计委综合监督执法局、河北农业大学、河北科技大学、衡水学院生命科学学院、国家葡萄、葡萄酒质量监督检验中心和5个市级疾控中心的15位专家，提出意见10条，其中采纳和部分采纳的意见9条。根据大多数专家的意见，形成了征