色谱1理论课件

主讲教师：姚彤炜,吴永江 浙 江 大 学 药 学 院 2007.911 高等药物分析 Advanced Pharmaceutical Analysis *1 教学进度与课程安排 时间内容 学时 07.9.10第1章 色谱基础理论（姚）2 07.9.17第3章 高效液相色谱法（姚）6 07.9.24第5章 手性色谱法（姚）4 07.10.8第2章 气相色谱法 第4章 离子色谱（吴） 4 07.10.15 第6章 高效毛细管电泳 第7章 超临界流体萃取与超临界 流 体色谱（吴） 4 Date2 时间内容学时 07.10.22第8章 高速逆流色谱法 第9章 联用技术（吴） 4 07.10.29第十章 免疫分析、芯片分析、 化学与生物传感器，其他分析方 法（查阅文献，分组讨论） 4 07.11.5小组代表发言（课堂交流）4 07.11.12开卷考试(占50%) +读书报告 (40%)课堂讨论（10） 2 注：第10章内容课外抽时间查文献 ，分组会上发言 。 Date3 第一章 色谱基础理论 概 述 z色谱法是利用物质在不同的两相中分配、 吸附或其他亲和作用的差异，通过多次重 复使微小的差别积累起来变成大的差异， 从而使混合物中各组分达到分离。 z色谱技术在近三十多年中的飞速发展已形 成一门专门的科学，称为色谱学。广泛应 用于各个领域，成为多组分混合物的最重 要的分离分析方法。 Date4 色谱法的分类 按流动相与固定相的分子聚集状态分类 u气相色谱法（气-固，气-液） u液相色谱法（液-固，液-液） u超临界流体色谱（SFC） 按操作形式分类 柱色谱，平面色谱，逆流分配 Date5 按色谱过程的分离机制分类 u吸附色谱（adsorption ） 利用吸附能力的差别； u分配色谱（partition ） 利用分配系数的差别； u空间（分子）排阻色谱（steric exclusion ）或称凝胶色谱法（gel ） 利用被测物分子大小不同而导致的渗透 系数差异。 Date6 u离子交换色谱（ion exchange ） 利用在离子交换树脂上的交换能力差别 。又可分为: t氨基酸分析（aminoacid analysis） t离子色谱法（ion chromatography） u亲合色谱（affinity ） 将生物活性配位基（酶、辅酶，抗体等 ）键合到载体表面形成固定相，利用亲合 力大小进行分离(专用于蛋白质等生化样品 ）。 Date7 u毛细管电色谱（capillary electro- ） 依靠色谱与电场两种作用力，利用分配 系数和电泳速度差别而分离。 u毛细管电泳 （capillary electrophoresis） 以高压电场为驱动力，根据样品组分的 淌度和分配系数而分离。 u手性色谱（chiral chromatography） 利用手性识别原理，用于手性药物的分 离分析。 Date8 填充柱 毛细管柱 毛细管电色谱 毛细管电泳 柱色谱 平面色谱 逆流分配色谱 GC LC SFC CEC 色 谱 法 经典液相色谱 HPLC 纸色谱法 薄层色谱法 薄膜色谱法 Date9 n色谱法特点 具有分离、分析功能，可排除组分间的相 互干扰，将组分逐个进行定性、定量。发 展快，应用广。 n色谱法在药物分析中应用 主要用于成分复杂的样品，如：制剂分析 、 中成药、天然药物提取分离、合成化合 物纯度、有关杂质分析、残留有机溶剂分 析、残留农药分析、药代动力学、生物利 用度，治疗药浓监测、生物制品药物分析 、临床诊断、法医鉴定等。 Date10 n色谱法发展 向自动化、联用型、人工智能化方向发展： u色谱-光谱联用 t气相色谱-付里叶变换红外光谱 t高效液相-紫外吸收光谱 t气相色谱-质谱（GC-MS） t高效液相-质谱（ HPLC- MS） t高效液相-付里叶变换红外光谱 t超临界流体色谱-质谱 t薄层色谱-紫外吸收光谱 t毛细管电泳-质谱 Date11 u色谱-色谱联用 t指二种色谱方法的联用，也称二维色 谱法。目的是用一种色谱法补充另一种 色谱法分离效果上的不足。常见的有： 气相色谱-气相色谱 高效液相-气相色谱 高效液相-高效液相 高效液相-薄层色谱 二维薄层色谱 t色谱-色谱联用法可提高分离效果，获 取更多的定性分析信息。 Date12 血浆中卡维地洛尔非手性/手性色谱分离实验装置 第1阀（04.2min,实线位置；4.218min,虚线 位置）；第2阀（03.7min,实线位置；3.7 18min,虚线位置）。 废 液 例 Date13 Date14 u热力学理论塔片理论 是由平衡的观点来研究分离过程，是一 种半经验理论，以塔片理论为代表。 u动力学理论速率理论 是从动力学观点，即速度来研究各种动 力学因素对柱效的影响，以Van Deemeter方程式为代表。 色谱理论色谱理论 Date15 n基本概念 u色谱峰（peak）样品 产生的电信号强度对洗脱时 间作图。称为流出曲线，浓 度 -时间曲线，也称色谱带 （band）。 u色谱峰有三种形式： t对称峰 t拖尾峰（tailing peak） t前延峰（leading peak） t(min) C Date16 n峰形参数： u对称因子（symmetry factor，fs） fs =(A+B)/2A； 或用： u拖尾因子（tailing factor，T）来衡量 T=W0.05h/2d1 tT=0.951.05(正常峰) tT0.95(前延峰) tT1.05(拖尾峰) Date17 T=W0.05h/2d1， 或fs=(A+B)/2A W0.05h = x =h/20 峰的对称性 h A B d1 x W0.05h Date18 n例1 测得某一物质的色谱峰高为 2.55cm, 则其0.05h=0.6275cm, n量取：W0.05h= 0.575cm， n量取：A= 0.285cm n计算T或fs，根据 nT=W0.05h/2d1 nfs=(A+B)/2A h A B d1x W0.05h T = 0.575 cm /T = 0.575 cm /（2 2 0.2850.285）cm=1. 009cm=1. 009 x = 0.05h Date19 u一个色谱峰，可用三项参数来描述： t峰高或峰面积定量 t峰位（保留值）定性 t峰宽 衡量柱效 峰面积(A)峰高 (h) tR tR Date20 u基线（base line ）在操作条件下，检 测器中只有流动相通过时的流出曲线称为 基线。它反映了仪器的噪音随时间的变化 。 t噪音（noise ，N）各种未知的偶然 因素引起的基线起伏的现象称为噪音。 噪音的大小用噪音带的宽度来描述。 N mv 基线漂移 Date21 n定性参数 u保留值 保留时间，保留体积 u相对保留值 u保留指数 Date22 n保留值 n保留时间（retention time ，tR）进样开始 到组分色谱峰顶点时间间隔。 u死时间（dead time ，t0或tM）流动相通 过色谱系统的时间。 ut0或tM的测定： tGC用空气峰（热导检测）或甲烷峰（ FID）测定 tHPLC溶剂峰前沿出现的时间，或用不 被固定相吸附或溶解的组分，如NaNO3（ 210nm测定）的保留时间。 Date23 n调整保留时间（adjusted retention time， tR ）也称为校正保留时间 某组分由于溶解或被吸附于固定相，比 不溶解或不被吸附的组分在柱中多停留 的时间，即： ntR= tR t0，在实验条件一定（温度、 固定相）， tR决定组分的性质，故tR 是定性的基本参数。 Date24 tR1 tR3 tR2 t0 tR3 tR2 tR1 mv time 进样 Date25 保留体积（retention volume，VR），又 称洗脱体积流动相携带样品进入色谱 柱，由进样开始到某组分在柱后出现浓度 极大值时，通过色谱柱的流动相体积。 对于对称峰，VR为样品组分被流动相带 出色谱柱1/2量时所需流动相体积： VR = tR Fc Fc为流速（ml/min），Fc一定时，VR 与 tR 成正比。 Fc大时tR就短，VR与流速 无关。 Date26 n相对保留值（1,2) 指组分（1）与参照物（2）两者调整 保留值的比值。 1,2= tR（1）/ tR（2） = K1/K2 (K为分配系数） 保留指数（保留指数（I I，KovatsKovats指数指数） 是把组分的保留行为换算成相当于是把组分的保留行为换算成相当于 含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述 。 Date27 n n 以以正构烷烃正构烷烃系列作为量度被测物相对保留值系列作为量度被测物相对保留值 的标准物。方法如下：的标准物。方法如下： uu用两个保留时间紧邻待测组分的标准物质来用两个保留时间紧邻待测组分的标准物质来 标定待测物的保留指数（标定待测物的保留指数（I I x x ） I I x x =100Z =100Zn n z z与与 z+nz+n代表含有代表含有z z与与z+nz+n个碳原子的正构烷个碳原子的正构烷 烃，烃，n n 可为可为1 1、2 2，通常，通常n=1n=1。 lg tR(x) lg tR(z) lg tR(z+n) lg tR(z) Date28 n n 例：乙酸正丁酯例：乙酸正丁酯I I值的测定，在一定色谱值的测定，在一定色谱 条件下（固定相，柱温），用正庚烷及条件下（固定相，柱温），用正庚烷及 正辛烷标定。正辛烷标定。 t0 n-c7 n-c8 乙酸正丁酯 Date29 uun-Cn-C 7 7 ：t t R R =174=174 uun-Cn-C 8 8 ：t t R R =373.4=373.4 uu乙酸正丁酯乙酸正丁酯： t t R R =310=310 uuz=7z=7，z+n=8z+n=8，n=1n=1 uu I I x x =1007 =10071 1 =775.6=775.6 uu说明乙酸说明乙酸正丁正丁酯在该色谱条件下的酯在该色谱条件下的 保留行为相当于含有保留行为相当于含有7.7567.756个碳的正个碳的正 构烷烃的保留行为。构烷烃的保留行为。 lg 373.4 lg 174 lg 310 lg 174 Date30 n在HPLC中应用的参照标准为系列烷酮： u脂肪族甲基酮系列 u烷芳基酮系列 u1硝基烷烃系列 例：应用脂肪族甲基酮系列（丙、丁、戊、 己、庚酮）对含黄酮类中药的指纹图谱进行 定性，考察了柱温、流动相、色谱柱、HPLC 仪等条件的微小变化对指纹图谱的影响，比 较共有峰的保留时间、相对保留值和保留指 数的RSD，结果保留指数的RSD是最小的。 Date31 样品 样品+37个碳烷酮 Date32 n三种定性参数比较 u保留值受色谱条件的影响大，通用性 较差。 u相对保留值减少了色谱条件的影响， 但对多组分的复杂样品，保留值差别 较大，只选一种参照物误差较大。 u保留指数是国际公认的色谱定性指标 。 有很好的重现性和准确性 。可利用文 献的保留指数进行定性，而不需纯品 对照。 Date33 uu此外保留指数还与温度、分子结构有密切此外保留指数还与温度、分子结构有密切 关系：关系： uu与温度有线性关系与温度有线性关系由此可求出不同柱由此可求出不同柱 温下温下 的保留指数（的保留指数（GCGC法）。法）。 例：某物的保留指数在例：某物的保留指数在100100是是654654，150 150 是是688 688 ，则可求出，则可求出125 125 时的保留指时的保留指 数应为数应为671671。 uu与分子结构有密切关系与分子结构有密切关系可通过分子结可通过分子结 构来预测保留指数或反之。构来预测保留指数或反之。 Date34 n柱效率的参数（色谱峰的区域宽度） u标准差（，standard deviation) u半峰宽（peak width at half-height， W1/2或Y1/2） u基线宽度（peak width，W或Y） Date35 u标准差在正态分布曲线中，将x=1处 （拐点）的峰宽之半称为标准偏差。在实际 工作中,标准差为峰高0.607h 处的峰宽之半 。 u峰形窄， 小，分散度小，柱效高。反之， 柱效低。 h 0.607h x x= 0x= 0时，曲时，曲 线的高度为线的高度为 峰高峰高h h Date36 n半峰宽也称半腰宽，为色谱峰高之 半处的峰宽。W1/2=2.355 ， W1/2易 确定，且比值大，故测量误差较小。 h 0.5h W1/2 Date37 n峰宽也称基线宽度。对色谱峰两侧的拐 点作切线,在极限上所截的距离,称为峰宽。 n对色谱峰两侧作切线后为等腰三角形，底边 为峰宽，而为等腰三角形高度之半处的宽 度之半，所以 ：W=4 W Date38 W h 0.5h 0.607h W1/2 WW1/2 1/2=2.355 =2.355 ，W=4W=4 =1.699W=1.699W1/2 1/2 Date39 n差速迁移（differential migration） 色谱过程是物质在相对运动着的两相 间，分布平衡的过程。 若混合物中二个组分的分配系数或吸 附平衡常数不等，则被流动相携带移 动的速度不等。 因差速迁移而被分离。 Date40 n分配系数（partition coefficient，K ） 在一定条件下，达到分配平衡后： 样品组分在固定相中的浓度（Cs） 样品组分在流动相中的浓度（Cm） K = Cs / Cm = = K K Date41 nK与保留时间（ tR ）的关系： ttR = t0 （1+KVs/Vm） ttR= t0 KVs/Vm uVs为色谱柱中固定相体积， Vm为色谱 柱中流动相体积，即固定相间隙体积。 u分配系数大柱上停留时间长 u物质的性质及色谱条件 K tR Date42 n容量因子（capacity factor，k） （保留因子retention factor， 分配比 partition ratio） k表示平衡后组分在两 相中的质量比。 uk= K（Vs/Vm），（K = Cs / Cm ） uk =（Cs Vs）/（Cm Vm） =Ws/Wm u又根据tR= t0 KVs/Vm，则有： uk= tR/t0= tR/t0 -1 utR = t0（k+1） Date43 色谱法最佳k 值范围 可用k 值范围 HPLC25110 GC20.220 TLC0.440.19 色谱法中 最佳分离 条件与可 用范围的 k值如表 所示： 根据根据t t R R = t= t 0 0 （k+1k+1），）， 有：有： k=0k=0， t t R R = t= t 0 0 k=1 k=1， t t R R = 2t= 2t 0 0 无保留 Date44 n分离参数 n分离参数用于衡量分离条件的优劣，常用 分离度，表示。 u分离度（resolution，R） uR= u即相邻两峰分开的距离是平均峰宽 (W1+W2)/2的几倍。 R大, 分离效果好。 2（tR2-tR1） W1+W2 Date45 R=0.5R=0.5 tR2-tR1=2，称为2分离。分离后各 峰露出的面积68.3% R=1.0R=1.0 称为4（峰顶间距为4），两峰峰 基略有重叠，裸露峰面积95.4% R=1.5R=1.5 tR2-tR1=6，称为6分离（峰顶间距 为6），分离后各峰露出的面积 99.7% R R 1.51.5R 1.5，称为完全分离 Date46 n n 例：例： 混合物中两组分混合物中两组分A A和和B B在在25cm25cm长的色谱柱长的色谱柱 上的上的t t R R 分别为分别为16.40min16.40min和和17.63min17.63min，而两个而两个 峰宽分别为峰宽分别为0.555cm0.555cm和和0.605cm 0.605cm ，纸速纸速 0.5cm/min0.5cm/min, , 求分离度。求分离度。 2(tR2-tR1) W1+W2 R=2（1. 23）/2. 32=1. 06 n n 首先换算峰宽单位首先换算峰宽单位： n n 0.555cm / 0.5cm =1.11min0.555cm / 0.5cm =1.11min n n 0.605cm/ 0.5cm = 1.21min 0.605cm/ 0.5cm = 1.21min Date47 uu影响分离度的因素影响分离度的因素 t t 分配系数比（分配系数比（ ） t t 容量因子（容量因子（kk） t t 柱效（柱效（n n） R=( 4 ) ( -1 k2+1 ) k2 ) ( 从三者对分离度从三者对分离度R R关系的公式看，关系的公式看， 1 1是分离的前提。要将各组分分离，是分离的前提。要将各组分分离， 必须选择适宜的固定相、流动相流速、柱温等。必须选择适宜的固定相、流动相流速、柱温等。 Date48 na为柱效项，b为柱选择性项，c为容量因 子项。 n=K2/K1= t tR2 R2/ t / tR1 R1= = k2/ k1, n在K1 K2 的前提下，柱效项与容量因子 项越大，分离度越大。 a b c R=( 4 ) ( -1 k2+1 ) k2 ) ( Date49 1.0 1.001 1.01 1.1 1.2 1.5 2.0 (-1)/ 0 0.001 0.01 0.091 0.167 0.33 0.50 n 1.01 1.1 （9%），R （ 9倍） n 1.5 2.0 （33%），R (1.5倍) n上表说明在1附近变化，对分离度R改善 非常有效。 Date50 n n 在在 1 1的前提下，柱容量的前提下，柱容量kk值越大，值越大，R R 也越大。但当也越大。但当k k超过超过2020时，时， kk再增加再增加 ， k k / /（1+k1+k ）增加不明显。）增加不明显。一般一般kk不不 超过超过2020。 k k/（1+k）k k/（1+k） 0.1 0.33 1.0 0.50 3.0 0.75 5.0 0.83 8.0 0.89 10 0.91 20 0.95 30 0.97 50 0.98 Date51 假定 n=5000 Date52 假定 k=3 Date53 假定a=1.1 Date54 n塔板理论 u把色谱柱看作一个分馏塔，在每个塔板的 间隔内，样品混合物在气液两相中达到分 配平衡，经多次分配平衡后，分配系数小 的组分（挥发性大的组分）先到达塔顶（ 先流出色谱柱）。由于色谱柱的塔板相当 多，因此分配系数的微小差别就可获得很 好的分离效果。 u在柱内一小段长度H内（相当于一个分馏 塔），组分可以很快在两相间达到平衡， H称为理论塔板高度。 Date55 n理论板数（n）与理论板高度（H） n=（tR/）2 n=5.54 （tR/w 1/2）2 n= 16 (tR/w)2 un 越大 ，柱效越高。 u如果用tR计算理论板数，所得值为有 效理论板数 n有效 Date56 n理论板数取决于： u固定相种类、性质、填充状况、柱长 ； u流动相及其流速； u被测物性质等。 n理论板高 (H) nH=L / n nL为色谱柱长度，当L一定时，H与n呈反 比，即H越小，柱效越高。 Date57 u例： 测得某一物质的保留时间为 1.5min，半峰宽为0.2cm，柱长2m， 记录纸速为2.0cm/min，求n和H？ un=5.54（ ）2=1246 uH=2000/1246=1.6mm 1.5min1.5min 0.2cm0.2cm 2.0cm/min2.0cm/min Date58 n n 塔板理论在解释流出曲线的形状