微生物菌种选育.ppt

第二章 菌种选育 本章主要内容 v第一节 菌种的分离筛选 v第二节 菌种选育 v第三节 生产菌种的扩大培养 v第四节 菌种的保藏与复壮 第一节 菌种的分离筛选 一、菌种的来源 v根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买； v从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 二、分离思路 v新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法 ，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 v实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。 v有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。 v定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特 性。 v采样：有针对性地采集样品。 v增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖 培养后，在数量上占优势。 v分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目 的菌。 v发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态 、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产 品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、 最适pH值、提取工艺等。 三、新种分离与筛选的步骤 （一）采样 1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的 沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水 化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多 ，如一些野果生长区和果园内。采样的对象 也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 从自然界筛选 v2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好 。 v3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去 表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁 的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样 时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土 样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐 步分批寄回，以便及时分离。 采取土壤样品要考虑的几个问题 v土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放 线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗 性真菌。 v离地面520cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含 菌量最高。 v采土季节以春秋两季最好。 v采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克， 盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、 地点、植被情况等。 v多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分 布平均情况 （二）增殖培养 v含有目的菌较多的土样不需要富集培养 v如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的 基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖， 从而提高它们在样品中的比例，便于分离。 v富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无 关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体 中比例上升的目的。 v 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或 者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这 一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可 能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多 。 v一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通 过大量艰苦的工作筛选取得。 某些细菌的富集条件 富集对象 接种菌样添加营养物(g)特殊培养条件 好氧氨基酸氧化菌土壤好氧，pH7.0 好氧性芽孢杆菌土壤，巴氏消毒 好氧，pH7.0 氨基酸发酵性梭菌土壤，巴氏消毒 厌氧，pH7.0 耐碱解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒 尿素50 好氧，pH8.6 厌氧八叠球菌土壤 葡萄糖20厌氧，pH23 乳酸菌植物体或牛奶 葡萄糖20厌氧，pH6.5 肠道细菌土壤或污水葡萄糖20，CaCO320好氧或厌氧， pH7.0 丙酸菌干酪 乳酸钠20厌氧，pH7.0 醋酸菌果实或生啤酒 乙醇40 好氧，pH6.0 注：培养基成分为酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO4 1.0g，MgSO47H2O 0.2g，加水1000ml 。一般培养在30下。 （三）培养分离 v 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物 的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这 步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用， 而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划 线分离法、稀释分离法。 稀释分离法 稀释倒 平板法 平板 涂布法 注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。 划线分离法平板划线法 （四）筛 选 1、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物 筛选出来的过程。 常用的初选方法： 水解酶产生菌的筛选： 将酶的作用底物加在培 养基中，接种后适温培 养，根据菌苔周围是否 产生水解圈筛选出水解 酶产生菌。 一般采用平板筛选。 拮抗菌的筛选对峙培养： 将病原指示菌与待测菌株 相对接种在平板上适温培 养，根据病原菌的生长情 况筛选出拮抗性菌株。 分初筛、复筛。 2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取 发酵滤液进行活力测定。 2、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的 生产能力强弱的过程。 复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法 进行测定。 复筛过程中，要结合培养条件进行。 培养条件包括：培养基 pH值 发酵温度 供氧量等。 （五）菌种鉴定 v 经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特 征、血清学试验等。 v现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组 分、计算机数值分析。 （五）毒性试验 v 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将 其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有 关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食 用，均需通过两年以上的毒性试验。 第二节 菌种选育 v菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生 物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产 品的高产优质和发展新品种为生产不断地提供优良 菌种，从而促进生产发展。 v 目前菌种选育常采用自然选育和诱变育种等方 法，带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。 随着微生物学、生化遗传学的发展，出现了转化、 转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为 定向的育种方法。 2.1 自然选育 在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变而 进行菌种筛选的过程叫做自然选育。 所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生 的那些突变。一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低 剂量的诱变效应和互变异构效应。 菌种的自然突变往往有两种可能性:菌种衰退,生产性能下 降;代谢更加旺盛,生产性能提高。 v所谓多因素低剂量的诱变效应，是指自然突 变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因 素引起的长期综合效应。 v所谓互变异构效应是指四种碱基的第六位上 的酮基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G ）可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C）和 腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现。平 衡一般倾向于酮式和氨基式。碱基对发生自 然突变的机率约为108一109。 Purines pyrimidines Adenine (A) Guanine (G) Cytosine (C) Thymine (T) N9 N1 2.2诱变育种 2.2.l 诱变育种的基本原理 诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由 于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异 。 突变主要包括染色体畸变和基因突变二大类。 （1）染色体畸变是指染色体或DNA片断的缺失、易 位、逆位、重复等。 （2）基因突变是指DNA分子结构中的某一部位发生 变化（又称点突变）。 根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。 诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变 。诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三大类， 见表21。经诱变处理后，微生物的遗传物质、DNA和RNA 的化学结构发生改变，从而引起微生物的遗传变异。 2.2.2 诱变育种的一般步骤 1、出发菌株的选择 v自然界直接分离到的野生型菌株 v经历过生产条件考验的菌株 v已经历多次育种处理的菌株 2、制备菌悬液 v待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的 均一性和环境条件； v尽可能选择孢子或单倍体细胞作为诱变对象，避免 表型延迟。 v表型延迟就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后 ，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。 3、诱变处理 v根据诱变剂用量对菌体致死率的曲线选择合适的处 理剂量。 v一般突变率随诱变剂量的增大而增高，但达到一定 剂量后，突变率会下降。 4、突变菌株的筛选 （1）营养缺陷型突变株的筛选 v 生物合成途径的某一步发生了酶缺陷，合成反应不能完成， 末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。 （2）抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变菌株的筛选 v 调节基因或操纵基因发生突变，使产生的阻遏蛋白不能再和 终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因，因此不 再起反馈阻遏作用； v编码酶的结构基因发生突变，使变构酶不再具有结合终产物 的能力但仍具有催化活性，从而解除了反馈抑制。 v抗反馈突变株一般通过抗结构类似物突变的方法筛选。 v营养缺陷型的回复突变株中也可获得抗反馈突变株。 （3）组成型突变株的筛选 v分批限量加入诱导物法，解除菌株对诱导物的依赖 v交替培养法 （4）抗性突变株的筛选 v抗生素抗性突变 v抗噬菌体菌株的选育 v条件抗性突变 v敏感突变 2.2.3 诱变育种工作中几个应注意的问题 A 选择好出发菌株 选好出发菌株对诱变效果有着极其重要的作用 。有些微生物比较稳定，其遗传物质耐诱变剂的作 用强。如果用这种菌株于生产是很有益的，而用作 出发菌株则不适宜。 用作诱变的出发菌株必须对它的产量、形态、生 理等方面有相当了解。挑选出发菌株的标准是产量 高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广，再确定诱 变剂的使用及筛选条件。 B 复合诱变因素的使用 在微生物诱变育种中，可利用各种物理、化学 诱变因素来处理菌种。对野生型菌株单诱变因素有 时也能取得好的效果，但对老菌种单一诱变因素重 复使用突变的效果不高，这时可利用复合因素来扩 大诱变幅度，提高诱变效果。 C 剂量选择 各种诱变因素有它们各自的诱变剂量单位，如 紫外线剂量单位用焦耳，x一射线剂量单位是库（仑 ）每千克，中子剂量单位是戈。 化学诱变因素一般是以溶液浓度来计算剂量单 位的。对不同微生物使用的剂量是不同的，致死率 取决于诱变剂量，而致死率和变异率之间有一定关 系。因此可以用致死率作为选择适宜剂量的依据。 D 变异菌株的筛选 诱变育种工作的一个主要任务是获得高产变异菌 株。从经诱变的大量个体中挑选优良菌种不是一件容 易的事。因为不同的菌种表现的变异形式是不同的， 从一个菌种的变异规律去发现那些与产量有关的特性 ，并根据这些特性，分门别类地挑选一定数最的典型 菌株进行发酵和鉴定，以确定各种类型与产量之间的 关系。这样，可大大提高筛选的工作效率。 E 高产菌株的获得需要筛选条件的配合 在诱变育种过程中高产菌株的获得还必须有合适的筛选 条件的配合。 诱变与筛选可以说是一个问题的两个方面，必须用辩证的 观点来看待。 总之，在诱变育种过程中要正确处理出发菌株，诱变因素 和筛选条件三者的关系。 2.2.4 几种常见的物理、化学诱变剂的使用方法 1）物理诱变剂：紫外线、X射线、射线，快中子； 电离辐射特点： 导致DNA断裂缺失，造成不可回复 的缺失突变。诱变效率高，但它可能 影响邻近基因的性能。 紫外线是常用的诱变剂。 2）化学诱变剂：碱基类似物（5-BU）、脱氨剂（羟胺、 亚硝酸）、 嵌入剂（吖啶类）等。 特点： 碱基类似物：取代相应碱基进入DNA链，具有 很高的特异性，但回复突变率高，很少使用。 脱氨剂：碱基脱氨或脱氮，引起碱基对转换， 造成的遗传损伤较多。应用的范围较广， 嵌入剂：引起移码突变。可以造成生化代谢途径 完全中断。 5BU 酮式 T 烯醇式 C A ： T BU (酮 ) ： A T ： A A ： T G) : BU (烯 BU (酮 ) ： A C ： G A ： T C ： G T ： T ： A X ： ： U ： A HNO2 X G ： C A ： T T ： A 2.3 杂交育种 发酵工业的优良菌种的选育主要采用诱变育种方法。但是，一个菌种长 期使用诱变剂处理之后，其生活能力一般要逐渐下降，例如生长周期延长， 孢子量减少，代谢减慢，产量增加缓慢，诱变因素对产量基因影响的有效性 降低等。因此，有必要利用杂交育种方法。 杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重 新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。 1、杂交育种的目的在于： 1）通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合，从而改变原 有菌株的遗传物质基础，获得杂种菌株（重组体）； 2）可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中，克服长 期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷； 3）通过杂交，可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现 新的品种； 4）分析杂交结果，可以总结遗传物质的转移和传递规律，促进遗传学 理论的发展。 微生物杂交育种所使用的配对菌株称为直接亲本。由于多数微生物尚未 发现其有性世代，因此，直接亲本菌株应带有适当的遗传标记。常用的遗 传标记有颜色、营养要求和抗药性等。 营养标记菌株（即营养缺陷型菌株）是最常用的遗传标记之一。 所谓营养缺陷型菌株是微生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。 由于基因突变，它失去了合成某种物质（氨基酸、维生素或核苷酸碱基） 的能力，在基本培养基上不能生长，大多数营养缺陷型菌株需要补加一定 种类的有机物质后才能生长。 2、遗传标记 2.4原生质体融合技术 所谓原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用 加以瓦解，使菌体细胞在高渗环境中释放出只有原生质膜包裹 着的球状体（称原生质体）。 两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（ PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两 亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生成细胞 的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。 2.4.1 原生质体融合的优越性 从现有资料看，原生质体融合技术有以下优点 （l）去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实 现重组，不需要有已知的遗传系统。即使是相同接合型的真菌 细胞也能发生原生质体的相互融合，并可对原生质体进行转化 和转染。 （2）原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交 换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子。 参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、四个， 这足一般常规杂交所达不到的。 （3）重组频率特别高，因为有聚乙二醇作助融剂。 （4）可以和其他育种方法相结合，把由其它方法得到的优良 性状通过原生质体融合再组合到一个单株中。 （5）可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或 双方，然后使之融合，再在再生菌落中筛选重组子。这样往往 可以提高筛选效率。 由于以上优点，利用原生质体融合来培育工业新菌株已受到 国内外普遍重视。 2.4.2 原生质体融合技术一般步骤 1、选择亲株 选择遗传性状稳定且具有优势互补的两个亲株； 亲株带上遗传标记； 测定遗传标记的稳定性。 2、原生质体制备 一般采用酶解法除壁。根据微生物细胞壁组成和结构的不 同，采用不同的酶，有时还要采取一些措施，如添加甘氨酸 、蔗糖或抗生素等，以提高细胞壁对酶解的敏感性； 原生质体对渗透压极其敏感，低渗易引起细胞破裂。一般将 原生质体放在高渗的环境中维持它的稳定。 3、原生质体融合 两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（ PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着 两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生细 胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。 4、原生质体再生 原生质体再生就是使原生质体重新长出细胞壁，恢复完整的 细胞形态结构； 为获得较高的再生率，在实验过程中应避免剪切力过大使原 生质体破裂； 涂布时，原生质体浓度不宜过高； 菌龄、再生时的温度、溶菌酶用量和溶壁时间等因素都会影 响原生质体的再生。 5、筛选优良性状融合重组子 v原生质体融合后，来自两亲代的遗传物质经过交换 并发生重组而形成的子代称为融合重组子。 v融合重组子的检出方法： 直接法 将融合液涂布在不补充亲株生长需要的生长因子高 渗再生培养基平板上，直接筛选出原养型重组子。 间接法 把融合液涂布在营养丰富的高渗再生平板上，使亲 株和重组子都再生成菌落，然后用影印法将它们复 制到选择培养基上检出重组子。 v筛选出来的融合重组子还需要对它们进行生理生化 及生产性能的测定。 第三节 生产菌种的扩大培养 v种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休 眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶 及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。 作为种子的准则 v菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生 长，迟缓期短； v生理性状稳定； v菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； v无杂菌污染； v保持稳定的生产能力。 种子扩培的目的 q 接种量的需要 q 菌种的驯化 q 缩短发酵时间、保证生产水平 3.1 种子的制备过程 v种子制备的过程大致可分为： 实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段 一、实验室种子的制备 v实验室种子的制备一般采用两种方式 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的 菌种可以采用固体培养基或斜面（静置培养）培 养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操 作简便，不易污染杂菌。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以 用液体培养法(通过摇瓶培养提供比较好的溶氧） 。 （一）孢子的制备 1、细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰 富的配方。 培养温度一般为37C。 细菌菌体培养时间一般为12天，产芽孢的细 菌培养则需要510天。 2、霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、 麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。 培养的温度一般为2528C。 培养时间一般为414天。 3、放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基 ，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分 ，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐 等。 培养温度一般为28C。 培养时间为514天。 （二）液体种子制备 1、好氧培养： 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌 种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（ S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培 养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶 中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌 丝体（短菌丝），作为种子。 试管三角瓶摇床种子罐 2、厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清 酒等） 试管三角瓶卡式罐种子罐 二、生产车间种子制备 v实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐 扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而 异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡 萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌， 同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌 ，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得 相同的培养条件。 1、种子罐的作用 v主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体 ，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体 量，以利于产物的合成。 2、种子罐级数的确定 v种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的 次数，一般由菌丝体培养开始计算发酵级 数，但有时，工厂从第一级种子罐开始 计算发酵级数。 v种子罐级数取决于： 菌种生长特性（如菌种传代后的稳定性）、孢子发 芽及菌体繁殖速度； 所采用发酵罐的容积 另外还与发酵罐中种子培养液的最低接种量（种子 液体积/培养液体积）以及种子罐与发酵罐的容积比 等有关。 细菌：生长快，种子用量比例少，级数 也较少，二级发酵。 茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时 孢子发芽，产生菌丝 ）二级种子罐（ 27C,1024小时，菌体迅速繁殖，粗壮 菌丝体）发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快， 通常用一级种子 （二级发酵）。 v确定种子罐级数需注意的问题 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减 少染菌机会 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而 定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种 子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的 繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 3.2 种子质量的控制 一、影响孢子质量的因素及控制 v培养基 v培养条件 v培养时间和冷藏时间 1、培养基 v生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象， 其主要原因是原材料质量波动。 例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培 养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用 量的不同对孢子质量的影响也不同。 蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不 同。 v原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机 离子含量不同，如微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、 Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也 会影响孢子的质量。 v水质的影响：地区不同、季节变化和水 源污染，均可造成水质波动，影响种子 质量。 v菌种在固体培养基上可呈现多种不同代 谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的 菌落类型也越多，不利于生产的稳定。 v措施 培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用 严格控制灭菌后培养基的质量 斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时 间 供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作 为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮 源 2、培养条件 （1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响 。如土霉素生产菌种在高于37C培养时，孢 子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回 升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。 一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培 养温度。 （2）湿度 制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较 大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制 备时发现：在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快， 在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好 ，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少 。在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，主要 由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中 看出相对湿度在40%45%时孢子数量最多，且孢子颜 色均匀，质量较好。 3、培养时间和冷藏时间 （1）培养时间 v一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因 为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物 质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生 产能力的下降。 v措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多 、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养 。 （2）冷藏时间 v斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。 如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4C冰 箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培 养5天以后冷藏，20天未发现自溶。 v冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉 素生产中，斜面孢子在6 C冷藏两个月后的发酵单 位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35% 。 4、接种量 v接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进 而影响菌体的生理状况。 二、影响种子质量的因素及控制 v孢子的质量 v培养基 v培养条件 v种龄 v接种量 1、培养基 v营养成分适合种子培养的需要 选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基； 营养上要易于被菌体直接吸收和利用； 营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素 含量要高 v营养成分要尽可能与发酵培养基相近。 2、培养条件 （1）温度 （2）通气量 （3）pH 3、种龄 v种龄：是指种子罐中培养的 菌丝体开始移入下一级种子 罐或发酵罐时的培养时间。 v通常种龄是以处于生命力极 旺盛的对数生长期，菌体量 还未达到最大值时的培养时 间较为合适。时间太长，菌 种趋于老化，生产能力下降 ，菌体自溶；种龄太短，造 成发酵前期生长缓慢。 v不同菌种或同一菌种工艺条 件不同，种龄是不一样的， 一般需经过多种实验来确定 。Ru 嗜碱性芽孢杆菌生产碱 性蛋白酶，12小时最好。 4、接种量 v接种量的大小决定于生产菌种 在发酵罐中生长繁殖的速度， 采用较大的接种量可以缩短发 酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时 间，使产物的形成提前到来， 并可减少杂菌的生长机会。但 接种量过大或者过小，均会影 响发酵。过大会引起溶氧不足 ，影响产物合成；而且会过多 移入代谢废物，也不经济；过 小会延长培养时间，降低发酵 罐的生产率。 v通常接种量，细菌15%，酵 母菌510%，霉菌715%， 有时2025% 三、种子质量的控制措施 v种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所 表现出来的生产能力。因此首先必须保证生 产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适 宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。 菌种稳定性的检查 无杂菌检查 四、种子质量标准 1、形态 v单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐， 有的还要求有一定的排列或形态； v霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色 力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情 况好。 2、生化指标 v种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。 3、产物生成量 v在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质 量的重要指标，因为种子液中产物生成量的 多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。 4、酶活力 v种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量 有一定的关联。 五、种子异常分析 v菌种生长速度，过快或过慢 v菌丝结团 v菌丝粘壁 第四节 菌种的保藏与复壮 一、菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基 本材料，特别是利用微生物进行有关生产如 抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌 种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微 生物育种工作的重要组成部分。其任务首先 是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把 菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面 转化。 二、菌种保藏的原理 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造 条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减 少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低 水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状 态，抑制其繁殖能力。 一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优 良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经 济，以便生产上能推广使用。 菌种保藏的方法很多，一般有下面几种： A 斜面冰箱保藏法（酵母） 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条 件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰箱保存。一般保存期为三个 月到六个月。 B 石蜡油封存法（酵母） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面 一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌 、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。 三、菌种保藏的方法 C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌 ） 这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢的微生物 。它的制备方法是： 首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为l2l 混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右，121C 间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用80目过筛 ，土用30100目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接 入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥器中用 真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为1年左右。 D真空冷冻干燥保藏法（细菌，防线菌 ） 真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理是在较低的温度 下（15），快速她将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华 。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。 因此，菌种可以保存很长时间，一般5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备 ，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内 外都已较普遍地应用。 这种方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特 制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后 将安瓿管真空熔封，并低温保藏。 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代 替结合水而稳定细胞成分