高二生物《基因工程的基本操作步骤》.ppt

基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 1.基因工程的操作步骤正确的操作顺序是 使目的基因与运载体相结合将目的基因导入受体细胞 检测目的基因的表达是否符合特定性状要求 提取目的基因 A B C D 步骤一：步骤一：目的基因的获取目的基因的获取 目的基因是人们所目的基因是人们所需要转移需要转移或或改造改造的基因的基因 , , 获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 如苏云金芽孢杆菌的如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因抗虫基因，还有植，还有植 物的物的抗病抗病（抗病毒抗病毒、抗细菌抗细菌）基因基因、种子、种子贮贮 藏蛋白的基因藏蛋白的基因，以及人的，以及人的胰岛素基因胰岛素基因、干扰干扰 素基因素基因等。等。 目的基因的提取方法目的基因的提取方法 人工合成基因人工合成基因 反转录法反转录法 根据已知的氨基酸序列根据已知的氨基酸序列 合成合成DNADNA ：鸟枪法鸟枪法 直接分离基因直接分离基因 从基因文库中获取 基因组文库 cDNA文库 1 . 1 . 鸟枪法（散弹射击法）鸟枪法（散弹射击法） 用用限制酶限制酶将将供体细胞供体细胞中的中的 DNADNA切成许多片段切成许多片段，从中，从中找出找出 含有目的基因含有目的基因. . 用限制酶切断成 许多片段 1 1）反转录法反转录法： 以以目的基因目的基因转录成转录成 的的信使信使RNARNA为模板，为模板，反反 转录转录成互补的成互补的单链单链DNADNA ，然后在酶的作用下然后在酶的作用下合合 成双链成双链DNADNA，从而获得从而获得 所需的基因。所需的基因。 目的基因的目的基因的mRNAmRNA 单链单链DNA(cDNADNA(cDNA) ) 双链双链DNADNA ( (即目的基因即目的基因) ) 反转录反转录 合成合成 2.人工合成基因法 2 2）根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNADNA法 法 ： 根据根据已知已知蛋白质蛋白质 的的氨基酸序列氨基酸序列，推测推测 出相应的出相应的信使信使RNARNA序序 列，然后按照列，然后按照碱基互碱基互 补配对补配对原则，原则，推测推测出出 它的它的结构基因的核苷结构基因的核苷 酸序列酸序列，再通过化学，再通过化学 方法，以方法，以单核苷酸为单核苷酸为 原料合成目的基因原料合成目的基因。 蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列 mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列 结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列 推测推测 推测推测 目的基因目的基因 化学合成化学合成 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？ 优点缺点 鸟枪法 反转录法 根据已知氨基酸 合成DNA法 操作简便操作简便 广泛使用广泛使用 工作量大，盲目，分工作量大，盲目，分 离出来的有时并非一离出来的有时并非一 个基因个基因 专一性强专一性强 操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA 很不稳定，要求的技很不稳定，要求的技 术条件较高术条件较高 专一性最强专一性最强 仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对 较少的简单基因较少的简单基因 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？ 1 1）DNADNA序列自动测序仪：序列自动测序仪： 2 2）PCRPCR技术技术： 对提取出来的基因进对提取出来的基因进 行核苷酸序列分析。行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段使目的基因的片段 在短时间内成百万倍在短时间内成百万倍 地扩增。地扩增。 用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内 切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质 粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细 胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆 多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称 为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶 绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基 因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基 上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂 交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（ 或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从 中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是 分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位和基因工程 的研究都很有用。 3 3从基因文库中获取目的基因：从基因文库中获取目的基因： 基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入 受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的 不同的基因,称为基因文库(gene library) 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基 因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基 因文库叫做部分基因文库. 步骤二：步骤二：基因表达载体的构建基因表达载体的构建 1 1）用一定的）用一定的限制酶切割质粒限制酶切割质粒，使其出现，使其出现一一 个切口个切口，露出，露出黏性末端黏性末端。 2 2）用）用同一种同一种限制酶限制酶切断目的基因切断目的基因，使其产，使其产 生生相同相同的的黏性末端黏性末端。 3 3）将切下的目的基因片段）将切下的目的基因片段插入质粒插入质粒的切口的切口 处，再加入适量处，再加入适量DNADNA连接酶连接酶，形成了一个，形成了一个重重 组组DNADNA分子分子（重组质粒）（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的上是不同来源的基因重组的过程基因重组的过程。 常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌 、酵母菌和动植物细胞等。、酵母菌和动植物细胞等。 将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴借鉴细菌或病毒侵染细胞细菌或病毒侵染细胞的途径。的途径。 步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞 直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等 方法。 （1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 （2）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注 入宿主细胞。 （3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。 （4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主 细胞中。 间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。 （1）质粒是细菌染色体DNA以外的环状双链DNA分子，它能自 我复制，也可整合到细胞染色体DNA中与其一起表达。质粒通常 还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。 （2）噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNA可以作为目的基 因的载体。 （3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和噬菌体的部分顺序 ，很适合用作真核生物基因的载体。 1.将目的基因导入植物细胞 2.将目的基因导入动物细胞 3.将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 首先用Ca2+ 处理细胞,以以增大增大细菌细菌细胞壁的细胞壁的 通透性通透性, ,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分 子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞. 第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓 冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感 受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程. 第二步目的基因在受体细胞内，随其繁目的基因在受体细胞内，随其繁 殖而殖而复制复制，由于细菌，由于细菌繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很短非常快，在很短 的时间内就能获得的时间内就能获得大量大量的目的基因。的目的基因。 1 1）将细菌用）将细菌用CaClCaCl 2 2 处理处理，以，以增大增大细菌细菌细细 胞壁的通透性胞壁的通透性。 2 2）使含有目的基因的）使含有目的基因的重组质粒进入重组质粒进入受体受体 细胞。细胞。 3 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而 复制复制，由于细菌，由于细菌繁殖的速度繁殖的速度非常快，在很非常快，在很 短的时间内就能获得短的时间内就能获得大量大量的目的基因。的目的基因。 步骤四：步骤四：目的基因的检测与目的基因的检测与鉴定鉴定 四环素四环素 抗性基因抗性基因 氨苄青霉氨苄青霉 素抗性基因素抗性基因 不能，受体细胞必须表现出特定的性状不能，受体细胞必须表现出特定的性状 ，才能说明目的基因完成了，才能说明目的基因完成了表达表达。 受体细胞摄入受体细胞摄入DNADNA分子后就说明目的基因分子后就说明目的基因 完成了表达吗？完成了表达吗？ 若若不能表达，不能表达， 要对抗虫基因要对抗虫基因 再进行再进行修饰修饰。 前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效 利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。 这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少， 必须将它从中检测出来。 无表达产物无表达产物 有表达产物无表达产物 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落， 检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产 物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。 多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培 养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄 入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出 相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应 变化的个体进一步培养、研究。 例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。 1 1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列酸序列 B B、质粒是基因工程中唯一的运载体质粒是基因工程中唯一的运载体 C C、运载体必须具备的条件之一是：具有多运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源基因连接 D D、基因控制的性状都能在后代表现出来基因控制的性状都能在后代表现出来 C C 练习练习 2 2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A A、能复制能复制 （ ） B B、有、有多个限制酶切点多个限制酶切点 C C、具有标记基因具有标记基因 D D、它是环状它是环状DNADNA D D 练习练习 3 3）有关基因工程的叙述中，错误的是）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起连接酶将黏性末端的碱基对连接起 来来 B B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由运载体导入受体细胞目的基因须由运载体导入受体细胞 D D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶 A A 练习练习 4 4）有关基因工程的叙述正确的是）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A A、限制酶只在获得目的基因时才用限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为运载体质粒都可作为运载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的