药学专业毕业论文 外文翻译_8

本科毕业论文(设计)外文翻译学 院 专 业药学姓 名 学 号 指导老师 职 称 合作老师职 称外文题目（原文）High-level expression and purification of Tat-haFGF19-154译文：高表达和纯化的Tat-haFGF19-154High-level expression and purification of Tat-haFGF19-154Yadong Huang, Yulan Rao, Chengli Feng, Yanmei Li, Xiaoping Wu, Zhijian Su,Jian Xiao, Yechen Xiao, Wenke Feng, Xiaokun Li摘要：人的酸性成纤维细胞生长因子在各种组织损伤后能够刺激修复和再生中央和周围神经,然而，它不能穿过血脑屏障。为了生产具有细胞渗透性的治疗性的酸性成纤维细胞生长因子，我们用Tat-PTD技术融合haFGF19-154基因。在这之后用PCR技术扩增编码序列，使pTathaFGF19-154-His在大肠杆菌BL21中得以表达。最佳表达的可溶性融合蛋白超过了总细胞蛋白的36.7%。Tat-haFGF19-154-His的重组体被具有NiNTA活性，葡聚糖凝胶G-25和肝素亲和的色谱柱组合体纯化95%。这数据用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺酰胺凝胶电泳检测得到，最终产率为171 mg/l培养物。纯化的Tat-haFGF19-154-His具有在Balb/c3T3细胞中不同的有丝分裂促进活性，用MTT法测量它的半数有效量为3.931104 mol/l。Tat-haFGF19-154-His的蛋白以每剂量为10 mg/kg静脉注射在大脑皮层和海马中检测得到。关键词： 酸性成纤维细胞生长因子；Tat-PTD表达；纯化；有丝分裂促进活性前言人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）是一个有力的广谱促细胞分裂剂。体外研究显示酸性成纤维细胞生长因子能刺激细胞生长过程中对胚层和神经外胚层来源（Gimenez-Gallegoand Cuevas 1994）的影响。奎瓦斯等在1997年到1998年间发现，酸性成纤维细胞生长因子具有内分泌类的活动，可以作为一个血管扩张，内脏缺血的保护者，调节神经。酸性成纤维细胞生长因子在神经生长和发展中起着举足轻重的作用。以往的研究表明，酸性成纤维细胞生长因子在海马，纹状体和下丘脑神经细胞增殖的同时增强生存能力和刺激睫状视网膜神经节以及刺激周边神经元。这是1988年立顿等人和1991维尔科克厮等人所证明的。haFGF能够促进神经上皮细胞迁移和规范对脑神经祖细胞的分化和促进修复和再生有伤的中枢和外周神经，之后还能营养作用神经元。这是英杰和博恩在1992年及纳曼在1996年所证明的。外源性的haFGF具有以衰减最初的毒物的可创性和持续时间来减轻海马细胞的消亡和神经元细胞的消亡 (Cuevas et al. 1994; Cuevas and Gimenez-Gallego 1996)。haFGF有效保护了由脑缺血所引起的损害海马锥体细胞的CA1(Sasaki et al. 1992)。对神经系统的这些作用表明在治疗如毒物(Jankowsky and Patterson 2001)、帕金森氏病、脑缺血(Sasaki et al. 1992)以及大脑皮质损伤(Figueiredo et al. 1995)等多种疾病时存在一定的潜力(Date et al. 1990; Alexi et al., 2000)。事实表明，上述疾病的动物模型试验显示haFGF有良好的治疗效果。在跨越血脑屏障（BBB）的治疗性蛋白质交付限制其规模和生物化学特性。具有154个氨基酸的haFGF蛋白质，不能直接穿过血脑屏障从循环，但可以通过脑内注射入脑室(Li et al. 1998; Mufson et al. 1999)，渗透性开放的血脑屏障(Rapoport 2000; Emerich et al. 2001)或病毒载体(Federoff et al.1992). 不过，脑内注射可能会损害大脑组织，引起感染。开放是选择性渗透，不可能允许进入大脑的其他物质进入。基因治疗有经验的低效配置和较低的长期蛋白的表达。因此，aFGF对中枢神经系统疾病的治疗在临床方面还受到严重的限制。近年来，新的战略已经发展为加强血脑屏障的通透性(Schwarze et al. 1999;Bayley 1999; Dietz et al. 2006; Yin et al. 2006)。一种方法是融合靶蛋白和穿膜肽细胞(CPPs)，如Tat-PTD，控制触角基因的蛋白，单一的疱疹病毒-1VP22,卡波西氏的成纤维生长因子信号序列(Bayley 1999; Dietz et al. 2002)。Tat-PTD，来自艾滋病毒反式转录激活（TAT）获得的9或11个氨基酸片段，与各种蛋白质进行融合后运送到大脑(Elliott and OHare 1997)。到目前为止，几个TAT融合蛋白，如PTD-Bcl-xL, PTD-GDNF, PTD-tyrosine hydroxylase,PTD-calpastatin, and PTD-SOD，已被证明具有穿越血脑屏障的疗效并有治疗作用。在脑疾病实验模型(Cao et al. 2002; Kilic et al. 2003; Sengoku et al. 2004; Kim et al.2005; Dietz et al. 2006; Yin et al. 2006; Wu et al. 2006).这项研究中，我们对haFGF19-154和Tat-PTD 49-57与蛋白进行融合后在大肠杆菌中高效表达和纯化成接近同质。纯化的融合蛋白具有明显的促进有丝分裂活性，并能够跨越血脑屏障。材料和方法试剂限制性内切酶Nde I and BamH I购买来自Invitrogen公司(Carlsbad, CA, USA)；标准haFGF(haFGF19-154)购自广州维佳（广州,中国）；质粒pET - haFGF19 - 154，表达载体pET3c和大肠杆菌菌株BL21（DE3）获得来自生物医药研究开发中心济南大学；Ni-NTA琼脂糖是从Invitrogen公司（美国）；CM琼脂糖和肝素-琼脂糖由GE医疗保健公司(Piscataway, NJ, USA)；引物合成由上海生工（上海，中国）；兔抗多克隆抗体，从武汉博士德生物工程有限公司（武汉，中国）购买。构建Tat-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His表达载体这Tat-haFGF19-154-His互补DNA被放大由质粒pET-haFGF19-154由标准聚合酶链反应是由正向引物F1(5-GGAATTCCATATGCGCAAAAAACGTCGTCAGCGTCGCCGTGCTAACTACAAG-3) 和反向引物R(5-GCAGATCTTTAGTGATGATGATGATGATGATCAGAAGAAACTGGCAA-3)。正向引物F1和反向引物R分别包含NdeI and BglII 位点一种近似的465碱基扩增片段被NdeI and BglII切断然后再将其克隆到pET3c表达载体,这载体是先前已经与被NdeI和BamHI酶切消化，建立相应的表达载体pTat-haFGF19-154-His。另一种表达载体pTat-haFGF19-154-His，它是通过相同的程序产生上述使用正向引物F2(5-GGAATTCCATATGGCTAACTACAAGAAGCCAAAGTTG-3)和反向引物R.插入基因的精确度通过自动化的DNA序列测定所证实的。Tat-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His的诱导和表达Tat-haFGF19-154-His and haFGF19-154-His被表达如下：单一转化菌落在4毫升中型的LB（10g蛋白胨,10g酵母提取物,5g氯化钠溶入到1升的去离子水中）培养基，培养基中包含100 g/ml氨苄西林和1%葡萄糖且在37C转速为250转摇动培养.经过隔夜培养，100l的培养物被转移到50毫升新鲜的不包含葡萄糖的LB培养基中,为了达到指数生长，就是当OD600值达到0.6，异丙基-D-半乳糖硫吡喃糖苷类（IPTG)被增加到0.4 mmol/l终浓度。培养物培养在37C和220转动6个小时Tat-haFGF19-154-His 和haFGF19-154-His被十二烷基钠硫酸盐聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)，和他们表达水平被光密度计扫描器分析出来。为haFGF19-154-His达到纯化的目的,培养物被放大到1.0升的培养基里。Tat-haFGF19-154-His的发酵10微升种子菌株BL21（DE3）中有pTat-haFGF19-154-His表达质粒，它是培养过夜的50毫升LB培养基中有100g/ml氨苄青霉素（约12-14小时;在220 rpm, 37C下旋转）。接着，10毫升的过夜培养基接种到新鲜的200毫升LB培养基中,培养基中含有100g/ml氨苄青霉素和在220 rpm, 37C下摇床培养，当OD600值达到1.0，培养物被转变为一个5升发酵罐包含3升的LB培养基,在这之后OD600达到20。IPTG被增加到培养基中含有0.4 mmol/l.终浓度.诱导过程持续了5小时,细胞通过离心5分钟（时速为13,523g在温度为4C）来收集。然后片状样的细胞被悬浮在20 mmol/l冰冷的包含5 mmol/l EDTA (PBS)缓冲溶液当中。悬浮液在冰冷器中超声处理然后离心30分钟在转速为30,427g温度为4C。片状沉淀物被清除，上清液被进一步纯化。Tat-haFGF19-154-His的纯化细胞裂解物被用于一个匀称的NiNTA柱中含有20 mmol/l PBS buffer。用500毫升的洗涤剂缓冲溶液I (20 mmol/l PBS containing 10 mmol/l imidazole and 150 mmol/l NaCl, pH8.0)清洗树脂至到OD280价值达到基线。洗涤剂缓冲溶液II (20 mmol/l PBS containing 20 mmol/l imidazole and 150 mmol/l NaCl, pH 8.0)被适用于洗涤非特异性蛋白。最后，这个6xHis的标记融合蛋白被洗脱液(20 mmol/l PBS containing 300 mmol/l imidazole and additional 150 mmol/l NaCl, pH 8.0)清洗。这碎片包含了融合蛋白被用于一个Sephadex G-25均衡柱中含有0.6 mol/l 氯化钠的20 mmol/l PBS buffer (pH 7.4)片段被混合，用一个匀称的heparinSepharose柱由上述的洗涤液来洗涤。凝结蛋白被含有1.2 mol/l 氯化钠的20 mmol/l PBS (pH 7.4)的缓冲溶液清洗。净化的融合标记蛋白用使用SDS-PAGE来评定，然后浓聚物依靠布拉德福德的方法。这免疫反应性融合标记蛋白被蛋白印迹法来检查。纯化的Tat-haFGF19-154-His冻干，然后储藏在零下70C.。Tat-haFGF19-154-His细胞增殖活性的分析Tat-haFGF19-154-His重组体的能力，他以加速对用（MTT）比色法对Balb/c 3T3细胞增殖来检测计量。Balb/c 3T3细胞用0.25胰蛋白酶消化和用成96孔板（7,000 /孔）接种。细胞用RPMI 1640补充有10%胎牛血清，100 U/ml氨苄青霉素，和100 U/ml链霉素在37C下培养24个小时和此后再在含有0.4%胎牛血清的培养基培养24个小时。这些细胞比新鲜的培养基中含有不同Tat-haFGF19-154-His，haFGF19-154-His ，野生型haFGF的浓聚物。经过24-48 小时的培养，细胞在100微克的每个MTT套管 中培养4个小时。该培养基被移除，然后150l的二甲基亚砜加入到每孔。经过30分钟在室温下孵化，存活细胞的数量立即通过测量在570 nm处的吸光度来估计。实验重复五次。免疫组织化学分析配制haFGF19-154-His (1 mg/ml) 和 Tat-haFGF19-154-His(1 mg/ml在 0.9% 盐溶液)溶液，然后储藏在零下20C，总重105克的小鼠（雄的202克，广东医药实验动物中心）分成3小组（每35克一组）。两组老鼠分别由尾静脉注射入剂量为10 mg/kg aFGF19-154-His 和 Tat-haFGF19-154-His的溶液。第三组老鼠注射相同量0.9%的盐溶液，老鼠被麻醉之后移除它们的大脑在30分钟，1个小时，2个小时，4个小时，8个小时，12个小时和24个小时在服用药物之后（5只老鼠每个时间点）。脑组织固定在4低聚甲醛溶液在4 C和用免疫组织化学分析。阳性的细胞数量在显微镜下能被计算出来。在显微镜下随机挑选十个视野，和在100个细胞中平均阳性细胞的数量来决定的。正染色的缺少被视作消极结果。图1. 图解Tat-haFGF19-154-His和控制haFGF19-154-His融合蛋白图2. E.coli BL21(DE3)/ TAT-HA-aFGF14-154工程菌的发酵与纯化结果构建和表达重组体Tat-haFGF19-154-HishaFGF的全长由154氨基酸组成。即使N末端首位的氨基酸被删除在稳定性和生物学的haFGF形式上也没有显著的差别 (Luo et al. 1996; Imamura et al. 1990)。为了生产出具有细胞渗透性的haFGF19-154融合蛋白，一个具有Tat- haFGF19-154-His的基因表达型载体被构建，一个没有Tat域重组质粒也被做为构建以此来对照（图1）。当培养物达到中间对数期生长时，包含Tat- haFGF19-154-His或者haFGF19-154-His的E. coli细胞在0.4 mmol/l IPTG的诱导下使两个融合蛋白在溶液里表达(the 17.3-kDa Tat- haFGF19-154-His and 16.0-kDa haFGF19-154)。大约在5个小时诱导之后总计表达重组体Tat- haFGF19-154-His占总细胞蛋白的36.7%（图2）。图3. 用Ni-NTA亲和色谱在E. coli表达的纯化Tat-haFGF19-154-His。在Ni-TNA树脂上应用细胞裂解物，能被不同的咪唑和浓缩的氯化钠泳道分子技术洗脱纯化和鉴定重组体Tat-haFGF19-154-His在发酵之后，离心和溶解细胞并收集。细胞裂解物被用于一个NiNTA亲和柱。缺少6xHis标记的蛋白质用含10 和20 mmol/L咪唑的硫酸缓冲溶液的NiNTA树脂，和包含TathaFGF19-154-His片段洗脱使用包含300 mM imidazole的PBS（图3）。通过葡聚糖凝胶G-25和琼脂糖肝素的组合体亲和色谱柱进一步纯化。Tat-haFGF19-154-His的纯度比用光密度测定的95% 银染SDS-PAGE 凝胶还要高（图4）。表1是概述纯化的结果。纯化的Tat-haFGF19-154-His重组体的最终产率大约为171 mg/1的培养物。蛋白印迹法显示纯化的TathaFGF19-154-His和haFGF19-154-His是经过6xHis的抗体验证的（图4.）。图4 . SDS-PAGE和蛋白印迹分析的关于纯化的TathaFGF19-154-His和对照的haFGF19-154-His融合蛋白。左侧着银色的是SDS-PAGE凝胶，右侧是用抗-6xHIS抗体的蛋白印迹。利用泳道分子技术，第一泳道是纯化的TathaFGF19-154-His，第二泳道是纯化的haFGF19-154-His。图5 野生型haFGF、haFGF19-154-His和Tat-haFGF19-154-His在Balb/c 3T3细胞上的促有丝分裂的影响。表1. 对Tat-haFGF19-154 在E.coli中表达纯化的综述Tat-haFGF19-154-His重组体促进有丝分裂活性由MTT分析法得知，纯化的Tat-haFGF19-154-His的促进有丝分裂的活性比类似的野生的haFGF19-154-His低（图5）。这个减少的合理解释可能是部分Tat-haFGF19-154-His被Tat-PTD和不能互相影响在细胞表面的纤维母细胞受体直接陷入。这个机理的提出是通过成纤维细胞生长因子的功能。图6测定关于在在玻璃体内大脑皮层和海马的Tat-aFGF19-154-His。利用抗6xHis的抗体采用免疫组织化学的方法在玻璃瓶内对有aFGF19 - 154(a, c)和Tat-aFGF19-154-His(b, d)的细胞给予八小时。红色箭头表示的是标准的阳性染色。A和B代表海马检测。C和D代表大脑皮层检测。Tat-haFGF19-154-His 的融合蛋白转导入大脑来测定纯化的Tat-haFGF19-154-His 是否能够通过血脑屏障，由尾静脉单剂量10 mg/kg Tat-haFGF19-154-His注射入小老鼠。Tat-haFGF19-154-His融合蛋白在注射8小时之后用免疫组织化学法测定到分布在大脑皮层和海马当注射具有可控蛋白的haFGF19-154-His和生理盐水时，没有阳性的免疫染色不是在海马(图6a)就是在大脑皮层（图6c）中被找到。讨论酸性成纤维因子是一的强大的促细胞分裂剂和有效的营养因子。外源的酸性成纤维因子已经被证明可以在体内预防许多大脑区域的神经元退化和细胞凋亡(Date et al. 1990;Sasaki et al. 1992; Cuevas et al. 1994; Figueiredo et al.1995; Cuevas and Gimenez-Gallego 1996; Alexi et al.2000; Jankowsky and Patterson 2001).。血脑屏障不仅阻碍大脑药物的发展，而且是限制神经病疗法发展的最重要因素(Schwarze et al. 1999).一个穿膜肽细胞，Tat-PTD，被融合到各种目的蛋白上，这是一种已经被广泛使用的把药物传递到大脑的方法(Cao et al. 2002; Kilic et al. 2003; Sengoku et al. 2004; Kim et al. 2005; Dietz et al. 2006; Yin et al. 2006;Wu et al. 2006)。在目前的研究中显示TathaFGF19-154的融合蛋白能够在E. coli细胞内高度的表达和有效的纯化。纯化蛋白被证明能够促进Balb/c 3T3细胞在体内的增殖和在体内穿过血脑屏障。Tat-haFGF19-154-His融合蛋白通过三步色谱层析法纯化。Ni-TNA金属亲和层析技术可以用来从细胞裂解液中提取融合蛋