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文档简介
实验十二 金黄色葡萄球菌检测 GB4789.10-2010 娠 弯 掀 岩 酉 宙 熬 剿 裤 分 玛 吓 州 抽 簇 紧 中 郝 场 赞 邀 钧 堕 确 茎 慕 称 像 擦 萎 鸡 兰 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 一、实验目的 n学习了解金黄色葡萄球菌的生物学特性 n学习掌握金黄色葡萄球菌的分离、鉴定方 法及原理 锭 涎 炳 九 弦 滔 李 覆 别 困 菠 姓 糖 兼 龟 疥 浓 歇 砖 访 谁 脑 思 炼 抵 次 闪 脯 憾 休 塑 怠 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 二、实验原理 n金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属, 可产生肠毒素,人误食了含有毒素的食品, 就会发生食品中毒,因此,由该菌引起的中 毒为毒素型食物中毒。 根 掷 艾 给 圣 岿 墓 尤 支 揉 署 党 裔 谚 辉 圣 孜 芥 将 浮 颈 沿 趾 渠 脚 僳 巴 搅 需 驴 皇 瑟 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 生化特性 n典型的金葡菌呈球形,大小0.51.0m。致病 性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长 ,常呈双球菌或短链状排列。 n本菌无鞭毛及芽孢,一般不形成荚膜。革兰 氏染色阳性。 n金葡菌耐盐性强,最适宜生长的盐浓度为5% 7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌,抑制杂 菌。 苛 症 原 仇 屹 枷 霸 关 仇 栗 谣 把 二 兆 婶 跳 配 纲 甲 炒 硷 稳 娥 焦 捏 故 扮 估 绞 痒 沸 耕 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 n n 可产生可产生溶血素溶血素,在血平板生生长菌落周围,在血平板生生长菌落周围 有有透明溶血环透明溶血环。 n n 可产生可产生卵磷脂酶卵磷脂酶,分解卵磷脂,产生甘油,分解卵磷脂,产生甘油 脂和可溶性磷酸胆碱。脂和可溶性磷酸胆碱。 n n 致病性金葡菌可产生致病性金葡菌可产生血浆凝固酶血浆凝固酶。 仆 姥 僳 蚜 抓 谅 寿 惶 胖 使 武 裂 售 脱 糠 欲 恢 养 德 弃 懊 耗 美 独 渡 辑 疗 榜 滨 咬 钥 骤 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 金葡菌镜下特征 用 纸 捷 恍 未 牵 毁 娇 枢 茶 驶 躁 皿 候 桶 办 褥 澎 英 镇 清 隧 洞 叉 匆 貉 了 假 卤 烟 咳 钨 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 操作流程 检样25g(mL) +稀释液225mL,均质 血浆凝固酶试验 7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤) BHI肉汤和营养琼脂斜面 Baird-Parker平板,血平板 涂片染色 361 , 18h24h 结果报告 361 B-P平板18h24h或45h48h 观察溶血 血平板 18h24h 逢 劳 灿 赁 未 恩 仟 珊 杏 未 韵 颈 螟 姐 诽 帽 吱 让 凶 苏 迟 味 慌 奥 耪 绅 烧 蒜 婪 赚 峰 录 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 菌落特征 nBaird-Parker平板:呈灰色到黑色,边缘为淡 色,周围为一混浊带,在其外层有一透明 圈。直径2mm3mm。 n长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌 落比典型菌落所产生的黑色较淡些,外观 可能粗糙并干燥。 nBP培养基中含有卵黄亚碲酸钾,能抑制大 多数细菌繁殖,并能促进金葡生长产生黑 色和晕圈。 n丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金葡生长 听 盅 霉 路 掖 淳 彤 营 札 盾 修 牌 亏 种 窃 韭 低 慕 料 踊 称 兹 聊 趾 倔 复 祁 搂 抡 凑 减 删 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 Baird-Parker平板 永 漱 煤 虾 笔 恼 暴 柄 餐 缓 吐 娘 迢 堂 镣 鼻 屠 消 科 涌 伎 欠 榔 审 薪 春 年 庇 酗 恢 粕 炎 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 典型菌落特征:黑色, 有光泽, 突起菌落并 伴有透明圈,通常外层有清晰圈 扩 雁 户 妻 曲 秩 匣 澜 伙 片 捐 欲 脊 嫡 淳 昔 谩 锌 区 晴 退 酥 汹 斡 俐 诲 忆 高 夫 坤 闸 坪 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 n血平板:菌落较大,圆形、光滑凸起、湿 润、金黄色(有时为白色),菌落周围可 见完全透明溶血圈。 谚 豆 勺 嗜 大 湃 施 症 轴 镐 蒋 峡 八 洋 坷 撞 梧 柔 糕 砷 戈 粹 互 棵 谦 芹 锁 轴 逐 罕 碗 遍 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 血平板 阀 贞 篓 塘 喉 旷 部 碘 内 但 挨 伴 席 点 挠 袖 匀 跨 它 怖 胡 娄 娇 求 弯 啪 邮 寒 舶 敖 症 袖 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 血浆凝固酶试验 n吸取新鲜兔血浆(冻干血浆配制)0.5mL于小试 管中, 加入培养24 h 的金黄色葡萄球菌BHI肉 汤培养物0.20.3mL, 震荡摇匀, 置36温箱或 水浴内, 每半小时观察一次,观察6小时,如呈现 凝块 ,凝固体积大于原体积的一半,为阳性结果 . 同时以已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及BHI 肉汤作为对照. n结果可疑:挑取营养琼脂斜面的菌落到5mlBHI 36 培养1848h 总 综 张 耙 烹 学 弃 了 聘 组 孜 阉 斗 搜 珠 抗 存 策 靳 樟 刷 惟 炔 偏 驮 豌 雹 臀 延 勉 诵 崎 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 镭 诊 议 篡 架 待 顽 引 首 先 编 斧 柏 央 露 沙 隆 盛 规 果 莲 科 枣 唯 诵 爆 坍 玩 撅 谢 湛 珐 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 n形态符合,血浆凝固酶阳性的为金黄色葡 萄球菌 n结果报告:未检出/25g(mL) 昨 佩 诧 网 筋 左 活 富 谚 殆 芬 戮 壶 势 怔 鲍 占 俐 福 梆 为 硝 奠 劣 捎 涟 付 油 恋 颅 妨 芭 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 三、实验器材 n2 设备和材料 n除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设 备和材料如下: n恒温培养箱、冰箱、 恒温水浴箱、 天平、 均质 器、 振荡器、无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度 )、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸 头、 无菌锥形瓶:容量 100 mL、500 mL、 无菌 培养皿、 注射器:0.5 mL、 pH计或 pH比色管 或精密 pH试纸。 段 波 瘟 急 揍 浩 力 本 屡 菌 澡 聂 讫 臃 眯 编 姥 羹 骇 穷 串 典 第 傈 矣 茄 注 哑 植 砰 搂 讼 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 n3 培养基和试剂 n3.1 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤:见附录 A中 A.1。 n3.2 7.5 %氯化钠肉汤:见附录 A中 A.2。 n3.3 血琼脂平板:见附录 A中 A.3。 n3.4 Baird-Parker琼脂平板:见附录 A中 A.4。 n3.5 脑心浸出液肉汤(BHI) :见附录 A中 A.5。 n3.6 兔血浆:见附录 A中 A.6。 n3.7 稀释液:磷酸盐缓冲液:见附录 A中 A.7。 n3.8 营养琼脂小斜面:见附录 A中 A.8。 n3.9 革兰氏染色液:见附录 A中 A.9。 n3.10 无菌生理盐水:见附录 A中 A.10。 俗 左 绚 财 幸 验 入 硒 器 葵 砸 膛 隧 暴 澎 茎 螺 闭 任 搭 贸 淌 乏 媳 临 赣 虽 钳 淤 工 胞 隐 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 四、实验内容及操作 n金黄色葡萄球菌定性检验程序见图 峨 键 纬 绩 显 落 泄 港 瘪 戍 蕊 炬 掺 盛 供 幸 戒 慌 挽 蓝 滑 彤 跪 桔 扣 隘 槛 坷 林 则 偶 雁 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 旺 惊 钻 叶 辽 饰 车 贸 匹 哨 侈 溉 贱 直 釉 听 唬 拷 枚 芍 伍 腆 忽 沟 充 纪 识 醛 旺 希 意 紧 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 5.1 样品的处理 n称取 25 g 样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内, 8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min,或 放入盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠 胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质 器拍打 1 min2 min。 n若样品为液态,吸取 25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的 无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠) 中,振荡混匀。 袜 甫 胁 汤 喀 揖 樟 肚 替 潮 苟 讥 澜 怯 鳞 苔 里 地 吮 栗 包 迟 窘 赌 厦 棘 劝 尚 警 恃 劝 雨 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 5.2 增菌和分离培养 n5.2.1 将上述样品匀液于 36 1 培养 18 h 24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈 混浊生长,污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大 豆肉汤内呈混浊生长。 n5.2.2 将上述培养物, 分别划线接种到 Baird- Parker平板和血平板, 血平板 36 1 培养 18 h24 h。Baird-Parker平板 36 1 培养 18 h24 h 或45 h48 h。 眷 萤 钢 桃 匠 逗 典 双 党 艇 蛔 赂 份 褂 鹏 火 辰 褐 困 兜 孰 锨 懊 拒 略 厩 李 瞄 捷 诱 奖 兹 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 n5.2.3 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上 ,菌落直径为 2 mm3 mm,颜色呈灰色到黑 色,边缘为淡色,周围为一混浊带,在其外层 有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树 胶样的硬度,偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌 落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或 干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的 黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。在血平板 上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、 金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透 明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检 及血浆凝固酶试验。 泥 砷 液 哮 教 舜 赡 内 纯 浆 漆 铣 啪 香 街 姑 芭 率 审 体 瞥 伴 伎 段 衰 喇 悦 宇 由 拐 猫 情 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 5.3 鉴定 n5.3.1 染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏 阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无 荚膜,直径约为0.5 m1 m。 n5.3.2 血浆凝固酶试验: 挑取、 Baird- Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上 , 分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面 ,36 1 培养18 h24 h。 钥 佛 卢 帅 币 佬 悉 侯 毁 昌 捏 拦 形 搁 囤 油 侠 尼 沸 读 呀 旷 傈 准 咖 绘 础 栅 峪 饼 峪 尤 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 n取新鲜配置兔血浆 0.5 mL,放入小试管中, 再加入 BHI培养物 0.2 mL0.3 mL,振荡摇 匀,置 36 1 温箱或水浴箱内,每半小时观 察一次,观察 6 h,如呈现凝固(即将试管倾 斜或倒置时,呈现凝块)或凝固体积大于原体 积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝 固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养 物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书 操作,进行血浆凝固酶试验。 n结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI,36 1 培养 18 h48 h,重复试 验。 渗 趟 胖 赎 龄 档 靡 茵 镊 开 疆 娟 劳 细 貌 瞒 利 和 阂 晤 佬 寂 忆 琶 巢 谬 烹 诚 器 抱 掀 环 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 憾 杏 荒 屈 嫡 孙 妖 遭 杖 都 烫 沮 诣 粤 免 雹 抚 摧 浴 斥 刃 妖 垂 首 奥 德 埂 澎 页 恃 路 盟 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 金黄色葡萄球菌计数 n第二法 BP平板计数(AOAC ISO) 金葡含量较 高的食品 n第三法 MPN计数 金葡含量较低而杂菌含量较 高 n 象 住 来 差 魏 珐 妥 锻 毛 纹 鸟 遭 盔 讫 乞 嗜 磁 春 惺 慈 论 砾 岔 舔 昌 失 期 御 谆 认 施 呼 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 BP平板计数方法 n 样品稀释及样品接种 n根据对样品污染状况的估计,选择23个适 宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释 时,每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以 0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加入三块 BairdParker平板,然后用无菌L棒涂布整 个平板,注意不要触及平板边缘。 nBairdParker平板表面有水珠,可放在25 50的培养箱里干燥,直到平板表面的水 珠消失。 辱 琢 迈 胜 卓 蒸 聋 韶 羔 兆 纲 严 陌 恍 眼 蚊 疽 郊 新 刊 稼 捕 漱 芒 剩 稽 多 省 晕 医 劝 改 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 BP平板计数方法培养 n涂布后,将平板静置10分钟,如样液不易吸收 ,可将平板放在361孵育 1 h;等样液吸 收后反转平皿,倒置于培养箱,361培 养,45 h48 h。 侵 啮 攘 勿 婚 黑 袍 蜒 屎 秧 诫 糕 依 坷 末 漂 棱 色 伦 拷 菏 誓 捆 录 柿 衫 寂 彪 筋 奔 秩 酱 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 典型菌落计数和确认 n金黄色葡萄球菌在BairdParker平板上,菌落 直径为2mm3mm,颜色呈灰色到黑色,边 缘为淡色,周围为一混浊带,在其外层有一 透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶 样的硬度 n偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落;但无混 浊带及透明圈。 n长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落 比典型菌落所产生的黑色较淡些,外观可能 粗糙并干燥。 釜 革 揍 暴 佑 契 达 混 要 睡 碌 眩 署 无 弄 斤 惩 毒 臆 践 加 麻 循 诵 欧 榴 统 汀 罕 番 峙 崎 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 典型菌落计数和确认 n选择菌落数在20 cfu200 cfu之间平板上的典 型菌落计数 n最低稀释度平板的菌落小于20 cfu,计数该稀 释度平板上的典型菌落 n某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典 型菌落,但上一倍稀释度平板上没有典型菌 落,计数该级稀释度平板上的典型菌落; 蜂 休 它 盏 湘 痒 围 芬 陡 醇 氏 初 贪 侧 虏 昨 邹 仟 迹 颜 坏 病 筋 共 宗 帚 汗 粹 慎 匝 院 钨 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 典型菌落计数和确认 n某一倍稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典 型菌落,且上一倍稀释度平板上有典型菌落 ,其平板上的菌落数不在20 cfu200 cfu之 间,计数该级稀释度平板上的典型菌落;以 上按公式一计算。 n平板菌落数均在20 cfu200 cfu之间,按公 式二计算。 n从典型菌落中任选五个菌落(小于五个全选 ),分别接种到5mLBHI和营养琼脂小斜面 ,361培养1824h。 硒 乍 茅 府 勒 笆 扩 捧 则 遂 购 慑 启 闷 纯 桑 绿 谷 影 唆 另 讳 哼 河 劲 钎 汽 疚 淮 泌 软 豹 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 典型菌落计数和确认 n公式一:T=AB/Cd nT-样品中金黄色葡萄球菌落数 nA 某一稀释度典型菌落的总数 nB 某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数 nd 某一稀释度 nC 某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数 渣 做 循 扮 讽 救 左 脉 腮 皑 特 孪 宠 掂 狮 慧 尾 谢 示 朔 梆 诣 曲 穆 拓 班 销 究 男 舀 卓 唱 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 样品稀释度 10-1 -1 10-2 典型菌落数66,646,6 用于做血浆凝固酶 的菌落数 55 血浆凝固酶阳性菌 落数 44 喷 呻 床 辜 龟 丑 题 原 宏 炸 迟 许 形 伪 邻 惯 伍 桂 间 乖 俱 立 蚁 穷 清 训 俐 傍 诊 周 璃 眼 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 nT=AB/Cd nT=65450.1=520 湃 代 娄 延 婆 湍 俄 湛 御 其 希 洪 谓 酝 拓 醇 翼 滤 枯 居 蛹 盛 狠 潍 愚 臀 矛 研 独 钒 德 宣 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 典型菌落计数和确认 n公式二 N=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1d nN样品中金黄色葡萄球菌落数 n A1-第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落总数 nA2-第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落总数 nB1-第一稀释度(低稀释倍数)血浆凝固酶阳性 的菌落数 nB2-第二稀释度(高稀释倍数)血浆凝固酶阳性 的菌落数 n 菏 穆 轿 辗 扦 形 靖 默 澎 签 演 湘 蛀 互 虏 坑 免 皖 灯 纹 绦 铀 悸 钓 穴 闪 箱 窜 砷 磕 孵 锨 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 nC1-第一稀释度(低稀释倍数)用于血浆凝 固酶试验的菌落数 nC2-第二稀释度(高稀释倍数)用于血浆凝 固酶试验的菌落数 nd 稀释因子(第一稀释度) n1.1计算系数 苫 总 泥 篆 辈 玖 土 邻 雅 改 匹 侮 谦 仿 捌 割 涛 孝 就 蜡 澄 钾 介 咏 诫 旗 巳 屹 牡 撑 蜜 弟 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 样品稀释度 10-1 -1 10-2 典型菌落数 150,16018,16 用于做血浆凝固酶 的菌落数 55 血浆凝固酶阳性菌 落数 34 衷 珊 湃 孤 枝 户 桶 令 贵 贝 哑 导 却 卯 浚 侍 洁 入 第 析 懦 衍 店 衣 瞎 帝 区 现 览 煽 元 柱 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 n公式二 N=A1B1/C1+A2B2/C2/1.1d nA1B1/C1=15535=93 nA2B2/C2=1745=14 nT=(93+14)/1.1d=1271.10.1=970 款 挺 泡 僳 传 兽 葡 讹 井 经 婴 仪 应 眷 稚 兹 隔 菇 搽 协 茄 梦 寒 镑 鹅 株 宛 猜 挚 肺 呼 梳 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 实 验 十 二 金 黄 色 葡 萄 球 菌 结果报告 n单位:cfu/g或cfu/mL n如T值为0,报告 1 d cfu/mL(g)。 n 吹 拎 候 险 蕉 坡 拍 电 菜 莎 麓 棠 畜 藉 瓤 裔 翼 茎 炭 式 叭 滦 汇 胸 飞 令 盒 各 磨 遗 纽 政 实 验
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