层析简介课件

2009 PerkinElmer 层层析技术简术简 介 2 2 一.液相层析的原理和参数 二.层析方法确定的步骤和优选 3 3 液相层析的原理和参数 层层析的种类类 分子排阻层析Gel Filtration 离子交换层 析Ion Exchange(IEC) 疏水层析Hydrophobic Interaction 亲和层析Affinity 金属螯合层析(IMAC) 4 4 分子排阻层析Gel Filtration 分子排阻层析又可称为凝胶层析或分子筛层 析，是按照蛋白质分子 量大小进行分离的技术。单个凝胶珠本身象个“筛子“。不同类型凝胶 的筛孔的大小不同。如果将这样 的凝胶装入一个足够长 的柱子中， 作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样 品加到凝胶柱上时，比 凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续 不断地穿入珠子的内部，这样 的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大 ，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间 越长 。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通 过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤 所用的凝胶孔径大 小的选择 主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 5 5 分子排阻层析Gel Filtration 6 6 离子交换层 析Ion Exchange(IEC) 离子交换层 析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为 固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂 上的平衡离子进行 可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。固定 相是离子交换剂 的层析分离技术。样品中待分离的溶质离子，与固 定相上所结合的离子交换，不同的溶质离子与离子交换剂 上离子化 的基团的亲和力和结合条件不同，洗脱液流过时 ，样品中的离子按 结合力的弱强先后洗脱 7 7 离子交换层 析Ion Exchange(IEC) 8 8 疏水层析Hydrophobic Interaction 固定相由非极性物质(如烃类 、苯基等)组成的层析。非极性分子间或 分子的非极性基团间 具有吸引力，不同分子的非极性基团与固定相非 极性物质结 合的强弱不同，从而达到分离。多用于蛋白质分析和分离 9 9 亲和层析Affinity 利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的 一种层析技术。可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等 亲和作用而设计 的各种层析分离方法。如用寡脱氧胸苷酸-纤维 素分 离纯化信使核糖核酸；用DNA-纤维 素分离依赖DNA的DNA聚合酶；用 琼脂糖-抗体制剂分离抗原；用金属螯合柱分离带有成串组氨酸标签 的重组蛋白质等。 1010 亲和层析Affinity 1111 金属螯合层析(IMAC) 金属螯合层析是利用固定相偶联的配基亚氨基二乙酸(IDA)及金属 离子发生螯合作用，该金属离子又与蛋白分子中的某些含有巯基或咪 唑基的氨基酸结合。 金属螯合层析主要分为3个阶段：第一阶段是螯合介质与二价金属离 子作用生成金属螯合介质；第二阶段是在一定的条件下金属螯合介质 与被分离蛋白质分子形成金属螯合复合物；第三阶段是从金属螯合介 质上将被分离物质解吸下来。 1212 金属螯合层析(IMAC) 1313 层层析的一些参数 吸附等温线线 塔板效率 动态载动态载 量 1414 层析的参数1-吸附等温线 概念：吸附等温曲线是指在一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸 附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。在一定温度 下,分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附方程式来表示 1515 层析的参数1-吸附等温线 吸附等温线：线性和非线性 线性：浓度不高时，峰的位置不变，峰的面积与浓度成正比 非线性：浓度高时，峰的位置偏移，面积不成正比 1616 层析的参数2-塔板理论 动动力学分析：塔板理论论 1.理论塔板数 2.柱效 3.塔板高度 N=5.54(V/W1/2)2 H=L/N W1/2：半高宽 V：洗脱体积 1717 层析的参数2-塔板理论 柱效和流速的关系 1.有一个最佳流速 2.塔板越高，效率越低 3.一般选择平衡产量位置 1818 层析的参数3-动态载 量 动态载动态载 量：制备层 析介质的重要性能指标，目标是追求更快条件下 的更高动态载 量。 概念：定流速下介质的可用效率 测定方法： 将柱移离系统 进样 冲洗系统至检测讯 号平头 连接层析柱 继续 加样至检测讯 号达平头数值的5% 将步骤3，4记下期间体积 将样品中蛋白浓度乘以此体积 1919 层析的参数3-动态载 量 影响因素一：介质孔径 孔的开放性越大，扩散越快，对层 析的流速越不敏感；反之亦反 传统 介质随流速上升，载量下降迅速；现代介质随流速上升，载 量下降不明显 绝对值 上还是传统 介质的载量最高，最大100mg/ml 影响因素二：蛋白大小 蛋白质越小，扩散速度越高，越接近平衡，动态载 量对流速越不 敏感。 2020 层析的参数3-动态载 量 影响因素三：介质颗 粒 介质颗 粒越小，载量越高 条件允许的情况下尽量使用小颗粒 影响因素四：吸附基团长 度 吸附基团排布在线形聚合物长链 上，形成触手，吸附基团有效性 增加，载量增加。 2121 层析的参