动物固体组织蛋白提取_Protocol.doc

动物固体组织蛋白提取 protocol1、 前夜将磁珠及匀浆管洗净置入 75乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也 可放入烤箱中，速度较快。2、 裂解液配制：ripa：pmsf100：1，现配现用。 。 （1000ulripa10ulpmsf）置 入 4冰 上。3、抽蛋白（应冰上进行）：a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般 10ml 管体系中加入：7-8 粒磁珠、100mg 组织、1mlripa10ulpmsf、1 tablet cocktail。b、匀浆。手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合 ，充分研碎，物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68 分钟）使组织匀浆化。机器匀浆：用组织捣碎机 1000015000r/min 上下研磨制成 10组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 35 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 35 次。反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶 3 次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复 3 次左右），但有部分酶活力会受影响。c、将组织匀浆转入 1.5ml 的 ep 管中（eppendorf 管、离心管） 12000r/min 4c 离心 15min。 。d、离心后 ep 管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的 ep 管中。可-80保存。4、蛋白浓度测定。 。a、配工作液：溶液 a：溶液 b50：1（200ul：4ul） 需测试复孔。标本 x，则需 a 量2（x11）200；b2（x11）4。 wt lostc、复孔，取蛋白 6ul 加入 0.6mlep 管，再加入 54ulh2o，混匀。即 10 倍稀释。d、取 20-25ul 10 倍稀释蛋白样本加入 96 孔板平底板内，再加入 200ulab 工作液，混匀振荡后，37 incubate 30min。注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换 tip，再加入工作液即起反应，应缩短时间。e、酶标仪检测 562nm 吸光度。programf、计算蛋白浓度。根据标准曲线，如 y1.2745x-0.1684 其中 y：蛋白浓度；x：吸光度。 最终蛋白浓度为：10y（ug/ul、mg/ml）g、蛋白样本放-80冻存。 大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。 commassie 法（bradford 法）： 原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料 g-250 结合， 在 颜色从棕色变为蓝色， 595nm处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。 bca 法： 原理：在碱性条件下，蛋白将 cu还原为 cu，cu与 bca 试剂形成紫色络合物，测定其在 562nm 处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 现对这两种方法进行比较： 一、实验材料： 细胞总蛋白提取试剂盒（ar0103） m231 bca 蛋白定量试剂盒（ar0146） commassie 改良增强型蛋白质定量试剂盒（ar0145） 二、操作步骤： commassie 法： 1.将 bsa 冻干标准品 用生理盐水或 pbs 稀释成 2000ug/ml， （10mg/支） 1000 ug/ml500ug/ml250 ug/ml125 ug/ml62.5 ug/ml31.25 ug/ml15.625 ug/ml 八个浓度的蛋白标准溶液。 2.m231 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。 3.各取 20ul 蛋白标准品和待测 m231 样品至相应标记的微孔板中。 4.滴加 200ul 考马斯增强型试剂（溶液 a）至每孔混匀并充分震荡 30s 5.停止震荡，在室温孵育样品 10min 6.在酶标仪中测量 595nm 时的吸光值。 7.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。 bca 法： 充分混匀。 1.按 50 体积 bca 试剂 a 加入 1 倍体积 bca 试剂 b 配置适量 bca 工作液， 2.将 bsa 冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或 pbs 稀释成 2000ug/ml，1000ug/ml500 ug/ml250 ug/ml125 ug/ml62.5 ug/ml31.25 ug/ml15.625 ug/ml 八个浓度的蛋白标准溶液。 3.m231 用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。 4.各取 20ul 蛋白标准品和待测 m231 样品至相应标记的微孔板中。 5.滴加 200ulbca 工作液至每孔混匀并充分震荡 30s 6.停止震荡，在 37 度孵育样品 30min 7.在酶标仪中测量 562nm 时的吸光值。 8.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。 三、实验结果 1 2 3 4 5 6 7commsie 0.53 0.522 0.431 0.262 0.118 0.041 0.001法吸光值bca 法吸光 0.812 0.444 0.257 0.14 0.06 0.037 0.017值其中 1 到 8 为 2000ug/ml，100050025012562.531.2515.625 的标准浓度的 bsa 蛋白， 为空白孔， 9 样品 1 为 8 倍稀释 m231 总蛋白，样品 2 为 32 倍稀释 m231总蛋白 commassie 法： 为了测试准确，应在试剂加入后的 520min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。 由标准曲线可以算出样品原始浓度为 14.4mg/ml commassie 法优点是： 1.灵敏度高，据估计比 lowry 法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达 1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 lowry 法要大的多。 2.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要 5 分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2 分钟即可完成，其颜色可以在 1 小时内保持稳定，且在 5 分钟至 20 分钟之间，颜色的稳定性最好。 3.干扰物质少。如干扰 lowry 法的 k、na、mg2离子、tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta 等均不干扰此测定法。 此法的缺点是： 1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 g球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和 0.1m 的 naoh。（如同 0.1m 的酸干扰 lowary 法一样）。 3. 标准曲线也有轻微的非线性，在 0-1000ug/ml 浓度范围内有较好线性。因而不能用beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 bca 法： 由标准曲线可以算出样品原始浓度为 14.28mg/ml bca 法特点： 1. 灵敏度高， 检测浓度下限达到 25g/ml，最小检测蛋白量达到 0.5g，待测样品体积为 1-20l 。 2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达 5的 sds，5的 triton x-100，5的 tween 20，60，80。 3.在 20-2000g/ml 浓度范围内有良好的线性关系。 4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。 5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：edta 小于 10mm。dtt 小于 1mm 巯基乙醇低于 1mm bca 法和 commassie 法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。（radio immunoprecipitation assay）ripa 裂解液ripa lysis buffer是一种传统的细胞组织快速裂解液。ripa 裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的 western、ip 等。ripa 使用方法对于培养细胞样品：1. 融解 ripa 裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 pmsf，使 pmsf的最终浓度为 1mm。2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用 pbs、生理盐水或无血清培养液洗一遍如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗。按照 6 孔板每孔加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞 1-2 秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成 50-100 万细胞/管，然后再裂解。裂解液用量说明：通常 6 孔板每孔细胞加入 150 微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200 微升或 250 微升。对于组织样品：1. 把组织剪切成细小的碎片。2. 融解 ripa 裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 pmsf，使 pmsf的最终浓度为 1mm。3. 按照每 20 毫克组织加入 150-250 微升裂解液的比例加入裂解液。如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适奔跎倭呀庖旱挠昧俊?. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。5. 充分裂解后，10000-14000g 离心 3-5 分钟，取上清，即可进行后续的 page、western 和免疫沉淀等操作。6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 vortex 使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。注：ripa 裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组dna 等的复合物。在不检测和基因组 dna 结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如nfb、p53 等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。各种 ripa 的差别及用途 western 及 ripa 裂解液 ripa 裂解液 ripa 裂解液 np-40 sds产品名称 ip 细胞裂解 （强） （中） （弱） 裂解液 裂解液 液 1 triton 1 np-40 1 np-40 1 triton x-100 1 0.5 1 1有效裂解成分 0.25 x-100 deoxycholate deoxycholate np-40 sds deoxycholate 0.1 sds 0.1 sds裂解强度 温和 强 中 温和 温和 强对膜蛋白的提 一般 很好 较好 一般 一般 很好取对胞浆蛋白的 很好 很好 很好 很好 很好 很好提取对核蛋白的提 较好 很好 较好 较好 较好 很好取胞浆磷酸化蛋 很好 很好 很好 很好 很好 很好白提取细胞核转录因 很好 很好 很好 很好 很?很好子提取含蛋白酶抑制 是 是 是 是 是 是剂含磷酸酯酶抑 是 是 是 是 是 是制剂 wb wb wb主要用途 wb ip wb ip wb ip co-ip ipco-ip ipco-ip chip蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全摘要：破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了 5 种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。 蛋白酶抑制剂 破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5 种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。 常用抑制剂 pmsf phenylmethanesulfonyl fluoride（剧毒） 1抑制丝氨酸蛋白酶如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶和巯基蛋白酶如木瓜蛋白酶 210mg/ml 溶于异丙醇中 3在室温下可保存一年 2-8可以存放数月之久。欲长期保存，可冻存在-20 4工作浓度:17174ug/ml0.11.0mmol/l 储存液浓度为 100 或 200mm 5在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的 pmsf。 edta 1抑制金属蛋白水解酶 20.5mol/l 水溶液，ph89 3溶液在 4稳定六个月以上 4工作浓度:0.51.5mmol/l. 0.20.5mg/ml 5加入 naoh 调节溶液的 ph 值，否则 edta 不溶解。 胃蛋白酶抑制剂pepstantin l抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶 d 和凝乳酶 21mg/ml 溶于甲醇中 3储存液在 4一周内稳定，-20稳定 6 个月 41 作浓度:0.7ug/ml1umol/l 5在水中不溶解。 亮抑蛋白酶肽leupeptin 1抑制丝氨酸和巯基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶 b 2lomg/ml 溶于水 3储存液 4稳定一周，-20稳定 6 个月 4工作浓度 0.5mg/ml。 胰蛋白酶抑制剂aprotinin 1抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 2lomg/ml 溶于水，ph78 3储存液 4稳定一周，-20稳定 6 个月 4工作浓度:0.062.0ug/ml0.010.3umol/l 5避免反复冻融: 6在 ph12.8 时失活。 蛋白酶抑制剂混合使用 35ug/ml pmsf丝氨酸蛋白酶抑制剂 0.3mg/ml edta金属蛋白酶抑制剂 0.7ug/ml 胃蛋白酶抑制剂pepstatin酸性蛋白酶抑制剂 0.5ug/ml 亮抑蛋白肽酶leupeptin广谱蛋白酶抑制剂 常用蛋白酶抑制剂表 抑制剂 靶蛋白酶 有效浓度 储藏溶液 注解 antipain 木瓜酶和胰酶 50g/ml 1mg/ml 水溶液 对胰凝蛋白酶，胃液 素，纤溶酶无影响 apmsf 胰蛋白酶样丝氨酸 10-40g/ml 或 100mmol/l 水溶液 毒性比 pmsf 低，不 蛋白酶 10-20m 能抑制胰凝蛋白酶 或乙酰胆碱酯酶 抑肽酶 丝氨酸蛋白酶 0.06-2g/ml 10mg/mlpbs 溶液 避免反复动冻融 抑氨肽酶 b 氨基肽酶 40g/ml 溶于甲醇 不能抑制羧肽酶calpain 抑制剂、 calpain 钙依赖性 :17g/ml 溶于乙醇 可渗透薄膜 半胱氨酸蛋白酶 :7g/ml 抑糜朊酶素 胰凝乳蛋白酶 6-60g/ml 溶于 dmso b.m.综合酶片 丝氨酸，半胱氨酸和 每 10-50ml 细胞提 不含 edta 金属蛋白酶 取液内加一片 edta 金属蛋白酶 0.2-0.5mg/ml 或 500mmol/l 水溶液 0.5-1.3mol/l ph8.0 抑蛋白酶醛肽 丝氨酸蛋白酶，巯基 0.5-2g/ml 10mg/ml 水溶液 蛋白酶 a2-巨球蛋白 广谱 1/ml 100/ml pbs 溶液 避免接触还原剂 pefabloc scboe- 丝氨酸蛋白酶 0.1-1.0mg/ml 或 100mm 水溶液 无毒，在中性 ph 下hringer mannheim 0.4-4mmol/l 较 pmsf 稳定 胃蛋白酶抑制剂 酸性蛋白酶 0.7g/ml 1mg/ml 甲醇溶液 pmsf 丝氨酸蛋白酶 17-170g/ml 10m