红细胞膜蛋白提取流程.ppt

红细胞膜蛋白提取鉴定 内容 1. 红细胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量测定（Lowry法） 3.膜蛋白电泳分离、分子量测定 SDS-PAGE 4.western blotting 鉴定-actin 实验报告要求： 分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论 手写，A4 纸大小 ，报告首页写明 实验者，专业。 实验分组 每个班分三大组，每组十人左右，选出组长 实验进行一大组为单位 1.纯化RBC膜 2.SDS-PAGE 2块胶（一个凝胶架） 3.western blot 4.3-4 人一小组测定蛋白质含量 一.红细胞膜提取制备（低渗法） 原理： RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，破裂溶血 溶血液。 溶血液置高速离心作用中，去除溶液中 Hb和其它内含物，制得纯净的RBC膜称 为血影 “ghost ” 注意事项： 1.离心步骤一定要“平衡、对称放置” 2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“ 膜” 3. 缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留增加 4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易 使脂蛋白脱落，1mMCaCl2可防止此种膜的 不稳定性。 5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保 持蛋白活性，应在4C离心。 （1）RBC分离： 15 ml RBC液 2000rpm 5分钟 RBC（沉淀）3倍体积等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分钟2 洗净之RBC （2）溶血液制备 RBC加入低渗磷酸buffer（1:50) (在 烧杯中） 稍搅拌 置冰箱冻格（4C）溶血过夜 （以上步骤已完成！） 溶血液，用“水泵”吸去上清。 ！：膜很轻 二、 RBC膜纯化（洗涤） RBC膜转至 1.5ml塑料管（2个/大组） 9000rpm 5 沉淀（膜）低渗磷酸Buffer（pH7.4) ?ml （吹打 ） 9000rpm 54 沉淀 等渗磷酸Buffer 1ml 9000rpm 5分钟 沉淀（RBC膜）0.6ml等渗Buffer （即为RBC原液） 三、 样品处理： 1.SDS-PAGE用样品处理（一大组）： 0.3ml RBC原液+0.3ml 样品溶解液 沸水浴 5 2.Lowry法测定用样品处理 (3-4 人/group）： A. 取0.3ml RBC原液 1.5ml H2O 150ul NaOH 沸水浴 5 待测管1： 取A液0.1ml0.9ml H2O 待测管2： 取A液0.3ml0.7ml H2O 四、Lowry法测定膜蛋白含量 立即摇匀，放置15分钟。以第管为空白管，在分光光度计上以620比色，读取 。 以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。 2.红细胞膜样品蛋白含量的测定 将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定 管号 试剂试剂 H2O (ml) 0.90.80.60.40.21.0 标标准蛋白0.10.20.40.60.8_ 碱性铜试剂铜试剂 摇摇匀，放置分钟钟 酚试剂试剂 含标标准蛋白ug25501001502000 1.标准曲线制备 作图： 横坐标以标准蛋白含量 纵坐标以A620吸光度值 图比例应为3:2（横：纵） 计算： 在标准曲线上查出待测样品的浓度，计算 提取膜的 Pr mg数/ml样品 注意稀释倍数 要求：计算原提取RBC液的Pr含量 五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量 不连续电泳系统： 电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同（浓缩效应） （一）垂直板安装 每套板两块玻璃下端 对齐，夹好，放在胶 架上！ （二）凝胶制备（见表 ） 先配好分离胶（留距 齿梳1cm），待其凝 固后，再配浓缩胶。 （三）电泳装置安装 先装内槽，试无渗漏 ； 放入外槽中，加Buffer 。 上样品： 每孔18ul，2 块/组 每块板留一标准蛋白 孔 （四） 电泳： 100V进分离胶调至 80V 约1.5小时 10分离胶 10 ml 5浓缩浓缩 胶 5ml 30凝胶储备储备 液3.31.0 蒸馏馏水4.04.0 1.5mol/L Tris-HCl Buffer 2.5 1mol/L Tris-HCl Buffer 1.0 10SDS0.10.08 10 过过硫酸铵铵0.06（60ul)0.06(60ul) TEMED8ul8ul 加入过硫酸铵，TEMED即刻灌胶。 （五）取胶: 用专用板平面轻轻“橇”开板，推入小平皿 中。 注意： 一块半干转移（浸入转移Buffer20min ） 另一块考马斯亮蓝染色 染色2小时后，7%醋酸脱色（4） 每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或 摄像保留。 分子量计算 1.测量： cm a.每条带距离 （起始点至带中心） b.起始至示踪染料距离 2. MR： 条带距离(a) MR= 起始至示踪染料距离 (b) a b 14 100 62 40 30 24 分子量 KD 迁移距离 cm MR 70 55 40 35 25 15 预染标准蛋白 3.半对数图：（六条标准蛋白） （参照统计学散点法） 横坐标为迁移率MR 纵坐标为LogM （直接按每一蛋白分子量标在半对数图中） 4.计算待测样品蛋白质分子量： 选在标准蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三 条带，测量距离计算MR，Mw 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0.1 0.2 0.3 0.4. 横坐标为迁移率MR；（六条标准蛋白） 纵坐标为LogM（直接按每一标准蛋白分子量） 20 60 100 六、western blotting(-actin鉴定) 1.转膜 将与凝胶块(切去多余部分)一般大小的NC膜、滤纸均浸入转移 Buffer中20分钟，取出，在半干转移槽中按以下顺序放置： (上）阴极端 滤纸-凝胶-膜-滤纸 阳极端（ 下） 用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。 开启电源，调电压时间20 v， 20分钟 2.封闭 将膜取出TBST中洗5，放置于封闭液中10分钟，用TBST洗53； 3.一抗孵育 将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟3； 4.二抗孵育 将膜放入已