重要细菌类疫苗的研究生产工艺及进展 （百日咳）课件

重要细菌类疫苗 的研究、生产工艺及进展 百日咳 百日咳（ pertussis , whooping cough ）是一种由 百日咳杆菌（ Bordetella pertussis ）引起的急性呼 吸系统传染疾病，主要侵犯婴幼儿。百日咳杆菌通过飞 沫从感染者传播给易感个体。有710d的潜伏期，患者 出现卡他症状，如咳嗽、流涕、打喷嚏、鼻塞等。12 周内，出现阵发性痉挛性咳嗽，并带有典型的鸡鸣样尾 声或伴有呕吐。如无并发症出现，一般无高热或有轻度 发热。百日咳全病程较长，可持续数月，故名百日咳。 在病发初期传染力最强，不易诊断，所以难以控制传染 源，切断传播途径，只有进行预防接种，增加人群对百 日咳的抵抗力，减少易感人群，才能控制和消灭百日 咳。 概述 百日咳杆菌 百日咳杆菌附着在呼吸道表面 （1）季节性和周期性：百日咳发病季节性不显著， 一年四季都有发生。在我国一般春夏季发病校多，于4月 开始增多，5月达到高峰。其周期性为每35年一个高峰 ，与易感者积累有关。在扩大免疫规划（EPI）开展以来 ，其周期性已不明显。 1.百日咳流行特征 （2）年龄分布：年龄小者易感性高，多数患者为7 岁 以下儿童。日本发病率主要集中在一岁以内。 近年来青少年和成人百日咳有增多趋势，可占流行 时总病例的10.2%。一组经细菌培养证实的成人百 日咳，平均年龄为35岁，有典型症状与痉咳后呕吐 ，但也可仅有数周干咳，罕有并发症。大多数仍可 坚持工作，本人虽无多大痛苦，但可作为传染源， 尤其威胁小儿，应予重视。 （3）流行趋势：由于世界各国都在实行扩大免疫规划 ，许多国家发病率已明显降低。美国1971年发病率为 1.47/10万，至1980年已为0.76/10 万。荷兰1976至 1980年只发生86例百日咳患者，已不是引起儿童死亡的 主要原因。 2.百日咳杆菌的生物学特征 百日咳杆菌为卵圆形短小杆菌，大小为 （0.51.5m）x（0.20.5m），属 鲍特氏菌属，无鞭毛和芽孢，具荚膜。 革兰氏染色阴性。专性需氧。 5630min、日光直射一小时可致死 亡。对多粘菌素、氯霉素、红霉素、氨 苄青霉素敏感，对青霉素不敏感。 百日咳杆菌常发生光滑型到粗 糙型的相变异：相为光滑型 ，菌落光滑有荚膜，毒力强， 有免疫原性；相为粗糙型， 菌落粗糙，无荚膜，无毒力， 也无免疫原性；、相为过 渡相，介于相和相之间。 一般在疾病急性期分离的细菌 为相，在疾病晚期，和多次 传代培养可出现相、相或 相的变异。发生这种变异时 ，细菌形态、菌落、溶血性、 抗原结构和致病力等均出现变 异。 相 相 相 相 毒力增强 变异方向 百日咳杆菌在其生长过程中能产生十几种抗原。 早期根据耐热性（100，2h）不同，将百日咳 相菌抗原分为耐热的菌体（O）抗原和不耐热的表 面荚膜（K）抗原。 近三十年来的研究表明，百日咳杆菌不仅产生内毒 素和外毒素，而且还产生许多具有不同生物学活性 的物质。 3.百日咳杆菌的抗原结构 百日咳杆菌的主要凝集因子有1、2、3，因子1为 所有相菌共有，一相菌可分为1、2、3，1、2和 1、3三个血清型。 此外还有次要凝集因子4、5、6，它们可组合成不 同血清型。 鉴于百日咳杆菌血清型的特异性，WHO推荐在疫苗 中应采用含有1、2、3型因子血清型菌株，以保证 疫苗的活力。 二十世纪三十年代 Medson等研制成全菌体 百日咳疫苗。该疫苗价格 低廉，免疫效果好，在控 制和降低儿童百日咳发病 方面发挥了巨大作用，至 今在很多国家使用。 全菌体百日咳疫苗 无细胞百日咳疫苗 4.百日咳疫苗 全菌体百日咳疫苗又称为全细胞百日咳疫苗（ whole cell pertuussis vaccine ，WPV ），是将 培养的百日咳全菌体用适当的灭活剂灭活后，与佐 剂配合，直接用作免疫用疫苗。我国生产用菌种采 用百日咳相含1型、2型和3型凝集原的菌株。 4.1全菌体百日咳疫苗 将细菌 大量培 养增殖 沉淀菌 体 使用甲 醛灭活 将不同血 清型菌体 原液按比 例配合 百日咳 原液 01 02 04 05 03 1.甲醛适量浓度 2.在一定温度下 3.灭活后无传染性但具有免疫 原性 疫苗生产过程 多数情况下，将百日咳疫苗原液与白喉类毒素和破 伤风类毒素配合成吸附百白破联合疫苗（DPT）或 百白二联疫苗使用。 按药典要求，百日咳菌的含量为9x109个/ml、 破伤风类毒素5Lf/ml、氢氧化铝吸附剂 1.01.5mg/ml、硫柳汞防腐剂0.1g/L，NaCl含 量补足至8.5g/L。 无细胞百日咳疫苗（ acellular pertussis vaccine ， APV ）主要通过提取纯化，去掉一些无用且引 起副反应的毒性物质，如气管细胞毒素（TCT）和 腺苷酸环化酶毒素（ACT），但保留具有保护性免 疫作用的抗原成分，如百日咳毒素（PT）、丝状血 凝素（FHA）、Agg2和Agg3等。 我国疫苗中成分主要是PT和FHA，采用的生产菌株 为相CS菌株。该疫苗株是从北京地区患者中分离 ，再经实验室做适应性选择而获得，含有1、2、3 血清型凝集原，并可在培养液中获得大量的FHA和 PT抗原。 4.2无细胞百日咳疫苗 将菌体培养后，提取其有用成分。 目前采用的提取方法有两种。一种是以我国和日本 部分企业采用的共纯化工艺，另一种是采用柱层析 法。 生产过程 盐析沉淀PT 、FHA等成分 细菌培养 梯度离心去除 杂质 收集PT、 FHA等有效成 分 共 纯 化 工 艺 然后将 各抗原合并 将不同的 保护性抗原 分别纯 化 柱层析法 柱层析法 成本较高， 但优点是成 分明确，质 量控制较 易。 产率相对 较高，且成 本低 共纯化法 两种方法比较 我国生产百日咳疫苗的相关企业及其产品 武汉生物制品研究所 兰州生物制品研究所 北京天坛生物制品股份有限公司 然而，近年来，百日咳在青少年和成人中的爆发率有上升的趋势，这 给百日咳的预防提出了更大的挑战。 由于我国免疫计划主要针对婴幼儿，婴幼儿在3月龄开始,基础免疫共 3针,采用3、4、5月龄免疫程序，而较大的学龄前儿童没有接种百日 咳疫苗或者没有进行加强免疫,加之疫苗免疫的持久性不够确切,使人 群对百日咳的免疫水平下降。 近年来在许多国家逐渐发现成年百日咳患者病例上升,在某些国家临 床报告的百日咳病例中,近一半是大于10岁的患者,高发年龄在青少 年（1019岁）阶段。有些调查发现,在18岁以上无明显咳嗽疾 患、持续咳嗽7d 以上的成年人中,符合百日咳诊断标准的感染者高达 32%，成人感染百日咳症状不明显，很容易被忽视，从而成为重要的 传染源。同时在全世界许多国家百日咳临床分离株当中，有许多菌株 已经出现抗原漂移现象，少表达或者不表达PT抗原，这对现有的百日 咳疫苗提出了更大的挑战。 5.未来的发展方向 由于新的临床分离株 的出现，迫切需要研 究现行的临床分离株 与疫苗株之间的蛋白 表达差异，从而找出 临床分离株的新的毒 性蛋白，并对其进行 功能分析，防止新的 流行株出现爆发百日 咳大规模流行 替代菌体疫苗成为趋 势，特别是联合疫 苗。联合疫苗可以提 高疫苗覆盖率和接种 率、减少多次注射给 婴儿和父母所带来身 体和心理的痛苦、减 少疫苗管理上的困 难、降低接种和管理 费用，还可减低疫苗 的不良反应等 对成年人，尤其应重 视对大龄儿童、青少 年、以及孕妇及其他 婴幼儿密切接触者进 行加强免疫，提高其 抵抗力，以切断婴幼 儿百日咳的传染源， 从而更好地预防和控 制百日咳。 调整对象 代替菌 体疫苗 找出临床 新毒性蛋白 百日咳疫苗已经有70年的应用历史,而无细胞百日 咳疫苗也已经使用了近20年。百日咳疫苗