[理学]第4章糖蛋白.ppt

第四章 糖蛋白与蛋白聚糖 Glycosylation an important post-translational modification of proteins 糖基化是蛋白翻译后一个重要的修饰过程 Glycoprotein Roles 糖蛋白作用 Glycoprotein examples cell surface receptors for many circulating proteins 细胞膜受体 cell membrane-associated structural proteins: blood group antigens, tumor- associated antigens与细胞膜相关的结构蛋白：血型抗原，肿瘤相关抗原 extracellular proteins: antibodies, serum albumins, polypeptide hormones, salivary Proteins 细胞外蛋白：抗体，血清白蛋白，多肽激素，唾液蛋白等 enzymes: RNases, DNases, lipases, cholinesterase, phosphatases 蛋白酶： Purposes of glycosylation basic structural and functional stability for extracellular proteins in physically and chemically harsh environments 在恶劣的生理和化学环境下保持胞外蛋白的基本结构和功能 potently hydrophilic molecules such as carbohydrates would Serve to produce a stable hydration sphere, resist dehydration Glycosylation extends functional half-life: protects proteins against premature protease degradation 延长蛋白的寿命 essential in cell-to-cell recognition in tissue formation and in cellular movements for organismal development and defense 建立细胞与细胞间的识别标志 n n n n Mannosidase n n n GlcNAcTI mature glycoproteins mannosidase GlcNAc-Transferase I KO in Mouse is Embryonically Lethal 生物信息学 糖生物学和糖化学 功能性RNA分子研究 分子进化的基本化学规律 重要生命现象的蛋白组学 生物芯片系统研究 生物发育的基因表达调控 脑发育, 感知系统研究 一 糖类物质不仅是生物体的能源和结构材料, 还是重要的生物信息分子。 （一）结构材料： 纤维素： 甲壳质甲壳质: : 乙酰氨基葡萄糖乙酰氨基葡萄糖: : （二）糖参与了生命的全过程 授精、发生、发育、分化 神经系统,免疫系统的性质维持 疾病的发生和发展(炎症、自身免疫疾病、 老化、癌细胞异常增值及转移、病原体感染、 植物与病原菌相互作用等) (三) 糖链是重要的生物信息分子 细胞表面密布糖链 红血球:50万个载糖蛋白A/个 红细胞膜血型糖蛋白含糖60% 白血球:50万个白唾液酸蛋白/个 酵母细胞壁结构：酵母细胞壁结构： 生物膜表面的糖链：生物膜表面的糖链： 糖与蛋白质结合成糖蛋白：糖与蛋白质结合成糖蛋白： NN糖苷键糖苷键 ： OO糖苷键糖苷键 ： 糖链储存的信息量远大于核酸与蛋白质 4种NMP 可能的序列24种 4种己糖 可能的序列36864种 糖类是高密度的信息载体：糖类是高密度的信息载体： 1 1 糖苷键类型：糖苷键类型： 2 2 糖的种类：糖的种类： 二肽：二肽：GlyGlyLysLys Lys LysGlyGly 二糖：二糖： 二 糖生物学的前沿领域 1.糖基化 糖链对糖蛋白功能的影响 糖基转移酶、糖苷酶基因表达、活性调节、调控糖链的 合成 开发利用糖基化的细胞识别功能 2.细胞粘附分子 对糖綴合物糖链的识别作用 阐明碳链与蛋白质间的识别及介导的生命现象 3.糖在微生物感染中的作用 微生物感染多数是由糖链介导的 阐明病原菌致病机制 为微生物感染疾病的治疗提供依据 三、糖链的生物功能及研究进展 糖链的生物学功能 1 、影响新生肽链的折叠与缔合 去糖基化的1-抗胰蛋白酶(1-antitrypsin)不能 折叠成正确的构象.如运铁蛋白受体(transferrin receptor)去糖基化后,则不能形成正常的二聚体, 并因而影响受体的转运和功能 2 、糖链影响糖蛋白的分泌和定性 去N-糖链的免疫球蛋白不能被分泌到胞外而留 在内质网中 3 、糖链参与分子识别与细胞识别 分子识别:生物分子的选择性相互作用 Ig-Ag E-s 激素与受体 要求: 两分子结合部位结构互补 能产生作用力使酶分子结合 细胞识别:细胞表面两分子的识别 受体: 能与来自胞外的生物信息分子专一 结 合并将信息传递给效应器(离子通道 配体:被受体识别并结合的生物活性分子 识别双方： 识别标记：以糖基为识别标记的生 命活动广泛存在 有识别能力：能识别糖基并与糖结合 多数为凝集素 糖链几乎参与了所有识别过程 识别诱导细胞生理和代谢状态改变的扳 机 Asn 血浆老蛋白的清除(唾液酸糖蛋白,免疫球蛋白,蛋白类激素,载体蛋白等) Sia2 3Gal1 4GlcNAc1 2man1 6 Man1 4GlcNAc1 4GlcNAc1 3 Sia2 3Gal1 4GlcNAc1 4 Man1 2 Sia2 3Gal1 4GlcNAc1 唾液酸：唾液酸： 唾液酸酶(Sialidase) sia sia sia Gal 1-4GlcNAc 1- Gal 1-4GlcNAc 1 4 2 Gal 1-4GlcNAc 1 被Gal结合受体识别 糖蛋白-受体复合体 胞吞,肝细胞内化 糖蛋白在溶酶体内降解 Man 1 4、糖链与酶活性 某些溶酶体葡萄糖苷酶去除糖链后丧失活性 5、糖链与激素活性 人EPO含165个氨基酸残基,四天线碳链越多、 体内活性越高N-糖链的核心部分为EPO表现 活性所必须 糖链分支及位置：糖链分支及位置： 平分天线：平分天线： 6 3 ManAsn 偏二天线： 4 2 Man Asn Man 6 3 三天线: 4 2 Man Asn Man 6 3 四天线: Asn Man 6 3 4 2 Man Man 6、糖链与恶性肿瘤 细胞癌变后,细胞表面作为可识别的标记物发生了变化 (1) 天线数增加: 天线数增加是肝癌、胃癌、食道鳞状上皮癌最常见的糖链 变化,天线数往往有正常情况下的二天线转变为三天线或四天 线.有报道显示,三四天线可能与恶性肿瘤的转移潜力有正比关 系 (2) N-乙酰氨基乳糖重复顺序出现或增加 乙酰氨基半乳糖乙酰氨基半乳糖: : (3) 核心岩藻糖增加 研究证明,岩藻糖增加是肝癌糖链最明显的变化,消化 道癌分泌的AFP也有岩藻糖增加的现象 (4) 出现偏二天线 偏二天线只存在于恶性肿瘤中 LL岩藻糖：岩藻糖： 7、糖链与IgG活性 糖链 糖链 (1) FC段糖 链与巨噬细 胞FC受体结 合及补体激 活有关 (2) IgG糖链 改变导致类 风湿性关节 、红斑狼疮 等自身免疫 性疾病 8、糖链与血型 Fuc Gal Gal GNAc GNAc Gal GNAc Gal GalnAc 丝( 苏) Gal GNAc Fuc A型 GalNAc A型 GalNAc O型 B型 Gal B型 Gal Fuc Gal Gal GNAc GNAc Gal GNAc Gal GalnAc 丝(苏 ) Gal GNAc Fuc AB型 GalNAc Gal AB型 GalNAc Gal Fuc Gal Gal GNAc GNAc Gal GNAc Gal GalnAc 丝( 苏) Gal GNAc Fuc O型 A型 GalNAc 或 B型 Gal A型 GalNAc 或 B型 Gal 9、糖链与精卵识别 卵透明带糖蛋白ZP-3中GalNAC介导精卵识别及精卵结合 10、糖链与细胞粘着 细胞粘着 -细胞因相互识别而聚集成群的能力 粘附分子 -识别糖链信息分子的蛋白质 选择素-Selectin是一类依赖Ca2+的细胞表面糖 蛋白可专一识别配体上唾液酸化、岩藻糖基化 的寡糖链 P-选择素 E-选择素 L-选择素 L-选择素 为归巣受体(淋巴细胞倾向与回归淋 巴 结的现象 与炎症,肿瘤转移,血小板聚集,血栓形成有关 SLea NeuNAca 3Gal1 3(L-Fuc1 4)GlcNAc SLex NeuNAca 3Gal1 4(L-Fuc1 4)GlcNAc 酸性四糖是其共同配体 识别与某些疾病的发生： 人类面临的世纪灾难艾滋病，（获得性 免疫缺陷综合症AIDS) 1. 世界艾滋病流行形势严峻。1981年，美国发现首例艾滋病 2000年底，艾滋病感染者5790万，死亡达2080万，每 年用于艾滋病的花费达5000亿美元。 2. 我国艾滋病流行的问题严重。1985年，国内发现首例外来 艾滋病病人，预计至2001年年底，艾滋病感染者超1000万 。每年以30%递增，说明我国艾滋病已进入快速增长期， 艾滋病很可能成为新世纪的国家性灾难。 3.关于艾滋病的研究进展。 艾滋病的治疗 药物的研制针对以下环节： 1. 阻止病毒与细胞表面受体结合 2. 抑制病毒逆转录酶的活性 3. 阻止病毒DNA与细胞DNA整合 4. 抑制病毒DNA与RNA的转录 5. 抑制病毒蛋白的成熟与释放 治疗AIDS设计药物的思路: A抑制逆转录酶NRTIs ZT(齐多夫定) ddi (去羟肌苷) ddc (扎西他滨) 3TC(拉米夫定) 蛋白酶抑制剂 PIs 抑制HIV病毒的成熟.(沙奎那韦,利托那韦,奈飞那韦,安普那 韦) 对甘露糖基专一结合的凝集素影响HIV对人体的侵染 硫酸化多糖干扰gp120对CD4的结合 凝集素的概念与分类 糖类药物有广阔的前景 1 糖类化合物是中药的重要成分 2 糖类药物举例： 黄芪多糖 增强免疫，抗肿瘤等 猴头菌多糖 改善胃功能 银耳多糖 改善免疫功能，生高白细胞 猪苓多糖 增强细胞免疫功能 灵芝多糖 增强免疫功能等 香菇多糖 抗肿瘤药物 胎盘脂多糖 增强免疫功能 肝素 抗凝血、抗血栓 玻璃酸 粘弹性工具、滴眼液 冠心舒 抗凝血，调血脂、抗动脉粥样硬化 抗栓灵 抗血栓 降脂宁 调血脂 低分子肝素 抗凝血、抗血栓 硫酸软骨素 抗动脉粥样硬化等 硫酸软骨素A 降血脂、抗动脉粥样硬 化 壳多糖 人工皮肤 糖链的结构分析 （一）糖链结构分析的一般步骤 1 糖蛋白的分离纯化 2 从糖蛋白释放完整的聚糖 3 聚糖的分离纯化 4 聚糖的纯度鉴定和相对分子质量测定 5 单糖组成的测定 6 完整聚糖链的序列测定 （二）用于糖链结构测定的一些方法 1 化学方法 （1）高碘酸氧化 （2）甲基化分析 （3）寡糖顺序降解 2 仪器测定法 气相色谱、红外光谱、质谱 、气质连机分析、 核磁共振 破壁孢子粉粗多糖G.C.图谱 灵芝子实体粗多糖G.C.图谱 4.1. 概述 n糖类是多羟基醛、多羟基酮以及能水解而生成多羟基 醛或多羟基酮的有机化合物； ncarbohydrate曾译为碳水化合物；saccharide更多 地与前缀组词，如monosacchride(单糖)、 oligosaccharide(寡糖)和polysaccharide(多糖)等 ； nsugar除表示食糖外还用于表述糖类的组成，常有单糖 的含义； nglycan则译为聚糖，是寡糖和多糖的统称，糖类仅仅 被视为主要的能源物质、碳源和结构材料，对糖类的 研究局限于单糖及其代谢，以及淀粉、糖原等少数多 糖。虽然早就发现糖-肽共价复合物，鉴于一些含糖的 酶类去掉糖组分之后活性并无明显改变，因而把糖组 分当作杂质，千方百计加以去除 (1)复合糖的分类： n复合糖(complex carbohydrate)可分聚糖(glycan)和 糖缀合物或糖复合物(glycoconjugate)。其中聚糖包括 同聚糖(homoglycan)和杂聚糖(heteoglycan)； n糖缀合物则包括糖肽复合物(glycopeptede complex)、 糖脂复合物(glycolipid complex)和糖-核酸复合物 (carbohydrate-nucleic acid complex)。 n糖肽复合物可分为肽聚糖(peptideglycan)或胞壁质 (murein)，是细菌细胞壁结构材料；糖蛋白 (glycoprotein)和蛋白聚糖(proteoglycan)。 n糖脂可分为糖鞘脂(glycosphingolipid)、糖基酰基甘油 (glycosylacylglyceride)和脂多糖 (lipopolysaccharide)。 (2)糖蛋白和蛋白聚糖中常见的单糖组分 ： n糖复合物中常见的单糖组分包括4种已糖： D-葡萄糖(D-Glc)、 D-半乳糖(D-Gal)、 D-甘露糖(D-Man)、 L-岩藻糖(L-Fuc)； n两种乙酰化已糖胺： N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、 N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)； n两种糖醛酸： D-葡萄糖醛酸(GlcA)和 L-艾杜糖醛酸(IdoA)； n一种戊糖：D-木糖(D-Xyl)以及甘露糖胺与磷酸烯醇式丙酮酸 缩合产物，它的4、7、9-位羟基和5-氨基发生取代产生一系 列产物，统称唾液酸(Sia)，其中最重要的是N-乙酰-D-神经 氨酸(NeuNAc)等。 (3) 聚糖结构的复杂性： n糖蛋白和蛋白聚糖的聚糖部分尽管由上述为数有限的几种单 糖组成，但每种单糖有吡喃式与呋喃式结构之分，异头碳有 -与-型之分，每个单糖有多个羟基，可能以不同的方式形成 糖苷键和分枝结构。两种不同的氨基酸可形成两种二肽； n3种不同的氨基酸可形成6种三肽；6种不同的氨基酸可产生 176种六肽。而两种相同的已糖可能形成11种二糖；三种相 同的已糖可产生176种三糖； n6种不同的已糖则能形成109种六糖，如带有分枝六糖的数目 可达1012个。如果考虑到糖残基不同部位进一步修饰：磷酸 化、硫酸化、氨基化、乙酰化、糖基内部脱水成内醚等，聚 糖的子数目无疑会更大。聚糖结构的复杂性增加了研究工作 的难度，同时暗示它可以蕴含更多的信息，成为生物信息的 理想载体。 (4) 聚糖结构的性质和功能： 糖缀合物的许多重要的性质和功能与 其糖链特有的结构密切相关，为了便 于表现糖链的结构，我们将采用一套 流行的简化符号系统(图4.1)，标明糖 链单糖之间的连接方式及其修饰状况 。 Symbolizing Glycans Complexity of glycoproteomics such that a standardization / protocol of communication between community of scientists developed Glycans represented as colored shapes to indicate specific monosaccharides legend from /static/gt/gtdb.shtml 半乳糖(Gal) N-乙酰半乳糖胺（GalNAc) 葡萄糖(Glu) N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc) D-葡萄糖醛酸(GlcA) 甘露糖(Man) 岩藻糖(Fuc) 木糖（Xylose） N-乙酰神经氨酸(NeuAc) N-乙酰神经氨糖酸(NeuGc) 图4.1 推 荐的描述 糖链结构 的简化符 号与惯例 以一个复杂型 分枝的双天线 N-聚糖为例。 除L-Fuc和L- IdoA外，其余 糖基均为D-型 ；糖链中的单 糖都是吡喃型( 六元环)的；除 Sia的糖苷链从 C2开始，其余 糖基的糖苷链 均从C1开始。 4.2. 糖蛋白(glycoprotein) n广义的糖蛋白泛指糖肽共价复合物。为了研 究的方便，目前已将肽聚糖和蛋白聚糖划分 出来， n狭义的糖蛋白专指肽链与一个或多个聚糖链 共价结合形成的复合物，其聚糖链通常少于 15个单糖残基（少数聚糖链可能含有200 30个单糖残基），且大多数具有分枝。 定义定义 一种或多种糖以共价键连接到肽链上的蛋 白质。 特点特点 蛋白质含量较多，糖所占比例变动大，表 现为蛋白质的特性。 细胞膜、溶酶体、细胞外液 分布分布 糖蛋白概述 糖蛋白糖链数目糖链平均间距 血清糖蛋白 51 1-酸性糖蛋白460 胎球蛋白6113 人触珠蛋白13209 人2-巨球蛋白31296 牛甲状腺球蛋白19375 人转铁蛋白2776 人IgG2 胰糖蛋白： 124 牛胰RNaseB1270 DNase1 粘蛋白： 羊领下腺粘蛋白8006 猪领下腺粘蛋白5008 胶原： 兔角膜胶原19173 牛皮肤胶原8435 大鼠皮肤胶原4770 兔巩膜胶原31000 表4-1 糖蛋白中糖链数目与间距的变动 4.2.1 糖蛋白的结构 n 糖蛋白结构研究 糖蛋白的结构研究包括蛋白质部分的 结构测定和糖链部分的结构测定。 (1)聚糖链与蛋白质的分离： n从糖蛋白释放完整的N-聚糖可采用专一的肽： N-糖苷酶F水解，也可用肼解裂解。 O-聚糖可用内切-N-乙酰氨基半乳糖苷酶水解，或在0.05 0.1molL1 NaOH1 molL1 NaBH4通过-消 去反应来完成。 n反应中产生的聚糖还原端被NaBH4还原成对碱稳 定的糖醇，以防糖链被碱降解。如用3H标记的硼 氢化钠，可对释放的聚糖还原端进行标记，便于在 分离纯化中跟踪。也可用蛋白酶降解。产物进行分 级分离与纯化，得到不同的糖肽和或聚糖链，即 可用于结构分析。 (2) 聚糖的单糖组分分析： n用糖苷酶或酸碱将上述糖肽水解，把其中的单糖组分转变 成热稳定挥发性衍生物(如糖三甲基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三 氟乙酸酯等)，再用气-液相色谱法(gas-liquid chromatography, GLC)进行鉴定和定量，检测精度可达n mol级。 nGLC与质谱法(mass spectrometry,MS)联用，检测精度可 达10pmol级。如将单糖还原端进行荧光标记，再用 HPLC(high-pressure liquid chromatoqraphy)与荧光测 仪对其进行鉴定和定量，检测精度可达pmolfmol水平。 1980年代HPAEC-PAC (high pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection)用于单糖组分分析，无需制备单糖衍生物，检测 精度可达550 pmol水平。氨基糖可用氨基酸分析仪测定； 唾液酸除用灵敏度较低的比色法测定外，已能利用高灵敏度 GLC-MS对离子化的唾液酸进行测定。 (3) 糖链结构分析 n外切糖苷酶消化 利用特异性极高的外切糖苷酶水解糖链，再用HPLC、HPTLC (high- performance thin-layer chromatography)和 HPCE(high-performance capillary electrophoresis)成套仪器进 行检测，精度达fmolpmol级，可得到糖基连接链位置的信息。 由于可用的高专一性外切糖苷酶种类有限，这种方法的应用有很大 的局限性。 n甲基化分析法利用甲基化等修饰反应制备糖衍生物，经GLC与质谱 仪联用进行检测，精度可达0.110 pmol，可鉴定和定量残基上特 定位点取代以及糖的环式构型。质谱法在糖结构分析中可测定糖环上 键的类型与位置，如采用FAB(fast-atom bombardment)、 LSIMS(liquid secondary ion mass spectrometry)和MS MS(tandem mass spectrometry)，检测精度可达fmolpmol水 平。NMR(nuclear maqnetic resonance)用于糖结构分析可测定 糖基的异头构型和键的位置，精度达10pmoln mol水平，最显著 的优点是无需制备糖衍生物 (4) 糖链序列分析： 早期曾用外切糖苷酶从糖链非还原端依次切 下特定的单糖，同样由于可用的酶种类有限 ，而且进行糖链序列分析的糖苷酶纯度应当 极高，因而限制了这种方法的应用，常用的 糖苷酶见表4.2。1980年代之前，糖链测序 主要用MS和MS-GLC法，需对样品进行甲 基化、乙酰化等预处理。1980年后采用 FAB-MS(电子轰击质)和 ESI(electrospray ionization)-MS，检测 精度达n molp mol水平。 酶来 源专 一 性 Clostridium perfringensFuc1 2Gal -L-岩藻糖苷酶Diplococcu.s pneumoniasGal1 4GlcNAc -半乳糖苷酶Canavalia ensiformisMan1 2/6Man -甘露糖苷酶Diplococcus pneumoniasGlcNAc1 glycan -D-N乙酰氨基葡萄糖苷酶Diplococcus pneumoniasSia2 3/6Gal 神经氨酸酶 Sia2 6GkNAc 内切糖苷酶 内切-D-半乳糖苷酶Bacteroides fragillis-GlcNAc1-3Gal1 3/4GalNAc- Flavobacterium meningoseptium x-Man Man-GlcNAc- GlcNAc1Asn- x-Man D-糖苷酶Diplococcus pneumoniasGal1-3GalNAc1 Ser/Thr 外切糖苷酶 N-糖苷酶F 表4.2 用于聚糖测序的几种糖苷酶 糖-肽连接键的类型 n 糖蛋白中的聚糖链均由其还原端以接枝方式 与肽链特定部位的氨基酸侧链基团相连接， 主要分为以下两大类： (1) N-连接键： (2) O-连接键： 连接方式 N-连接： O-连接： 目 录 糖-肽连接键的类型 （一）N-连接糖蛋白 糖蛋白的糖链与蛋白部分的Asn-X-Ser序列的天 氡酰胺氮以共价键连接称N-连接糖蛋白。 （二）O-连接糖蛋白 糖蛋白糖链与蛋白部分的丝/苏氨酸残基的羟基相 连，称为O-连接糖蛋白。 目 录 （一） N连接糖链的糖基化位点： 携带N寡糖链的天冬酰胺也有一定 的位置特征，它总是出现在多肽链的Asn -XSer或 Asn-XThr序列中。其中的X 可为脯氨酸以外的任意氨基酸。 目 录 典型的N-糖链通常包含一个五糖核心区： Man1 ManGlcNAc GlcNAc Asn Man1 在嗜盐菌细胞表面膜糖蛋白上发现还有： N-乙酰半乳糖胺GalNAc-Asn和Glc-Asn两种新 的N-连接方式。 目 录 N糖链的分类： 目 录 (二)O连接型糖链 采用O连接方式的糖蛋白中，肽链部 分的丝氨酸和苏氨酸含量常可达到氨基酸 总数的50。这种糖蛋白的糖链中不具有 共同的核心序列，常见的核心至少有8种， 因此糖链的结构相互之间差异较大。 目 录 O连接糖链的糖基化位点： O连接糖链的糖基化位点通常存在 于糖蛋白分子表面丝氨酸和苏氨酸比较 集中且周围常有脯氨酸的序列中。 区 别N-聚糖O-GalNAc聚糖 糖-肽键GlcNAc1-N（Asn-x-Ser/Thr）GalNAc1-O（Ser/Thr） 聚糖组成都含Man，GlcNAc,绝大多数不含GalNAc 都含GalNAc,不含Man 糖链分枝全部分枝 不一定分枝 糖-肽键化学裂解肼解稀碱水解 聚糖内侧核心结构都有分枝的五糖Man3GlcNAc2 有多种，除GalNAc外，可 含Gal或/和GlcNAc 表4.3 N-聚糖与O-GalNAc聚糖的主要区别 血清糖蛋白多以N-糖肽键连接，因而N-聚糖 又称为血清型(plasma type)。血清型聚糖均由 一个共同的五糖核心和不同数量的外链组成。核 心五糖结构如下： Man1-4GlcNAc1-4GlcNAc1-Asn Man1 Man1 3 6 图4.2 三种类型的N-聚糖结构示意图 虚线框内为核心五糖。A.高甘露糖型；B.复杂型；C.杂合型 2 2 2 3 3 4 Asn 2 36 4 4 Asn 3/6 36 3 4 4 6 Asn 3/6 4 2 4 2 3/6 4 2 BAC 6 6 4 图4.3 复杂型N-聚糖天线数及其位置 2 63 Asn 2 4 63 Asn 42 6 63 Asn 2 2 6 63 Asn 2 4 2 6 Asn 2 63 4 4 2 C2C2二天线 C2,4C2三天线C2C2,6三天线C2,4C2,6四天线C2,4C2,4,6五天线 图4.4 N-聚糖外链结构示意图 见于1型糖链；兼有2，3和2，6 Sia的外链；1型H抗原；无Fuc1-2者 为Lae抗原；有Fuc1-2者为Lbe抗原；5Lea抗原；见于2型糖链；常见的唾 液酸化三糖外链；2型H抗原；无Fuc1-2者为Lxe抗原；有Fuc1-2者为Lye抗 原；(10)sLxe抗原；(11)仅存在于灵长类以下的哺乳动物；(12)存在于少数糖蛋白 外链中 LN unit SO4 3 6 3 3 3 2 3 4 2 3 3 2 4 4 3 3 3 3 4 3/6 4 2 4 3 4 4 4 1 1 1 2 O-聚糖的结构 nGalNAc-O-Ser/Thr糖肽键最早发现于粘蛋白，因而O- GalNAc聚粘又称为粘蛋白型(mucin type)。最简单情况 Ser/Thr只连接一个GalNAc,见于不多几种粘蛋白和分泌 性糖蛋白中。少数糖蛋白中Ser/Thr上连接一个二糖，包 括 Sia2-6 GalNAc- ； Gal1-3 GalNAc- ； GlcNAc1-3 GalNAc- ； Gal1-3 GalNAc- 。含有两个以上糖残基的O-聚糖可将其结构 分为核心、骨架和非还原端三部分。 n(1) 核心： n与N-聚糖都只有核心五糖不同，O-GalNAc聚糖至少有7 种核心结构，如图4.5所示；其中核心结构较为常 见；核心结构和分别是上述二糖和；核心和 有分枝。 Complex O-GalNAc glycans with different core structures Chapter 9, Figure 2 Essentials of Glycobiology Second Edition (2) 骨架： 指核心结构外侧的延长部分，与N-聚糖 的外链相似，基本上由连接的Gal-GlcNAc二糖 单位组成，包括Gal1-3 GlcNAc(1型结构)、 Gal1-4GlcNAc(2型结构)和(Gal1-4 GlcNAc1-3)n以及N-聚糖中不存在的Gal 1-3 GalNAc(3型结构)和Gal1-3 GalNAc-(4型结 构)。O-GalNAc聚糖骨架的Gal C6位常连有 GlcNAc1-6分枝，如Gal1-4 GlcNAc1- 3(Gal1-4 GlcNAc1-6)Gal1-结构，i抗原直 链结构上如形成这种分枝就转变成I抗原。 (3) 非还原端： O-GalNAc聚糖的非还原端常是在Gal上连一个 Sai2-3或在GalNAc上连一个Sia2-6。还有相当一 部分O-GalNAc聚糖末端糖基被硫酸化，虽然糖链中部 的糖基也可能被硫酸化。O-GalNAc聚糖非还原端部分 往往构成血型抗原，例如图4.4中和分别为1型H和 2型H抗原；则根据有无Fuc1-2分别为Lae和Lbe抗原 ；则按有无Fuc1-2分别构成Lxe和Lye抗原。在H-1 和H-2抗原结构Gal上分别以1-3链连接Gal或GalNAc ，就成为B-1、B-2和A-1、A-2抗原。 2.2 糖蛋白的生物合成 糖蛋白肽链部分的合成由特定基因转录的 mRNA直接编码，聚糖部分是后加的。N- 聚糖的合成在肽链合成尚未完成时即已开始 ，是伴翻译(co-translational)过程，O-聚 糖的合成则是翻译后(post-translational) 修饰过程。 糖基化位点的选择、糖肽键的类型以及聚糖 链的组成和结构，都是在基因组编码的一系 列特异性酶顺序作用下，在细胞内特定的微 环境中形成的，因而可以认为聚糖链的合成 受到基因组严格而精准的间接控制。 活化糖基供体的合成 n所有的生物合成都需要把单体事先活化，以利于反应朝着合 成的方向进行。聚糖链合成所需要的单糖也必需转化成相应 的活化形式，才能在糖基转移酶催化下参入聚糖。 n蛋白质糖基化反应所需活化糖基供体有三种类型 Glc、Gal、GlcNAc、GalNAc、Xy1和GlcA均为UDP-糖基； UDP-GlcA经表异构酶催化可转化成UDP-IdoA；Man和Fuc为 GDP-糖基； Sia(唾液酸)则以CMP-Sia为活化供体； n此外，UDP-Glc和GDP-Man还能将糖基转移到ER膜中的 Dol-P上，以Dol-P-Glc和Dol-P-Man的形式被糖基化反应利 用。图4.6简要概括了这些活化糖基供体的合成路线与相互转 化。 图4.6 活化糖基供体的生物合成及其相应转化 带阴影的矩形框为活化糖基供供；椭圆为单糖；星号处为控制点 N-寡糖的合成 n早在1960年代至1970年代，利用重建的无细胞系 统和凝集素耐受细胞系阐明了N-聚糖生物合成的基 本途径。结果发现首先在ER中组装一个脂质载体连 接的寡糖前体，再把这个寡糖前体转移到新生肽链 合适的糖基化位点上，最后在ER和Golgi器中经过 一系列剪接加工，形成成熟的糖蛋白。 n从1980年代开始克隆N-聚糖生物合成涉及的糖基 转移酶和糖苷酶的基因并延续至今。这些基因特殊 的表达模式以及它们编码的酶突出的底物专一性为 阐明N-聚糖特殊结构的形成与变化具有重要意义。 还注意到胚胎发生、细胞活化和肿瘤形成等条件下 N-聚糖的结构发生改变，为研究N-聚糖的生物学 功能提供了新的契机。 (1) 多萜醇寡糖前体的组装： nN-聚糖的前体由14个特定的单糖连接 而成，在所有真核细胞中这个寡糖前 体的结构是保守的。寡糖前体在磷酸 多萜醇上组装(图4.7)。动物的多萜醇 含1721个异戊二烯单元，真菌类和 植物的多萜醇含有1424个异戊二烯 单元。多萜醇的极性端通过焦磷酸与 糖相连接，长长的烃链插入ER膜，把 正在合成的寡C糖前体锚定在ER膜上 。 C= CH3 CHCH2(CH C CH3 CH3=CHCH2 )nCH2CH CH3 O CH2OCH3 = PO 图4.7 多萜醇磷酸的结构 O 多萜醇焦磷酸寡糖前体组装 n如图4.8所示，多萜醇焦磷酸寡糖前体组装的第1步反应由GlcNAc-1-磷 酸转移酶把GlcNAc-P从UDP-GlcNAc上转移到给Dol-P,同时释放1分子 UMP；然后再由GlcNAc转移酶从UDP-GlcNAc上把第二个GlcNAc转 移到Dol-PP-GlcNAc上，同时释放1分子UDP。 n接下来，在第2步反应中由5种不同的Man转移酶以GDP-Man为糖基供 体，依次添加5个Man。 n通过尚不完全了解的机制，Dol-PP-GlcNAc2-Man5穿越ER膜翻转到 ER腔(步骤3)。 n4个GDP-Man在ER膜胞液一侧把Man转移到Dol-P上，生成的Dol-P- Man翻转到ER腔（步骤4和5）。 n在ER腔，4种Man转移酶以Dol-P-Man为活化糖基供体，向Dol-PP- GlcNAc2Man5，再添加4个Man残基(步骤6)。 n3个UDP-Glc在ER胞液一侧把Glc转移到Dol-P上，生成的Dol-P-Glc也 翻转到ER腔(步骤7和8)。 n最后，由Glc转移酶以Dol-P-Glc为糖基供体添加3个Glc残基(步骤9)， 完成Dol-PP-GlcNAc2 Man9 Glc3的组装。 多萜醇焦磷酸寡糖前体的合成过程涉及拓 扑变化。正如图4.8所示，反应1、2、4和7都发 生在ER胞液一侧，反应6、9和10都发生在ER腔 内。反应2形成的中间产物和反应6、9所需要的 糖基供体都必需在ER膜中翻转到ER腔。尽管目 前尚不清楚这种翻转移位的机制，但用糖基化 抑制剂、内翻外的粗糙型ER囊泡进行的研究都 直接或间接证明了上述中间产物翻转移位的事 实。 图4.8 多萜醇焦磷酸寡糖前体的合成途径 (2) 寡糖前体转移到新生肽链上 n上述完成组装的寡糖前体已具备了转移到新生肽链上的条件，当肽 链中出现合乎要求的Asn残基(Asn-x-Ser/Thr)时，包括14个糖残 基的寡糖前体整体转移，同时释放1分子Dol-PP，再翻转到ER胞液 面(步骤10和11)，其后经磷酸酶作用Dol-PP失去一个磷酸基，又 变成Dol-P，可以参与下一轮寡糖前体合成(步骤12)。 n寡糖前体的转移是由ER膜中的寡糖转移酶(oligo-sacharyl transfrase, OST)催化的。酵母OST复合物至少包含9种不同的亚基 ：Ostlp、Ost3p、Wbp1p、Stt3p、Ost6p、Swplp、Ost2p、 Ost5p和Ost4p，所有这些亚基都是跨膜蛋白，有18个跨膜域， 其中Ost1p对其活性必不可少(图4.9)。寡糖前体末端的3个Glc显然 是其转移信号，OST可识别其非还原端的3个Glc和还原端的GlcNAc ，如果切掉最外侧的两个Glc，其转移活性只剩下1/9；如将3个Glc 全部切掉，就不能再被转移。OST同样具备识别多肽链中合适糖基 化位点的能力。 (3) N-糖链的加工和成熟： n结合在肽链上的十四寡糖首先被ER中的葡萄糖苷酶切去非 还原端Glc1-2残基，再由-葡萄糖苷切下另外2个Glc残 基。切除Glc不仅是开启后续加工的信号，而且与蛋白质折叠 有关。 n如果糖蛋白折叠不适当，即可被ER 腔一种UDP-Glc：糖蛋 白葡萄糖基转移酶识别并重新糖基化，带有Glc-Man9- GlcNAc2寡糖的不当折叠蛋白质即可被ER腔中的一种有糖结 合活性的分子伴侣钙连蛋白(calnexin)识别并结合，然后结 合于多肽链部分，把十二寡糖的Glc1-3Man-暴露给葡萄 糖苷酶。-葡萄糖酶和UDP-Glc： n糖蛋白葡萄糖基转移酶交替作用，直至多肽链正确折叠。正 确折叠的肽链糖基化位点附近的疏水片段不再暴露，葡萄糖 基转移酶不再结合，最后一个Glc被切去，钙连蛋白解离，寡 糖的加工继续进行(图4.10)。 图4.10 ER钙连蛋白(calnexin)在糖蛋白的折叠中的功能 Glcase和为-葡萄糖苷酶和，Glc-T为UDP-Glc：糖蛋白葡萄糖基转移酶 n上述带有十一寡糖Man9-GlcNAc2-糖蛋白随即被ER 中的-甘露糖苷酶切去核心糖1-6臂上的1-3分 枝末端1-2连接的Man残基，生成的Man8GlcNAc2- Asn结构即可进入Golgi体继续加工。有些糖蛋白的 Man8GlcNAc2-Asn结构可被一种特殊的N-乙酰氨基 葡萄糖磷酸转移酶识别，在两个1，2连接的末端 Man内侧Man上各转移一个GlcNAc-P-基团，然后再 由一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶切去GlcNAc,把磷酸 基留在Man C6位。这种有Man-6-P的寡糖是糖蛋白 被分拣和运输到溶酶体关键的结构信号。上述反应 在ER/Golgi中确切的定位尚不明确。另一些糖蛋白 则可在Golgi器-甘露糖苷酶作用下，切去以1-2 连接的其余3个Man残基。 除上述逐步加工途径外，ER中还有一种内切 -甘露糖苷酶，可切除Glc-Man9GlcNAc2-Asn 结构末端的Glc1-3Man,生成的Man8GlcNAc2-Asn进 入Golqi体，由其中的-苷露糖苷酶切去3个 1-2连接的Man(图4.11)。 图4.11 ER和Golgi体内N-寡糖的加工 GlcNAc-P-T:N-乙酰氨基葡萄糖磷酸转移酶；GlcNAcase:N-乙酰氨基葡萄糖苷酶。 在Golgi体内，上述Man5GlcNAc2-Asn结构如继续 添加Man，可形成高甘露糖型N-聚糖。如果由N-乙酰氨 基葡萄糖基转移酶在核心结构1，3臂的Man上添加 一个1-2连接的GlcNAc，或由-甘露糖苷酶继续 切除1-6臂上的两个Man，再添加适当糖基，可形成 杂合型N-聚糖。如果Man5GlcNAc2-Asn结构在-甘露 糖苷酶作用下切去1-6臂上两个Man，再由N-乙酰 氨基葡萄基转移酶添加1个GlcNAc，产物再由N-乙酰 氨基葡萄糖基转移酶作用在1-6连接的Man上以1 -2连接1个GlcNAc，产物还可由岩藻糖基转移酶在Asn 连接的GlcNAc上以1-6连接一个Fuc,生成的寡糖都可 以成为复杂型N-聚糖的“核心”部分(图4.12)。 图4.12 Golgi体中产生高甘露 糖型、杂合型和复杂型N-聚糖 的基本途径 GlcNAc- T，-T：N-乙酰氨基葡萄糖 转移酶， 上述复杂型N-聚糖“核心”在不同糖基 转移酶作用下，顺序添加糖基，形成各具特 点的聚糖链。图4.13出示了几种双天线复杂 型N-聚糖的合成路线，包括末端为1-3连 接的Fuc、2-3/6连接的Sia以及1-4连接 的GlcNAc 4-SO4残基的外链。 图4.13 几种双天线复杂 型N-聚糖的合成 1-4GaT为1-4半乳糖基转移 酶；1-4GlcNAc T为1-4N- 乙酰氨基半乳糖转移酶； 1-3Fuc为1-3岩藻糖基转移 酶；ST6 Ga1-1为CMP-Sia： Gal2-6唾液酸转移酶- 上述外链延伸和修饰主要在trans-Golgi垛叠和trans- Gogli网络(TGN)中进行(参看图3.31)。除1-4Gal T外 ，还有一种1-3GlcNAc T-i，二者交替作用，合成 (Gal1-4GlcNAc1-3)n。外链带有Gal的N-聚糖进入 TGN后，在非还原端添加Sia而终止外链的合成。N-聚糖“ 核心”在1-4N-乙酰氨基半乳糖转移酶和GlcNAc-4硫酸 转移酶相继作用下完成4位硫酸化的外链合成。1- 4GlcNAcT对受体糖链(杂合型或双天线复杂型)有专一性 ，能识别LH和TSH肽链糖基化位点氨基一侧含有Arg(或 Lys)的序列。接于外链GlcNAc上的Fuc由1-3岩藻糖基 转移酶催化。高等动物至少有5种1-3FucT,分别为、 、和，有组织分布专一性。其中型1- 3FucT以2型糖链为受体时形成Fuc1-3连接；以型糖 链为受体时则形成Fuc1-4连接，是“一种糖基转移酶只 形成一种糖苷键”这一法则唯一的例外。 多天线N-聚糖的合成涉及6种不同的N-乙酰氨基葡萄糖 转移酶(GlcNAc T),其中GlcNAcT-和T-作用于核心 五糖1-3臂Man，分别形成1-2和1-4连接键； GlcNAcT-、T-和T-作用于1-6臂Man，分别形 成1-2、1-4和1-6连接键(图4.14)。合成单天线只 需要GlcNAcT-；双天线需要GlcNAcT-和T-；C2 ，4，C2三天线需要GlcNAcT-、T-和T-；C2， 4C2三天线需要GlcNAcT-、T-和T-；合成四天线 则需要GlcNAcT-、；GlcNAcT-负责合 成平分型GlcNAc。这6种GlcNAc T均以UDP-GlcNAc为 糖基供体，而受体各不相同，有严格的糖基序列专一性， 因而它们的作用先后也有严格的顺序：GlcNAcT-最先 作用，其次是GlcNAcT-，然后是-甘露糖苷酶，接 下来是GlcNAcT-和T-，最后是GlcNAcT-。 图4.14 6种GlcNAcT(1)的作用位置及形成的糖苷键 O-GalNAc聚糖的合成 nO-GalNAc聚糖的合成是在已折叠的蛋白质表面适当的 Ser/Thr上逐个添加糖基。O-GalNAc糖基化的发生比N- 糖基化要晚，尚不能确定加上第一个GalNAc的确切亚细胞 定位。很可能不同的糖蛋白O-GalNAc糖基化起始部位也不 同，可以在ER、过渡小泡或cis-Golgi扁囊。起始之后，O -GalNAc聚糖其它糖基的添加、糖链延伸和非还原端形成 都发生在Golgi体内。O-GalNAc聚糖合成起始步骤由多肽 ：N-乙酰氨基半乳糖转移酶(ppGalNAcT)催化。哺乳动物 至少可编码8种ppGalNAcT，其中的4种(ppGalNAcT-1 4)已进行了体外重组研究。多种GalNAcT同工酶很可能有 差异地定位于不同的亚细胞区隔，与一些糖蛋白糖基化作 用的组织和细胞类型专一性有关。可将O-GalNAc聚糖酶合 成划分为三个阶段：核心结构的合成；糖链延伸和分枝； 非还原端