端粒酶课件

周俊宜 中山医科大学生化教研室中山医科大学生化教研室 与细胞衰老和癌变与细胞衰老和癌变 中中 山山 医医 学学 院院 生生 化化 教教 研研 室室 周俊宜周俊宜 5 5 5 5 端粒消耗端粒消耗 端粒维持端粒维持 细胞衰老细胞衰老 细胞永生化细胞永生化 染色体染色体DNADNA 端粒端粒 端粒端粒 “人体的正常细胞经过有限的分裂次数后即进入衰老人体的正常细胞经过有限的分裂次数后即进入衰老 阶段，停止增殖而最终走向衰亡。呈恶性生长的癌细胞似阶段，停止增殖而最终走向衰亡。呈恶性生长的癌细胞似 乎摆脱了正常衰老过程的约束，在无拘无束地高速生长中乎摆脱了正常衰老过程的约束，在无拘无束地高速生长中 获得获得“永生永生”。衰老和肿瘤相互对立却又同为人类的。衰老和肿瘤相互对立却又同为人类的“天天 敌敌”，两者之间千丝万缕的关联一直以来为人们所关注。，两者之间千丝万缕的关联一直以来为人们所关注。 近年来端粒酶热点的出现被认为是联结着肿瘤和衰老近年来端粒酶热点的出现被认为是联结着肿瘤和衰老 研究的一条全新纽带，国际权威期刊单元、科学等逐年递研究的一条全新纽带，国际权威期刊单元、科学等逐年递 增地刊载相关论文和报道，对端粒和端粒酶这一研究方向增地刊载相关论文和报道，对端粒和端粒酶这一研究方向 予以相当关注，认为有可能对予以相当关注，认为有可能对肿瘤、衰老肿瘤、衰老等重大生命课题等重大生命课题 产生深远影响。产生深远影响。” 目目 录录 端粒的结构与功能端粒的结构与功能 端粒酶的结构与功能端粒酶的结构与功能 端粒、端粒酶与细胞衰老端粒、端粒酶与细胞衰老 端粒、端粒酶与恶性肿瘤端粒、端粒酶与恶性肿瘤 二十世纪三十年代，二十世纪三十年代，BarbavaBarbava McClintockMcClintock和和Hermann Hermann J.MullerJ.Muller发现，染色体的末端有一种能稳定染色体结构和发现，染色体的末端有一种能稳定染色体结构和 功能的特殊成分。如果缺少了这种成分，染色体之间就会功能的特殊成分。如果缺少了这种成分，染色体之间就会 互相粘连、出现结构的变化或其它错误的行为，以致影响互相粘连、出现结构的变化或其它错误的行为，以致影响 到染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。到染色体的生存和正确复制并进一步威胁到细胞的存亡。 于是从希腊文的于是从希腊文的“ “末端末端“ “（telostelos）和和“ “部分部分“ “（merosmeros）二词二词 为这种特殊的成分创造了一个全新的术语为这种特殊的成分创造了一个全新的术语“ “端粒端粒“ “（ telomeretelomere）。）。 1 1 端粒的发现端粒的发现 断端降解、断端融合、结构功能破坏断端降解、断端融合、结构功能破坏 染色体染色体DNADNA X X射线射线 从希腊字的末端从希腊字的末端“telostelos”和部分和部分“merosmeros”创造了一个全创造了一个全 新的单词：端粒新的单词：端粒 telomeretelomere 端粒帽端粒帽 染色体染色体 端粒帽端粒帽 端粒的精确组成则是在七十年代末才首次被提出。端粒的精确组成则是在七十年代末才首次被提出。19781978 年，美国科学家年，美国科学家BlackburnBlackburn发现，单细胞池塘生物四膜虫发现，单细胞池塘生物四膜虫 （TetrahymenaTetrahymena）的端粒是由一种极短的简单重复序列的端粒是由一种极短的简单重复序列 TTGGGGTTGGGG多次重复而成。多次重复而成。 从那以后，包括动物、植物和微生物在内的多种生物的从那以后，包括动物、植物和微生物在内的多种生物的 端粒序列已被确定，它们均是由端粒序列已被确定，它们均是由富含富含G G和和T T的简单重复序列的简单重复序列 不断重复而成。不断重复而成。 2 2 端粒的精确组成端粒的精确组成 19781978年首次发现四膜虫端粒的分子组成：年首次发现四膜虫端粒的分子组成： 端粒端粒 染色体染色体DNA DNA 端粒端粒 n n（CCCCAACCCCAA） n n（GGGGTTGGGGTT） 3 3 5 5 （TTGGGGTTGGGG）n n （AACCCCAACCCC）n n n n（CCCTAACCCTAA） n n（GGGATTGGGATT） 3 3 5 5 （TTAGGGTTAGGG）n n （AATCCCAATCCC）n n 人端粒的分子组成：人端粒的分子组成： 端粒帽 染色体DNA 端粒帽 n（CCCCAA） （TTGGGG）n n（GGGGTT） （AACCCC）n 3 5 3 3 端粒结合蛋白端粒结合蛋白 保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用 一般是紧密的非共价键结合一般是紧密的非共价键结合 人类 纤毛虫类 随着对端粒分子组成结构的阐明，端粒对维护染色随着对端粒分子组成结构的阐明，端粒对维护染色 体完整性的功能已不是一个笼统的概念。活跃在细胞中体完整性的功能已不是一个笼统的概念。活跃在细胞中 枢并当担着延续生命重任的染色体脱氧核糖核酸其实面枢并当担着延续生命重任的染色体脱氧核糖核酸其实面 临的是一个临的是一个“危机四伏危机四伏”的境界，它对外要抵御的境界，它对外要抵御核酸酶核酸酶 等各种因素袭击，对内则有一个难以等各种因素袭击，对内则有一个难以“自圆其身自圆其身”的所的所 谓谓“末端复制问题末端复制问题”。端粒的存在正是扮演了一个卫士。端粒的存在正是扮演了一个卫士 的角色，它就象是一个尽忠职守的的角色，它就象是一个尽忠职守的“生命卫士生命卫士”，不但，不但 避免了外界因素的入侵，而且在复制过程中，把基因组避免了外界因素的入侵，而且在复制过程中，把基因组 序列包裹在内部，以牺牲自身而避免染色体结构基因被序列包裹在内部，以牺牲自身而避免染色体结构基因被 侵蚀，从而防止了遗传信息的丢失，维护了染色体结构侵蚀，从而防止了遗传信息的丢失，维护了染色体结构 和功能的完整性。和功能的完整性。 4 4 端粒的功能端粒的功能 对外对外: : 抵御核酸酶等外界抵御核酸酶等外界 对内对内: : 染色体脱氧核糖核酸染色体脱氧核糖核酸 的的 因素的袭击因素的袭击 末端复制问题末端复制问题 保护染色体结构和功能的完整性保护染色体结构和功能的完整性 染色体染色体 染色体脱氧核糖核酸的末端复制问题：染色体脱氧核糖核酸的末端复制问题： 3 3 5 5 55 33 RNARNA引物引物 3 3 3 3 RNARNA引物水解引物水解 即即DNADNA复制过程不能复制过程不能“ “自始至终自始至终“ “完整地复制整个线完整地复制整个线 性染色体，而是每次都在其性染色体，而是每次都在其55末端留下一个空缺未能填末端留下一个空缺未能填 补（即补（即RNARNA引物降解），如果细胞没有办法添补这些空引物降解），如果细胞没有办法添补这些空 隙，染色体隙，染色体DNADNA将随着每一次的细胞分裂而不断缩短，将随着每一次的细胞分裂而不断缩短， 直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡。直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡。 领头链领头链 随从链随从链 5 5 5 5 1)1)纤毛原虫动物纤毛原虫动物 四膜虫：其巨核形成过程中，经历了端粒从无到有的四膜虫：其巨核形成过程中，经历了端粒从无到有的 发育过程。发育过程。 2) 2) 酵母酵母 外源脱氧核糖核酸转化酵母细胞后，在其末端形成新外源脱氧核糖核酸转化酵母细胞后，在其末端形成新 端粒的效率很高。端粒的效率很高。 5 5 端粒的研究体系端粒的研究体系 1 1）早期的原始复制模型）早期的原始复制模型 2 2）端粒酶模型端粒酶模型 3 3）重组模型）重组模型 6 6 端粒的复制模型端粒的复制模型 酵母细胞酵母细胞 酵母细胞酵母细胞 酵母酵母TSTS四膜虫四膜虫TSTS ShampayShampay的加尾实验的加尾实验 1 1 端粒酶的发现端粒酶的发现 Blackburn Blackburn的实验的实验 加热或加热或 蛋白酶蛋白酶 孵育孵育 四四GTGT 酵酵GTGT pBR322pBR322 四四CACA 孵育孵育 四膜虫抽提物四膜虫抽提物5 5 3 3 1 1）端粒的加尾方向是按）端粒的加尾方向是按GTGT链从链从55端端 3 3端。端。 2 2）每次加一个重复单位。）每次加一个重复单位。 3 3）似为）似为“无模板复制无模板复制”。 4 4）被加尾的末端序列具有特异性。）被加尾的末端序列具有特异性。 5 5）催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有）催化加尾的应是细胞抽提物中一种具有酶活性酶活性的物的物 质。质。 实验推论实验推论 2 2 端粒酶的结构端粒酶的结构 19871987年，年，Blackburn Blackburn 柱层析柱层析 RNPRNP结构结构 四膜虫端粒酶四膜虫端粒酶RNPRNP 含有含有RNARNA组分和蛋白质组分，两者均为酶活性所必需。对组分和蛋白质组分，两者均为酶活性所必需。对 RNARNA酶极为敏感。酶极为敏感。 RNARNA组分组分 ProteinProtein Telomerase Telomerase /images/telomere.gif/images/telomere.gif CAACCCCAA CAACCCCAA CAACCCCAACAACCCCAA 端粒酶端粒酶RNARNA 1 1）CAACCCCAACAACCCCAA结构，有碱基修饰。结构，有碱基修饰。 2 2）反义）反义RNARNA封闭，能抑制酶活性。封闭，能抑制酶活性。 反义反义 RNARNA 3 3）GreiderGreider的点突变实验：的点突变实验： 点突变 端粒酶端粒酶 RNARNA序列序列 C A 端粒端粒 端粒酶端粒酶 C T T G C G C A T C A A 端粒酶蛋白质端粒酶蛋白质 19951995年，首次从四膜虫克隆到端粒酶蛋白质组分：年，首次从四膜虫克隆到端粒酶蛋白质组分： p80p80 p95p95 遗传密码遗传密码 碱基互补碱基互补 人类端粒酶蛋白质人类端粒酶蛋白质 ？ 同源序列同源序列 核酸探针 重组重组DNADNA分子分子 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG 5 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG CCAACCCCCCAACCCC 3 5 oH3 5 5 CCAACCCCCCAACCCC 3 5 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG CCAACCCCCCAACCCC 2.2.聚合聚合 1.1.结合结合$ $ 3.3.移位移位 爬爬 行行 模模 式式 3 3 端粒酶的功能端粒酶的功能 TTGGGGTTGGGG TTGGGGTTGGGG CCAACCCCCCAACCCC 末端补齐机制： 5 GGGGTTGGGGTT （GGGGTTGGGGTT）n n 端粒酶端粒酶 5 G-G配对回折 35 DNADNA聚合酶聚合酶 4 4 端粒酶活性的测定端粒酶活性的测定 19941994年，年，KimKim首创端粒重复扩增法（首创端粒重复扩增法（TRAPTRAP）。）。 陷阱的电泳检测陷阱的电泳检测 梯梯 形形 条条 带带 加样孔 TSTS引物引物 CXCX引物引物 细胞提取物细胞提取物 端粒重复序列端粒重复序列 PCRPCR 扩增扩增 产物产物 T4g32,RnasinT4g32,Rnasin TRAP bufferTRAP buffer dNTPsdNTPs 细胞提取物细胞提取物 TS TS 引物引物 TaqTaq E E CX CX 引物引物 2325 30 min PCRPCR仪仪 生物素生物素 亲和素亲和素 地高辛地高辛 酶标抗地高辛抗体酶标抗地高辛抗体 酶标仪检测酶标仪检测 半定量半定量 。 In human blood In human blood cells, the length cells, the length of telomeres of telomeres ranges from 8,000 ranges from 8,000 base pairs at base pairs at birth to 3,000 birth to 3,000 base pairs as base pairs as people age and as people age and as low as 1,500 in low as 1,500 in elderly people. elderly people. (An entire (An entire chromosome has chromosome has about 150 million about 150 million base pairs.) Each base pairs.) Each time a cell time a cell divides, an divides, an average person average person loses 30 to 200 loses 30 to 200 base pairs from base pairs from the ends of that the ends of that cells telomeres.cells telomeres. In most somatic tissues, telomerase is expressed at very low levels or not at all - as cells divide, telomeres shorten. Short telomeres may be a signal for cells to senesce (stop dividing). Telomerase and Senescence 染色体染色体端粒端粒 端粒端粒 端粒与细胞存亡密切相关端粒与细胞存亡密切相关 细胞分裂细胞分裂 细胞分裂细胞分裂 端粒长短与细胞生命历程密切相关端粒长短与细胞生命历程密切相关 染色体染色体 端粒端粒端粒 端粒 细胞将停止分裂而趋于老化细胞将停止分裂而趋于老化 细胞分裂细胞分裂 细胞分裂细胞分裂 染色体染色体 端粒端粒 端粒端粒 细胞将停止分裂而趋于老化细胞将停止分裂而趋于老化 1 1）培养细胞：）培养细胞： 端粒长度随分裂次数增多而缩短。端粒长度随分裂次数增多而缩短。 端粒长度和细胞分化程度呈反比端粒长度和细胞分化程度呈反比。 2 2）人体：）人体： 端粒平均长度随年龄增大而变短。端粒平均长度随年龄增大而变短。 体细胞端粒长度大大短于生殖细胞。体细胞端粒长度大大短于生殖细胞。 相关实验证据相关实验证据 端粒酶与细胞存亡端粒酶与细胞存亡 端粒酶端粒酶 端粒端粒 端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、端粒酶催化端粒不断延长，从而抵消因染色体复制、 细胞分裂导致的脱氧核糖核酸缩短，使得染色体脱氧核细胞分裂导致的脱氧核糖核酸缩短，使得染色体脱氧核 糖核酸完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。糖核酸完好无损，细胞能够顺利地分裂繁殖。 相关实验证据：相关实验证据： 1 1）四膜虫：）四膜虫： 端粒酶改变时端粒缩短、细胞死亡。端粒酶改变时端粒缩短、细胞死亡。 2 2）酵母：）酵母： 端粒酶基因突变导致端粒变短、细胞衰老。端粒酶基因突变导致端粒变短、细胞衰老。 端粒酶基因突变端粒酶基因突变 导致端粒变短、导致端粒变短、 细胞衰老细胞衰老 培养细胞中端粒长培养细胞中端粒长 度随分裂次数增多度随分裂次数增多 而缩短而缩短 端粒长度与细胞端粒长度与细胞 的年龄呈负相关的年龄呈负相关 端粒长度和细端粒长度和细 胞分化程度呈胞分化程度呈 反比反比 EstlEstl突变体酵母活突变体酵母活 性下降，出现明显性下降，出现明显 衰老衰老 四膜虫端粒酶改四膜虫端粒酶改 变时端粒缩短、变时端粒缩短、 细胞死亡细胞死亡 体细胞端粒长度体细胞端粒长度 大大短于生殖细大大短于生殖细 胞胞 端粒平均长度端粒平均长度 随生物体年龄随生物体年龄 增大而变短。增大而变短。 正常人体细胞缺乏端粒酶活性。正常人体细胞缺乏端粒酶活性。 与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比与其他有端粒酶活性的生物体细胞相比, ,人体细胞具人体细胞具 有很长的端粒。有很长的端粒。 人的胚胎细胞具有明显可探测的端粒酶活性。人的胚胎细胞具有明显可探测的端粒酶活性。 人的端粒与端粒酶人的端粒与端粒酶 端粒端粒 染色体脱氧核糖核酸端粒染色体脱氧核糖核酸端粒 端粒酶端粒酶 端粒酶端粒酶 胚胚 胎胎 期期 “ “人体细胞中端粒酶合成和延长端粒的作用是在胚系细人体细胞中端粒酶合成和延长端粒的作用是在胚系细 胞中完成的，当胚胎发育完成以后，端粒酶活性就被抑制胞中完成的，当胚胎发育完成以后，端粒酶活性就被抑制 。即在胚胎发育时期获得的端粒，应已足够维系人体的整。即在胚胎发育时期获得的端粒，应已足够维系人体的整 个生命过程中因细胞分裂所致的端粒缩短。个生命过程中因细胞分裂所致的端粒缩短。 所以，所以， 当人体出生以后，染色体端粒就象是一个伴随当人体出生以后，染色体端粒就象是一个伴随 着细胞分裂繁殖的着细胞分裂繁殖的“生命之钟生命之钟”，它历数着细胞可分裂的，它历数着细胞可分裂的 次数同时也见证了细胞由旺盛地生长繁殖到走向衰老死亡次数同时也见证了细胞由旺盛地生长繁殖到走向衰老死亡 的整个生命历程。的整个生命历程。” 正常细胞：正常细胞： 细胞分裂细胞分裂 细胞分裂细胞分裂 衰衰 老老 死死 亡亡 细胞年轻化细胞年轻化 端粒酶端粒酶 重新引入重新引入 抗 衰 老 1996 1996年，著名的端粒（酶）研究专家年，著名的端粒（酶）研究专家BlackburnBlackburn和和 GreiderGreider在总结端粒（酶）研究历程中曾说过一句颇为耐在总结端粒（酶）研究历程中曾说过一句颇为耐 人寻味的话：在自然界中，你永远也无法想象，海底中的人寻味的话：在自然界中，你永远也无法想象，海底中的 一块岩石也许是一片生命的绿叶，公园里的一朵鲜花可能一块岩石也许是一片生命的绿叶，公园里的一朵鲜花可能 就是一株剧毒的恶虫。就是一株剧毒的恶虫。 细胞分裂细胞分裂 细胞分裂细胞分裂 细细 胞胞 衰衰 老老 端粒酶端粒酶 永永 生生 化化 抗肿瘤靶抗肿瘤靶 点点 Telomerase and Cancer The presenc