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文档简介
实验二 小鼠肝脏RNA的抽提纯化与鉴定 实验目的 |掌握RNA操作注意事项 |了解鉴定RNA含量和质量的方法 |了解RNA抽提原理 |熟悉RNA抽提方法 实验原理 |理论基础: 真核生物结构基因有内含子 基因在转录水平的表达 |实验原理:四步骤 组织或细胞匀浆 分离总RNA 纯化RNA 检测RNA的纯度及完整性 理论基础 |真核生物中绝大多数基因有内含子,如直 接由基因组克隆目的基因,不利于编码基 因的序列分析及体外利用原核细胞表达。 提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文 库是获取真核生物表达基因的主要手段。 |检测基因在转录水平的表达,需检测mRNA 含量,定量RT-PCR是主要方法之一。 内含子 外显子 实验原理 |抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质,常 用酸性酚法。在酸性条件下苯酚可溶解 DNA而不溶解RNA,同时酚又是蛋白变性剂 。利用酸性酚试剂加氯仿共抽提,可一步 完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离 。最后利用异丙醇沉淀,即可获得纯化的 总RNA。 RNA产物的鉴定 |RNA的纯度与含量用紫外分光光度法检验。 v高纯度RNA的A260/A280应处于1.6至1.8之间, vA260与RNA浓度呈正比,1 OD = 40g/ml RNA 。 |RNA的完整性可通过电泳检测 vRNA为单链分子,二级结构复杂,需先经甲酰胺 变性,再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。 v细胞总RNA以rRNA含量最高,电泳时可观察到 18S与28S rRNA两条清晰条带,且亮度之比接近 1:2,表明RNA没有发生降解。泳道前缘还可观 察到一条较为模糊且亮度较弱的条带,主要由 5S、5.8S rRNA 与tRNA组成。 RNA电泳结果示意图 28S 18S 5S RNA电泳结果凝胶成像图 28 S 18 S 5 S 取小鼠肝组织匀浆 |处死小 鼠 |匀浆 取肝50100g Trizol 1ml 匀浆 RNA纯化操作步骤 |加入氯仿0.2ml,剧烈振荡,室温放置10分钟。 12000rpm离心15min,取上清。 (离心后溶液分为三相,即上层的水相、下层的有机 相以及中间的变性蛋白。小心吸取上层水相,绝不能有 中层蛋白混入。) |加入异丙醇0.5ml,振荡混匀,室温放置10分钟, 12000rpm离心10min,弃上清。 (加入50的异丙醇沉淀核酸。异丙醇的用量应与以 上所取上清液的体积相当。) |1ml 75乙醇洗涤沉淀,12000rpm离心5min,重复一次 。 |空气干燥沉淀,溶解于20l DEPC-H2O。留样2l,其 余70保存备用。 RNA电泳操作步骤 |制备琼脂糖凝胶:首先将0.5g琼脂糖溶化于 32ml水,冷却至60。加入5甲醛变性凝胶电 泳缓冲液10ml,37甲醛水溶液9ml,混合均匀 并灌制胶板。 |取1l RNA溶液,加入甲酰胺-上样缓冲液9l ,95变性5分钟,迅速冰浴冷却。点样。 |150V电泳30分钟,紫外灯下观察电泳结果。 分光光度法操作步骤 |加1l RNA溶液于0.4ml DEPC-H2O, 充分混匀,读取260nm与280nm的吸光 度数值。 操作注意事项(一) |因为RNA酶分布广、活性强、且难以失活 , 使RNA极易降解,操作时应特别注意: X高压消毒实验器皿,烤干。 X以0.1% DEPC过夜处理所有试剂配置用水 ,并高压消毒。 X抽提RNA时,应戴手套和口罩,少说话。 操作注意事项(二) |DEPC是强烈的烷化剂,通过与RNA酶的活 性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶 活性,是消除外源性RNA酶的主要方法。 但CEPC有致癌作用,并具有很强的反应性 ,因此注意: X使用时,不直接接触 XDEPC处理的器皿和水必须经高压灭菌处理 ,使DEPC分解后使用。 操作注意事项(三) |为避免酶蛋白反复冻溶而失去活性,酶制 剂溶于50的甘油中,-20oC储存可保持 液状。但高浓度的甘油对酶促反应有抑制 作用,因此酶的用量不能超过反应体积的 1/10。 |在进行各种酶促反应时,应首先加水,再 加入其它成分,最后加酶。 G#S$%u3ub$gWidg+9g($N)ov!lmDJcVaYzQcwd0CrdFbEup-&Wi%qjg!YQdWi93KDqRkJseMv8oP!x5p%qpAuR66pBf2JJJjd-kQ&ApaMmxzTLFZ$4Rm9G4&DmHUgnv(hMZ+Y2e)*S2sy$ifrqXoFnXRxqXf&lRIldI0Vt(2ms$wMeKJUOo&ZzfsvMAn1bdRw&WPi5Mv5*u!Pk)pl07d%!Ps&PaEr*KJCcbaQDg5WXzcjpoUnGdNCc)lCtf(kWcxF+6gWlRIEemu-p%xr+%RmRrGSh3S10Uayb(yCSOm!V3l5+SMEWOH2GCY8TnWW&LtbenmV3O+fB5A32kms6wMuty%bc)&6O1Ta*)fBQh6ZfNmy%AucRqVLZhm3xr- ahWT+KqM3kYr2h$Rk#pX63lt9NKFwOztw0Ize*)8Ugv#jw-LQMAuh)*4!seBQ4fQZy&ZoahtiqqvX442Ykrhd#rlKdoEYbPy%7j0EqV(Aw6n7Yp&3v4CvNcd(TC+em+l56%$x#Ri1U$ecVc4Wr!U0B$gczlRGuA8(PA7-CItjYBm74N&LFzzSkL&h42QcDJD5P-oGR%(&PXhn+5-6erL(nVe(jtBd)lERnBgMkcx4Tnd-O3mB+tTRGAyU274)5o4h2Jy&zDyOvr6$f7sTYHB67cZJyoe1wExR8&svLb3-d0cWaDTck-8Cmp+F1iKkComMAgB+g&KvRm2QXbI1AHTYWEb5gm&Wl4+*74lYPgSIgzgoNTU5e0h%W7C$IxIpMZsUtHLYHOP384i)- 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