化妆品中24种过敏原的气相色谱_质谱法测定.docx

化妆品中种过敏原的气相色谱 质谱法测定24捷1 ，焦 红2* ，叶弘毅1 ，毕英杰2 ，刘超1 ，陈郑 璇2 ，战静3 ，赖唯4(1 广州检验检疫技术中心，广东公共卫生学院，广东广州 510623; 2 广东出入境检验检疫局，广东 广州 510623; 3 中山大学510080; 4中山大学 第三附属医院，广东 广州510630)广州摘 要: 建立了气相色谱 质谱(gc ms)法同时测定化妆品中 24 种过敏原的分析方法。样品经甲醇超声提取，以选择离子模式(sim)进行定性及定量分析。24 种过敏原在质量浓度 0. 2 100 mg / l 范围内呈良好的线 性关系，相关系数 r2 0. 995，检出限为 2 10 mg / kg，平均回收率为 80% 104% ，相对标准偏差为 1. 8% 9. 3% 。该方法快速、准确、灵敏度高。通过对 77 名患者使用的 150 份可疑致敏化妆品测试发现，24 种过敏 物质的阳性检出率为 78% ，其中至少有 1 种过敏物质含量大于 10 mg / kg 的样本占阳性样本的 81. 2% 。71 名 过敏患者(92. 2% )使用的化妆品中检出致敏物; 其中至少有一种过敏物质的检出值大于 10 mg / kg 的占90. 1% 。结果显示，24 种过敏物质是化妆品接触性皮炎的主要致敏原。关键词: 气相色谱 质谱; 化妆品; 过敏原; 接触性皮炎中图分类号:o657. 63; tq657. 2文献标识码:文章编号:1004 4957(2012)03 0261 06adoi: 10. 3969 / j. issn. 1004 4957. 2012. 03. 004determination of 24 allergens in suspicious cosmetics by gaschromatography mass spectrometrychen jie1 ，jiao hong2* ，ye hong-yi1 ，bi ying-jie2 ，liu chao1 ，zheng xuan2 ，zhan jing3 ，lai wei4( 1 guangzhou inspection and quarantine technology center，guangzhou 510623，china; 2 guangdong entry exit inspection and quarantine bureau，guangzhou 510623，china; 3 school of public health，sun yat-sen university， guangzhou 510080，china; 4 the third affiliated hospital，sun yat-sen university，guangzhou 510630，china)abstract: a simultaneous determination method was developed for the reliable screening，quantifica- tion and confirmation of 24 allergens in cosmetics by gas chromatography mass spectrometry( gc ms) the 24 allergens were extracted from cosmetics with methanol，then determined by gc ms with the external standard method under the selected ion mode( sim) the calibration curves showed good linearities in the range of 0. 2 100 mg / l with correlative coefficients ( r2 ) larger than 0. 995 the detection limits were in the range of 2 10 mg / kg，and the average recoveries were 80% 104% with relative standard deviations of 1. 8% 9. 3% the method was rapid，accurate and sen- sitive the positive detection rate of 24 allergens in 150 samples of 77 patients using cosmetics was78% ，and there was at least one allergen measured value above 10 mg / kg in 81. 2% of the positivesamples 24 allergens in the cosmetics used by 71 patients were detected out and the detection rate was 92. 2% ，which at least one allergen measured value above 10 mg / kg was 90. 1% 24 allergens are the major allergens in cosmetic contact dermatitiskey words: gas chromatography mass spectrometry; cosmetics; allergen; contact dermatitis化妆品是人们生活中必不可少的日用品。但由于化妆品中含有的香料、防腐剂和重金属等致敏物质种类繁多，以及人类自身免疫系统的多样性和特异性，临床化妆品接触性皮炎的发病率连续多年居 高不下。据中国化妆品人体不良反应监测结果: 2003 年化妆品皮肤病 565 例，其中接触性皮炎 467 例 ( 占 82. 6% ) ; 2004 年化妆品皮肤病 977 例，其中接触性皮炎 911 例( 占 93. 3% ) 1; 2005 年化妆品皮收稿日期:基金项目:* 通讯作者:2011 10 14; 修回日期: 2011 11 26国家质检总局科技计划项目(2009ik160)焦 红，研究员，研究方向: 食品和化妆品实验室质量控制和安全评价，tel:e mail: jhciq1228 163. com262分析测试学报第 31 卷肤病 1 053 例，接触性皮炎达 74. 9%2。但上述监测均未对导致化妆品接触性皮炎的致敏因素进行跟踪。该病常因大部分患者不能准确提供可疑接触性过敏原而导致病程迁延难愈且病情反复。欧盟委员会在化妆品规程( council directive 76/ eec ) 第 7 次修正案中提出了 26 种致敏原在化妆品中的最/768高限量，要求在驻留类化妆品中其含量不得高于 0. 001% ，非驻留类化妆品中含量不得高于 0. 01% ，并要在化妆品的成分表中注明3。化妆品在生产过程中会加入香精香料物质。目前关于香精香料检测的报道有芳油中芳樟醇和樟脑 的含量分析4、芳樟树精油的成分分析5、金银花中芳樟醇的含量测定等6。检测方法主要有气相色 谱法( gc) 、高效液相色谱法( hplc ) 、气相色谱 质谱法( gc ms) 、固相微萃取 / 气相色谱 质谱 ( spme / gc ms) 法等7 14。本文建立了气相色谱 质谱( gc ms) 同时测定化妆品中 24 种香料类过 敏物质的方法，并应用于 150 份可疑致敏化妆品检测。实验部分仪器与试剂agilent 6890n 型气相色谱 5973n 型质谱联用仪，配 ei 源检测器 ( 美国 agilent 公司) ;11. 1yama-to8210 型水浴超声波发生装置( branson 公司) ; 5810 型离心机( 德国 eppendorf 公司) ; 涡流振荡器( 美国 ifa 公司) 。苎烯、芳樟醇、甲基庚炔碳酸盐、柠檬醛、香茅醇、香叶醇、-异甲基紫罗兰酮、苯甲 醇、羟基香茅醛( 7-羟基-3，7-二甲基辛醛) 、2-甲基 3-( 4-叔-丁基苯基) 丙醛、丁子香酚、戊基肉桂醛、 茴香醇、肉桂醇、法尼醇、异丁子香酚、己基肉桂醛、香豆素、新铃兰醛、2-苯亚甲基-1-庚醇、苯甲 酸苄酯、水杨酸苄酯、肉桂酸苄酯、肉桂酰胺标准品( 纯度均大于 98% ，德国 dr. ehrenstorfer 公司) ; 甲醇( 色谱纯，德国 merck 公司) ，其他试剂均为分析纯，实验用水为一级水。色谱及质谱条件色谱柱: hp innowax，30 m 0. 25 mm( 内径) 0. 25 m; 程序升温: 70 保持 5 min，以 101. 2 / min 升温至 240 ，保持 1 min; 载气: 氦气，纯度不低于 99. 999% ，流速:1. 2 ml / min;进样口温度:220 ;传输线温度:260 ;进样方式: 脉冲分流，分流比 5 1; 进样量: 1 l; 电离方式:ei 源; 电离能量:70 ev;扫描方式: 选择离子扫描( sim) ，特征选择离子监测见表 1。表 1 选择离子监测分组表table 1 gc ms parameters for quantitation and confirmationselected ion(m / z)groupcompoundsampling time t / mind-limonene(苎烯)linalool(芳樟醇)methyl heptin carbonate(甲基庚炔碳酸盐)citral(柠檬醛) citronellol(香茅醇) geraniol(香叶醇)-isom ethyl ionone(-异甲基紫罗兰酮)benzyl alcohol(苯甲醇)hydroxy-citronellal(羟基香茅醛)2-(4-tert-butybenzyl)propionaldehyde (2-甲基 3-(4-叔-丁基苯基)丙醛) cinnamal(肉桂酰胺)eugenol(丁子香酚)amylcinnamal(戊基肉桂醛)anisyl alcohol(茴香醇)cinnamyl alcohol(肉桂醇)famesol(法尼醇)isoeugenol(异丁子香酚)-hexyl cinnamic aldehyde(己基肉桂醛)coumarin(香豆素)hydroxy-methylpentyl-cyclohexene carboxaldehyde(新铃兰醛)68 * ，67，93，13671 * ，41，44，9395 * ，55，79，12369 * ，41，84，13769 * ，41，81，9569 * ，41，93135 * ，150，10779 * ，77，107，10859 * ，43，71，95189 * ，147，20412343. 708. 0012. 0013. 10514. 6067815. 4015. 7516. 50103 * ，77，131164 * ，103，131，149129 * ，115，91108 * ，138，121134 * ，91，11569 * ，41，81164 * ，149，131129 * ，117，216118 * ，146，89136 * ，93，7991017. 8018. 801119. 701220. 45263第 3 期陈 捷等: 化妆品中 24 种过敏原的气相色谱 质谱法测定(续表 1)groupcompoundsampling time t / minselected ion(m / z)amylcinnamyl alcohol(2-苯亚甲基-1-庚醇)benzyl benzoate(苯甲酸苄酯) benzyl salicylate(水杨酸苄酯) benzyl cinnamate(肉桂酸苄酯)91 * ，115，129，133105 * ，91，77，21291 * ，65，92，228131 * ，91，103，1921314151621. 5022. 0023. 0025. 00 quantitative ion标准储备溶液的配制24 种过敏原混合标准储备液: 准确称取 24 种待测过敏原标准品各 0. 1 g( 精确至 0. 001 g) 置于 10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度均为 10 g / l 的 24 种过敏原混合标准 储备液。1. 3样品来源及处理样品来源: 中山大学附属第三医院皮肤科临床门诊 77 名接触性皮炎患者使用的可疑致敏化妆品。150 个样本按种类分为: 乳霜类、乳液类、水剂类和其他( 彩妆、眼影、唇膏、粉底、面膜) 类，按不 同类型分类统计分析。分别称取 1 g( 精确至 0. 001 g) 上述试样于 50 ml 离心管中，准确加入甲醇 10 ml，超声提取 15 min。再加入 2 g 无水硫酸钠脱水振荡涡旋样品 1 min，10 000 r / min 离心 10 min，经 0. 45 m 微孔薄膜 过滤，作为待测样液。1. 422. 1结果与讨论提取溶剂的选择化妆品基质复杂，特别是乳霜及乳液类化妆品含油脂较多，采用低极性有机溶剂( 如: 乙醚、正己烷) 提取时，其中的油脂将溶入提取液，导致 gc ms 仪的灵敏度及色谱柱柱效显著降低。另一方面，24 种致敏化合物有一定的极性，易溶于甲醇、乙醇，故应选择极性溶剂萃取。本文分别用甲醇和乙醇 进行提取，发现 2 种溶剂的提取效率无显著差异，但采用甲醇时响应峰形更尖锐，灵敏度更高，故选 择甲醇为提取溶剂。色谱柱的选择比较了 hp-5ms、db xlb 和 hp innowax 3 种不同极性的色谱柱对样品的分离效率。结果表 明，强极性甲醇溶剂反复多次通过弱极性色谱柱 hp-5ms 和 db xlb 时，柱流失相对较大，加之被测 物本身极性的影响，很快出现峰形拖尾现象，导致仪器灵敏度下降; 而强极性甲醇对 hp innowax 极性色谱柱的影响很小，采用该色谱柱分离时，所得峰形尖锐，灵敏度高，柱寿命长。故选择 hp innowax 色谱柱。2. 2方法的线性方程、回收率及重复性用甲醇将 “1. 3 ” 配制的 24 种过敏原混合 标准储备液逐级稀释成质量浓度为 0. 2、1. 0、10、20、50、100 mg / l 的混合标准工作液进行 测定，以峰面积( y) 对相应的质量浓度( x) 绘制 标准曲线，24 种过敏原在 0. 2 100 mg / l 范围 内呈良好的线性关系，相关系数 r2 0. 995，结 果见表 2。其中柠檬醛和羟基香茅醛的方法检出 限( lod，s / n3) 为 10 mg / kg，其余 22 种过敏 原均为 2 mg / kg。在 10、20、100 mg / kg 3 个加 标水平下的平均回收率为 80% 104% ，相对标 准偏差( rsd) 为 1. 8% 9. 3% ( 见表 2 ) 。图 1 为24 种过敏原标准品的色谱图。2. 3图 1 24 种过敏原化合物标准品(10 mg / l)gc ms / sim 图fig. 1 gc ms / sim chromatogram of 24 allergens compounds standard solution at 10 mg / lthe number denoted was the same as those in table 2264分析测试学报第 31 卷表 2 24 种过敏原的保留时间、线性方程、相关系数(r2 )、加标回收率及相对标准偏差(n = 10)table 2 retention times，linear equations，correlation coefficients(r2 )，spiked recoveries and rsds of 24 allergens(n = 10)retentiontimet / minadded 10 mg / kg added 20 mg / kg added 100mg / kgrsdsr / %rsdsr / %rsdsr / %numbercompoundlinear equationr2recoveryr / %recoveryr / %recoveryr / %d-limonene(苎烯)linalool(芳樟醇)methyl heptin carbonate (甲基庚炔碳酸盐) citral(柠檬醛 1)citral(柠檬醛 2) citronellol(香茅醇) geraniol(香叶醇)-isom ethyl ionone(-异甲基紫罗兰酮) benzyl alcohol(苯甲醇) hydroxy-citronellal( 羟基香茅醛)cinnamal(肉桂酰胺)2-(4-tert-butybenzyl)pro- pionaldehyde ( 2-甲 基 3-(4-叔-丁基苯基)丙醛) eugenol(丁子香酚) amylcinnamal ( 戊 基 肉桂醛)anisyl alcohol(茴香醇)cinnamyl alcohol ( 肉 桂 醇)famesol(法尼醇 1)famesol(法尼醇 2)isoeugenol ( 异 丁 子 香 酚)-hexyl cinnamic alde- hyde(己基肉桂醛) coumarin(香豆素)hydroxy-methylpentyl-cy- clohexenecarboxaldehyde(新铃兰醛)amylcinnamyl alcohol (2-苯亚甲基-1-庚醇) benzyl benzoate( 苯甲酸 苄酯)benzyl salicylate(水杨酸 苄酯)benzyl cinnamate ( 肉 桂酸苄酯)y = 1. 600 104 x + 3. 199 103y = 1. 305 104 x + 4. 855 102y = 7. 706 103 x + 3. 910 1021234. 9011. 5012. 910. 997 90. 999 00. 998 98793898. 09. 17. 694103959. 26. 23. 79199977. 75. 57. 54-14-256713. 3313. 9514. 2815. 2015. 32y = 3. 583 102 x 2. 388 102y = 6. 226 102 x + 3. 284 102y = 1. 257 104 x + 2. 961 102y = 2. 472 104 x + 2. 581 10y = 2. 227 104 x + 9. 906 1020. 996 30. 996 70. 999 00. 999 10. 999 0999995100926. 16. 75. 17. 96. 79910098103953. 55. 04. 06. 46. 196969998973. 63. 62. 81. 87. 18915. 6016. 27y = 1. 753 104 x + 4. 990 103y = 5. 749 102 x + 3. 320 100. 999 20. 997 189976. 78. 884973. 25. 293934. 73. 2101117. 3817. 39y = 8. 945 102 x + 1. 345 10y = 2. 654 104 x + 4. 7280. 998 40. 998 394968. 98. 7101984. 26. 197992. 83. 3y = 2. 704 104 x 7. 608 10y = 5. 569 103 x + 1. 009 102121318. 5619. 410. 999 10. 998 791907. 59. 21001005. 76. 995974. 94. 3y = 1. 016 104 x + 2. 423 102y = 6. 364 103 x 2. 416 10141519. 5719. 630. 999 10. 999 190896. 57. 494952. 63. 498965. 05. 3y = 8. 193 103 x 1. 281 10y = 1. 229 104 x 1. 171 102y = 9. 706 103 x + 8. 172 1016-116-21719. 9220. 1720. 210. 997 20. 998 50. 998 59697847. 75. 59. 39597976. 88. 13. 49596963. 73. 76. 5y = 8. 789 103 x 2. 216 101820. 310. 996 61004. 91044. 0993. 5y = 2. 187 104 x + 2. 933 103y = 6. 606 103 x + 2. 725 102192021. 2321. 320. 999 10. 998 486967. 27. 8951034. 03. 0981004. 63. 4y = 1. 199 104 x + 5. 811 102121. 750. 999 3835. 8932. 5974. 7y = 3. 848 104 x + 6. 703 1022222. 670. 999 0887. 0954. 9982. 62324. 30y = 6. 736 104 x 2. 470 1020. 999 2994. 71016. 9993. 3y = 1. 280 104 x + 5. 802 102430. 490. 998 7804. 8895. 7984. 22. 4香料类化妆品检测对 77 位临床诊断接触性皮炎患者使用的 150 份可疑致敏化妆品检测，其中水剂类样本 14 个、乳霜类样本 75 个、乳液类样本 37 个、其他样本 24 个。结果发现: 在水剂类样本中，芳樟醇和 2-甲基 3-( 4-叔-丁基苯基) 丙醛的检出率最高，均为 42. 9% ; 芳樟醇的检测值最高，为 1 377 mg / kg; 有 15 种致 敏物质未检出。在乳霜类样本中，2-甲基 3-( 4-叔-丁基苯基) 丙醛的检出率最高，为 54. 7% ; 有 7 种致 敏物质的检出率超过 40% ，仅有 2 种致敏物质未检出; 羟基香茅醛的检出值最高，为 10 531 mg / kg。 在乳液类样本中，苎烯、2-甲基 3-( 4-叔-丁基苯基) 丙醛和水杨酸苄酯的检出率最高，均为 37. 8% ; 有3 种致敏物质未检出，检出值最高的是苎烯，含量为 2 271 mg / kg。在其他类样本中，芳樟醇的检出率 最高，为 45. 8% ，有 8 种致敏物质未检出; 检测值最高的是香叶醇，含量为 5 121 mg / kg。致患者皮肤过敏的乳霜和乳液类化妆品中，24 种过敏原物质的检出率分别为 91. 7% 和 87. 5% ，有1 个样本检出致敏物质多达 16 种; 水剂类样本中 24 种致敏物质的检出率最低，为 37. 5% 。说明乳霜265第 3 期陈 捷等: 化妆品中 24 种过敏原的气相色谱 质谱法测定和乳液类的驻留化妆品引起皮肤过敏潜在的危险性较大。另外，从表 3 可见，150 份样本中苎烯、芳樟醇和 2-甲基 3-( 4-叔-丁基苯基) 丙醛的检出率较高，分别为 41. 3% 、41. 3% 和 42. 7% ; 17 种过敏原 的最高检测值大于 100 mg / kg，超过 ec 1223 /2009 附录 化妆品限用物质清单中相应化妆品规定的限 用浓度 10 倍以上13，这说明在化妆品生产中，香料的使用还不规范。表 3 150 份化妆品中 24 种过敏原的检出率及最高检测值table 3detection rates and the highest measured values of 24 allergens in 150 cosmeticsthe hightestmeasured valuew / (mgkg 1 )positivesampledetection rate(% )allergen* hydroxy-citronellal(羟基香茅醛)842496247623986411401181552261399763005. 328. 032. 741. 331. 341. 326. 05. 342. 77. 326. 70. 712. 010. 034. 717. 38. 76. 06. 04. 74. 02. 00. 00. 010 5315 1213 4022 2711 4081 3767976084274142612542351681631501329127171011geraniol(香叶醇)* benzyl alcohol(苯甲醇)* d-limonene(苎烯)* -hexyl cinnamic aldehyde(己基肉桂醛)* linalool(芳樟醇)* citronellol (香茅醇)citral(柠檬醛)* 2-(4-tert-butybenzyl)propionaldehyde(2-甲基 3-(4-叔丁基苯)丙醛)* coumarin(香豆素)* -isom ethyl ionone(-异甲基紫罗兰酮)* methyl heptin carbonate(甲基庚炔碳酸盐)* cinnamal(肉桂酰胺)hydroxy-methylpentyl-cyclohexenecarboxaldehyde(新铃兰醛)* benzyl salicylate(水杨酸苄酯)benzyl benzoate(苯甲酸苄酯)isoeugenol(异丁子香酚) amylcinnamal(戊基肉桂醛) cinnamyl alcohol(肉桂醇) eugenol(丁子香酚)benzyl cinnamate(肉桂酸苄酯) anisyl alcohol(茴香醇) famesol(法尼醇)amylcinnamyl alcohol(2-苯亚甲基-1-庚醇)* detection value exceeds the restricting use concentration listed in the ec 1223 /2009 annex of more than 10 times2. 5患者发病原因分析本次跟踪因使用化妆品而致接触性皮炎的患者 77 人，检测样本 150 份，其中 117 份样本检出致敏物，检出率为 78% ，95 份样品检出至少 1 种致敏物含量超过法定使用限量( 10 mg / kg) ，占 117 份阳性样本的 81. 2% ; 77 名患者中 92. 2% 的患者( 71 人) 使用的化妆品检出致敏物，其中 64 个患者使用的化 妆品检出至少 1 种致敏物含量超过法定使用限量，占 71 名患者的 90. 1% ，说明患者确因使用含过敏原 的化妆品而发病。综上所述，化妆品中香料使用不规范，可造成过敏性体质的消费者发生化妆品接触性皮炎，本实 验检出的过敏物质是引起患者皮肤过敏的主要因素。本方法一次性同时分析 24 种过敏原，简便准确，适用于对化妆品中过敏物质的监测。参考文献:1qin y h regulation and evaluation of safety and efficacy for cosmetics beijing: chemical industry press(秦钰慧 化妆品管理及安全性和功效性评价 北京: 化学工业出版社)，2007: 752fang j，lai w，wang x m，li h，li d r，liu w chin. j. aesthetic med如，刘玮 中国美容医学)，2007，16(3): 362 364( 房军，赖维，王学民，李虹，李德3european parliament directive 2003 /15 / ec of the european parliament and of the council of 27 february 2003 mendingcouncil directive 76 /768 / eec on the approxination of the laws of the mernber states relating to cosmetic pruducts off j eur commun，2003，l664liang m，weng r r，feng j h，cai c p化妆品)，2001，6: 12 15flavour fragrance cosmetics(梁鸣，翁若荣，冯劲华，蔡春平 香料香精266分析测试学报第 31 卷5zhou x，mo j g，xie y x，li a f(1): 282 285food sci. technol (周翔，莫建光，谢一兴，李奥峰 食品科技)，2011，366wan q，xiao w，wang z z，shang q j. nanjing tcm univ (万琴，萧伟，王振中，尚强 南京中医药大学学报)，2010，26(4): 317 318xi h w，ma q，li q，lei h m，bai h，wang c j. instrum. anal ( 席海为，马强，李强，雷海民，白桦，王 超 分析测试学报)，2010，29(1): 46 50789wang c，wang x，ji m q chin. j. anal. lab(王超，王星，季美琴 分析试验室)，2006，25(11): 118 122