【医学课件】免疫学检测原理及临床应用

学以致用 为了实际应用而学习。 1 免疫学检测原理及临床应用 甘瑞静 免疫学教研室 第 22 章 2 内容提要： 概念 基于抗原-抗体反应的检测方法 免疫细胞检测 免疫分子检测 免疫学诊断与检测 掌握：原理 临床应用 3 概念： 免疫学 细胞生物学 分子生物学 应用：免疫相关疾病的诊断、病情 检测和疗效评价等。 抗原 抗体 免疫细胞 细胞因子 检测 理论和方法定性 定量 4 第第1 1节节 基于抗原基于抗原- -抗体反应抗体反应 （antigen antibody reactionantigen antibody reaction） 的检测方法的检测方法 一、原理一、原理 二、反应的特点二、反应的特点 三、影响因素三、影响因素 四、基本检测方法四、基本检测方法 5 一、原理一、原理 1 1、抗原抗体反应的、抗原抗体反应的 特异性特异性 2 2、抗原抗体反应的、抗原抗体反应的 可见性可见性 抗原抗体按适当比例结合，形成抗原抗体按适当比例结合，形成 肉眼可见的现象。肉眼可见的现象。 6 应应 用用 1、利用已知抗原检测未知抗体 （1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤 寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。 （2）检测自身抗体诊断自身免疫病：SLE、类风湿 性关节炎等 2、利用已知抗体检测未知抗原 （1）鉴定病原菌：诊断疾病 （2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌 （3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定 （4）检测药物半抗原： 确认运动员是否服用兴奋剂 7 （一）抗原-抗体结合反应的特点 特异性 带现象与可见性 可逆性 取决于抗原表位与抗体高变区结 合部位空间构型的互补的程度 亲和力（亲和力（affimityaffimity） 亲合力（亲合力（avidityavidity） 8 抗原抗体结合的带现象与可见性 （一）抗原-抗体结合反应的特点 9 可逆性： （一）抗原-抗体结合反应的特点 低pH值 高浓度盐 冻融等 AgAb解离 取决于亲 和力大小 10 11 （二）抗原抗体反应的影响因素 电解质 酸碱度 温度 抗原抗体的性质 12 1.电解质： 亲水性-疏水性 失去电荷-发生凝集 （二）抗原抗体反应的影响因素 13 2、酸碱度： 最适pH值：68 假阳性 假阴性 （二）抗原抗体反应的影响因素 14 3.温度： 适当温度-增加碰撞机会 加快结合速度 37 （二）抗原抗体反应的影响因素 15 4、抗原和抗体的性质 关键因素-特异性和亲和力 决定因素-二者的比例 （二）抗原抗体反应的影响因素 16 （三） 抗原或抗体的检测方法 凝集反应 沉淀反应 补体参与的反应 免疫标记技术 17 （一）凝集反应（一）凝集反应（agglutinationagglutination） 颗粒性抗原颗粒性抗原（红细胞、细菌、（红细胞、细菌、 乳乳 胶颗粒等）与抗体特异性结合，形胶颗粒等）与抗体特异性结合，形 成肉眼可见的凝集块。成肉眼可见的凝集块。 18 1 1、直接凝集、直接凝集(direct agglutination)(direct agglutination) 2 2、间接凝集、间接凝集 （indirect agglutinationindirect agglutination） 3 3、间接凝集抑制试验、间接凝集抑制试验 （in direct agglutination inhibition testin direct agglutination inhibition test） 4 4、协同凝集试验、协同凝集试验 （co-agglutination testco-agglutination test） （一）凝集反应（一）凝集反应（agglutinationagglutination） 19 （二）沉淀反应（二）沉淀反应（precipitationprecipitation） 可溶性抗原可溶性抗原（免疫球蛋白、（免疫球蛋白、 细胞裂解物、组织浸液等）与相细胞裂解物、组织浸液等）与相 应抗体结合，应抗体结合， 形成不溶性免疫复形成不溶性免疫复 合物，出现不透明的沉淀物。多合物，出现不透明的沉淀物。多 在半固体琼脂凝胶上进行，形成在半固体琼脂凝胶上进行，形成 白色的沉淀。白色的沉淀。 20 1 1、单向免疫扩散、单向免疫扩散 （single single immunodiffusionimmunodiffusion） 常用于测定常用于测定IgGIgG、IgMIgM、IgAIgA、C3C3 、C4C4等。等。 沉淀环沉淀环 抗体混于琼脂凝抗体混于琼脂凝 胶中制板胶中制板 环的环的直径与抗原直径与抗原 含量成正相关含量成正相关 21 2 2、双向免疫扩散（、双向免疫扩散（douledoule immunodiffusionimmunodiffusion）：）：常用于抗常用于抗 原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。 22 3 3、免疫电泳（、免疫电泳（immunoelectrophoresisimmunoelectrophoresis） 对流免疫电泳(counterimmunoelectrophoresis) 23 4 4、免疫比浊法（、免疫比浊法（immunonephelomtryimmunonephelomtry）：）：快速简便。用快速简便。用 于血清于血清IgGIgG、IgAIgA、IgMIgM、 补体补体C3C3、C4C4含量测定含量测定 24 （三）补体参与的抗原抗体反应（三）补体参与的抗原抗体反应 1 1、50 %50 %补体溶血试验（补体溶血试验（CH50CH50测定）测定） 血清总补体量测定血清总补体量测定 2、补体结合试验(complement fixation test)：检测抗原或抗体。 原理：用已知的指示系统检测试验系统是否结合补体进行诊断 试验原理试验原理 ？ 检测系统：待测样品检测系统：待测样品 和已知抗原（或抗体和已知抗原（或抗体 ） 指示系统：指示系统：SRBCSRBC和溶血素和溶血素 溶血溶血阴性；不溶血阴性；不溶血阳性阳性 补体补体 25 用用标记物标记抗体或抗原标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免进行抗原抗体反应借以提高免 疫学诊断的敏感性疫学诊断的敏感性 荧光素荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿异硫氰酸荧光素（黄绿 色荧光）、藻红蛋白、色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（罗丹明（ 红色荧光）红色荧光） 放射性同位素放射性同位素 ： 125 125I I、 、131 131 I I 酶：酶：辣根过氧化物辣根过氧化物 酶、硷性磷酸酶酶、硷性磷酸酶 免疫荧光检测法（免疫荧光检测法（IFAIFA） 放射免疫检测法（放射免疫检测法（RIARIA）酶免疫检测法（酶免疫检测法（EIAEIA） （四）免疫标记技术（四）免疫标记技术 液相（液相（ELISAELISA）、）、固相（免疫组化技术）固相（免疫组化技术） 26 1、免疫荧光法 （immunofluorescence,IF） 用荧光标记抗体，再与待检标本 中抗原反应那个，所形成的抗原 抗体复合物在荧光显微镜下散发 荧光，借此对抗原进行定性和定 量。 27 间接间接ELISAELISA双抗夹心法双抗夹心法 2 2、酶联免疫吸附试验、酶联免疫吸附试验 （e enzyme nzyme l linked inked i immunommunos sorbentorbent a assay, ssay, ELISAELISA法法） 28 抗抗细胞因子的抗体包被细胞因子的抗体包被 （1 1）（2 2） （3 3） （4 4） 抗原包被抗原包被 用于效应细胞分泌的单一细胞因子的测定，也可测定分泌用于效应细胞分泌的单一细胞因子的测定，也可测定分泌 特异抗体的特异抗体的B B细胞的频数。细胞的频数。 29 BAS-ELISABAS-ELISA法法（ biotin-biotin-avidinavidin-system-system，生物素生物素- -抗生物素抗生物素 系统系统-ELISA-ELISA法）：敏感性更高。用于抗原抗体以及法）：敏感性更高。用于抗原抗体以及DNADNA 、RNARNA的检测。的检测。 卵白及某些微生物中的蛋白质 30 3、免疫组化 (immunohitochemistry) 应用标记的抗体与组织或细胞抗 原反应，借助形态学观察，对组 织或细胞表面抗原进行定性、定 量、定位检测。 31 4、放射免疫测定法 （radioimmunassay,RIA） 用发射性核素标记抗体或抗 原进行免疫学检测。 32 5、化学发光免疫分析 （chemiluminescence immunoassay） 将发光物质标记抗原或抗体，发光 物质在反应剂激发下生成激发态中 间体，当回复至稳定的基态时发射 光子，通过自动发光分析仪测定管 子参量，可反应样品中抗体或抗原 含量。 33 6、免疫印记法 （immunoblotting） 又称western 印记法：结合凝胶电泳和固 相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白 质转移至固相载体，在应用酶免疫、放 射免疫等技术进行检测。 34 第第2 2节节 免疫细胞检测免疫细胞检测 机体免疫功能状态的重要指标 免疫细胞来源-外周血 35 （一）免疫细胞及其亚类计数 1 1、淋巴细胞的分离：外周血葡聚、淋巴细胞的分离：外周血葡聚 糖糖- -泛影葡胺密度梯度离心法泛影葡胺密度梯度离心法 白膜层白膜层 单核细胞单核细胞 淋巴细胞淋巴细胞 B B T T 吸附分离吸附分离 过尼龙毛柱分离过尼龙毛柱分离 36 （1）尼龙棉柱分离法 B细胞滞留与柱上 T细胞流出 （2）E花环分离法 成熟人T细胞表面有CD2，绵羊红细 胞的受体 2 2、淋巴细胞亚群的分离、淋巴细胞亚群的分离 37 （3）洗淘法（panning） （4）流式细胞仪（flowcytometry,FCM） （5）磁珠分离法： 用抗CD4交联的微珠可将T细胞 中的CD4+T细胞与CD8+T细胞分。 38 3、淋巴细胞亚群计数 免疫荧光计数 微量细胞毒试验 39 （二）淋巴细胞功能测定（二）淋巴细胞功能测定 1 1、测定淋巴细胞功能的体外试验、测定淋巴细胞功能的体外试验 （1 1）T T细胞增殖试验（淋转）细胞增殖试验（淋转）： 丝裂原、抗丝裂原、抗CD3CD3单克隆抗体等能非特异单克隆抗体等能非特异 地激活地激活T T细胞，使之发生转化增殖，计细胞，使之发生转化增殖，计 算淋巴母细胞转化率（正常值算淋巴母细胞转化率（正常值6580%6580% ） 40 1 1、细胞增殖试验具体方法、细胞增殖试验具体方法 形态学观察法形态学观察法 3 3 H-TdRH-TdR渗入法：用液体闪烁仪测定样渗入法：用液体闪烁仪测定样 品的品的 射线放射活性射线放射活性 MTTMTT法法 41 检测检测CTLCTL、NKNK、 LAKLAK、 TILTIL细胞杀伤靶细胞的功能细胞杀伤靶细胞的功能 51Cr51Cr释放法释放法 乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法 细胞凋亡检查法：细胞凋亡检查法：TUNELTUNEL法（法（TdTTdT dependent dependent dUTPdUTP-biotin nick end labeling-biotin nick end labeling ）、）、FACSFACS测定法测定法 （2 2）淋巴细胞介导的细胞毒试验）淋巴细胞介导的细胞毒试验 （LMCLMC） 42 （3）分泌功能测定 检测细胞因子分泌细胞 检测抗体形成细胞 2、测定淋巴细胞功能的体内试验 结合菌素试验迟发型超敏反应 43 迟发型超敏反应：迟发型超敏反应：旧结核菌素试验（旧结核菌素试验（ OTOT试验试验 ） 皮试（皮试（+ +）有一定的细胞免疫能力有一定的细胞免疫能力 皮试（皮试（）细胞免疫功能缺损细胞免疫功能缺损 44 第第3 3节节 免疫分子检测免疫分子检测 （一）免疫球蛋白测定 1、体外用已知抗原检测相应抗体 2、用已知抗体定性、定量测定各 类免疫球蛋白 45 （二）补体测定 免疫比浊法 ELISA RIA 46 （三）细胞因子检测 1. 1.免疫学测定法免疫学测定法 鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾 病状态的细胞免疫功能。病状态的细胞免疫功能。IL-2、IL-2R、 rIFN 、TNF等检测 ELISAELISA法法 生物活性测定法生物活性测定法 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCRPCR）法）法 47 （三）细胞因子检测 2.生物活性测定法 原理：不同细胞因子具有特定 的生物学活性，借助相应指示系 统与之反应，从结果得知细胞因 子的活性 48 2.生物活性测定法 促进细胞增殖和增殖抑制法 抗病毒活性测定法 直接杀伤法 趋化活性测定法 3.分子生物学测定法 PCR 49 （四）CD分子、表面受体和粘 附分子的测定 （五）HLA分型 50 第23章 免疫学防治 免疫学预防 免疫学治疗 51 （一）人工主动免疫 （artificial active immunization） 用疫苗、类毒素接种机体， 使之产生特异性的免疫，从而预 防感染的措施。 一、人工免疫一、人工免疫 免疫预防免疫预防 52 人工主动免疫 常用制剂疫苗、类毒素 死疫苗（灭活疫苗）是选用免疫原性强 的病原体，经理化方法使其失去活力制备而成的 疫苗。伤寒菌、百日咳杆菌、霍乱弧菌、钩端螺 旋体、流感病毒、狂犬病病毒、乙脑病毒疫苗均 为灭活疫苗。 减毒活疫苗：是用减毒或无毒力的 活病原体制成的疫苗。脊髓灰质病毒、卡介苗、 麻疹病毒疫苗是常用的减毒活疫苗。 类 毒 素：细菌外毒素经甲醛处理后 ，失去毒性而保留其免疫原性即为类毒素。常用 的类毒素有破伤风类毒素、白喉类毒素等。 53 死疫苗和活疫苗的比较 死死疫苗疫苗活活疫苗疫苗 接种途径接种途径多多采取皮下注射采取皮下注射 多多为为为为模模拟拟拟拟自然感染途自然感染途 径、少数径、少数经经经经皮下注射皮下注射 接种接种剂剂剂剂量量较较较较大大较较较较小小 接种次数接种次数二次或二次或多次多次一般一般 只需一次只需一次 免疫效果免疫效果较较较较差差可靠可靠 免疫力免疫力维维维维持持时时时时 间间间间 数数月月11年年长长长长达达3535年以上年以上 疫苗保存疫苗保存易于保存易于保存不易保存不易保存 不良反不良反应应应应较较较较大大较较较较小小 制品制品类类类类型型可可多种疫苗混合使用多种疫苗混合使用一般一般单单单单独使用独使用 54 （二）新型疫苗 亚单位疫苗 乙肝表面抗原制备乙肝疫苗 结合疫苗 合成肽疫苗 基因工程疫苗 （三）核酸疫苗 55 人工被动免疫 是给人体注射含特异性抗体的免疫 血清或细胞因子等制剂，以治疗或紧急 预防感染疾病。人工被动免疫力维持的 时间短，约23周。常用制剂有： 抗毒素 人免疫球蛋白