流式细胞仪实验方法及常见问题分析课件

流式细胞仪实验方法及常见问题 分析 中心实验室 李 琳 2012.09.19 流式细胞仪（Flow Cytometer）是集多种 技术为一体的新型高科技仪器。 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流 式细胞仪为检测手段，对处在快速直线 流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数定量分析和分选的高新技术。 研究对象：各种细胞、微生物、人工合 成微球等。 BD FACSAria 中心实验室的流式能做什么？ 流式实验需要做哪些准备和工作？ 流式细胞仪检测范围 细胞结构细胞功能 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA 含量 蛋白质含量 染色体分析 特异性抗原（细胞表面/胞浆/核） 细胞活性 细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 凋亡 在上述信号基础上的细胞分选（未开展分选） 单细胞标本的制备 标记荧光抗体 检 测（老师） 数据分析 FCM 实 验 流 程 一、单细胞标本的制备 （关键步骤） 6种标本来源 外周血单细胞悬液制备 新鲜的外周血是天然的单细胞悬液，需 要用红细胞裂解液裂解RBC。 培养细胞的单细胞悬液制备 脱落细胞的单细胞悬液制备 脱落细胞应去除取材伴随的杂质后再制备细胞 悬液。 对临床诊断和治疗很有意义，比如脱落的肺泡 细胞。 新鲜实体组织单细胞悬液制备 常用方法：酶消化法、机械法、化学处理法、表 面活性剂处理法等。 不论哪种方法都不可避免会对细胞表面膜结构、 细胞活性和功能造成不同程度的损伤。 活检标本单细胞悬液制备 方法：与新鲜实体组织基本相同，要求镜检 取材标本至少取3块以上。 石蜡包埋组织单细胞悬液制备 常用方法：二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡 法、甲氧-双氧水处理法。 扩大了流式的应用范围，有利于进行临床回 顾性研究。 评判单细胞悬液制备的标准 1.细胞团块、碎片尽可能少，不能出现肉眼可见的团 块，上机前细胞必须过300目滤膜。 2.细胞呈单个分散状态。 3.细胞浓度：51051106 4.分散过程中细胞的活性不受到明显的损害，以保证 下一步的荧光染色处理。 样品制备过程中常见的问题及解决对策 常见问题原 因解决对策 细胞密度低制备过程中细胞损失增加离心时间、吸弃上清 非特异荧光强抗体不纯、死亡细胞多 选择纯度高的抗体、用同型对照抗 体或双标记排除非特异荧光 碎片多细胞死亡、机械损伤在细胞生长状态良好时测试、避 免反复吹打 细胞聚集消化不完全、酒精固定 造成的细胞粘连 彻底消化、在用酒精固定细胞时 加入终浓度为1.5-3的小牛血清 荧光弱灵敏度不够、抗体加入 量不饱和、反应时间短 改用生物素-亲和素、增加抗体 用量、延长反应时间 测不出亚二倍 体峰 凋亡测试方法选择不当改用原位末端标记或Annexin-V 和PI双标记法 二、标记荧光抗体 直接免疫荧光染色：细胞与抗体反应，多用于细胞 表面标志的染色分析。 间接免疫荧光染色：先用一抗与待测抗原反应，再 用二抗（荧光素标记）进行标记。 选择合适的荧光染料 必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发。（激 发光源488nm633nm407nm） 激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围。 荧光素光谱的重叠应当尽量减少。 一定要选择商业化的流式用单克隆抗体，此类抗体在制 备过程中有严格的质控，非特异荧光弱。最好用直标抗 体，如果是用间标抗体，二抗的选择更应严格。 影响荧光染色效果的因素 温度：高温时荧光淬灭的可能性增大。 pH值：其改变会导致荧光光谱改变，影响荧光强度 。 固定剂：与细胞的某些物质结合后，干扰荧光染料与 细胞成分的结合，造成荧光强度改变。 其他：孵育时间、溶剂的性质、细胞浓度等。 三、上机检