Chapter_2_蛋白质-3-蛋白质分离技术.ppt

Chapter 2 蛋白质 Chapter 2 蛋白质 2.1 蛋白质的概念、重要性及分类 2.2 氨基酸 2.3 蛋白质的结构 2.4 蛋白质的结构和功能的关系 2.5 蛋白质的性质 2.6 蛋白质的提取、分离和纯化 2.6 蛋白质的分离、纯化 研究一个新的蛋白质首先要从它的基本 性质作为突破口，然后根据它的基本性质进 行分离纯化，最终用纯品对其进行分析鉴定 。如果对蛋白质的基本性质尚未搞清楚，工 作起来将会困难重重。 因此，蛋白质研究技术主要是对蛋白质 的基本性质进行的分析鉴定。 研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要 得到纯的蛋白质样品。 (1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细 胞； (2)分离和纯化过程都必须04的低温下进行 。 蛋白质的分离、纯化 1蛋白质的分离步骤 (1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨 法、超声波法、冻融法和酶解法等。 (2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行 抽提。 水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提； 酸性蛋白用稀碱性溶液抽提； 脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。 (3)粗提: 离心除去固体杂质后，可通过盐析 、沉淀法、凝胶滤法、超过滤等处理，得到蛋 白质粗制品。 (4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。 (5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成 品。 2蛋白质的纯化方法 透析是利用蛋白质分子不能透过半透 膜，而使它与其它小分子化合物，如 无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽 以及水等分离。 常用的半透膜是玻璃纸或称赛璐玢 纸、火棉纸和其它合成材料。膜有 玻璃纸或高分子合成材料，截止分 子量一般为1万。 （1）透析法（dialysis) 透析法 2蛋白质的纯化方法 此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的 介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰 胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的 网状结构。 凝胶层析介质： Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200 Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6B Sephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶 S100,S200,S300,S400 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 凝胶过滤原理 当不同大小的蛋白质颗粒流经凝胶柱 时，比凝胶网孔大的分子不能进入凝胶珠内的网状结构， 而被排阻在凝胶珠外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下 移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由 出入凝胶珠的内外。 大分子 小分 子 凝胶颗粒 凝胶排阻 示意图解 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 蛋白质分子一般有两种形状，一种是球形分子 ，另一种是线性分子。线性蛋白质分子与球形分子 比较，同样大小分子量的蛋白质，线性分子体积大 流速快，球形分子体积小流速慢。因此，在凝胶色 谱柱中无论是球形分子还是线性分子都可进行分离 ，但球形分子比线性分子的分离度好。 此法是利用离子交换剂作为柱层析支持物，将带有 不同电荷的蛋白质进行分离的方法。 离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基 纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基 纤维素等）。 带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷 少的蛋白质与树脂结合则较弱。 用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行 梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，或是改变 流动相的PH值，或是同时采用这两种方法，可 以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。 离子交换层析 2蛋白质的纯化方法 离子交换层析 这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同 的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有 不同的识别和结合能力。 选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配 基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。 将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有 待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即 与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而 其它蛋白质则流出柱外。 被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的 配体洗脱液或高盐溶液洗脱。 亲和层析亲和层析 2蛋白质的纯化方法 + C CC 配基 蛋白质 1.配基固相化2.亲和吸附 固体载体 3.解吸附 在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性 相反的电极移动，这种现象称为电泳。 带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v） 取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与 介质的摩擦系数(f)。 常用的电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电 聚焦电泳、双向电泳等。 2蛋白质的纯化方法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定法 SDS-聚丙烯酰烯酰 胺凝胶电电泳，也称为为十二烷烷基酸钠钠- 聚丙烯酰烯酰 胺凝胶电电泳(sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)。 主要用于蛋白质亚质亚 基分子量的测测定。 (1)原理： a.蛋白质分子状态 在自然状态态下蛋白质质通过过二硫键键聚合形成高度折叠的生物大分子 ，在水溶液中，由于氨基酸残基的解离作用使蛋白质质分子形成带带有 一定净电净电 荷的分子。在电场电场 下向自身电电荷相反的方向移动动。 b. 还原剂的解聚作用 在蛋白溶液和分离凝胶介质中加入还原剂-巯基乙 醇(- mercaptoethanol)或二硫苏糖醇 (Dithiothretiol, DTT)。蛋白质分子在还原剂作用下二 硫键被还原，将多聚体或单链折叠的蛋白质分子的二硫 键打开，形成长短不一的单链亚基。 c. SDS的包裹作用 SDS分子中含有大量的带负电的磺酸基。蛋白质分子解聚后形 成的氨基酸侧链与SDS结合，在SDS的重量达到蛋白重量的3-4倍时 蛋白质分子表面完全被SDS包裹，形成带负电荷的蛋白质亚基分子 ，称之为蛋白质-SDS复合物( protein-SDS micelles)。 由于蛋白质-SDS复合物所带负电荷远大于蛋白质分子自身有的 净电荷，这样就消除了不同分子之间原有的电荷差异。 d. 聚丙烯酰胺凝胶分子筛作用 不同浓度的凝胶和交联度，形成不同大小的网状结构，它对蛋白 质-SDS复合物具有阻滞作用。在电场下，分子量大的亚基受阻大， 电泳速度慢，走在小分子的后面；分子量小的亚基受阻小，电泳速 度快，走在大分子的前面。不同分子量的亚基受阻程度不同，表现 出不同的电泳速度，这样就把同一样品中不同大小分子量的亚基分 开。 (2) 操作过程 制胶 加样 电泳 固定 染色 脱色 计算 (3) 结果处理 a. 电泳图谱 1 2 3 b.标准曲线 绘制标准曲线：以标准蛋白质分子量的对数log(M)为纵坐标，Rf值 为横坐标，绘制标准曲线。 mR lgMr 兔肌动蛋白 牛血清白蛋白 兔磷酸化酶 牛碳酸酐酶 胰蛋白酶抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 c.未知蛋白分子量计算： 将未知蛋白的Rf值查到log(M)值，便可知其分子量。计算分子量 。 (4) 影响因素 影响SDS-复合物形成的主要因素。SDS-电泳成败关之一，是在 制备样品的过程中，蛋白质与SDS结合的程度直接影响电泳分离效 果。影响结合的因素主要有三个: A.溶液中SDS单体的浓度 SDS在水溶液中以单体和SDS复合物混合存在的，能与蛋白质结 合的只能是单体。单体的浓度与SDS总浓度，温度和离子强度有关 。在一定温度和离子强度下，SDS处于一饱和值，即单体浓度不再 随SDS中浓度增加而增加。为了使SDS与蛋白质结合充分，SDS和蛋 白质结合的重量比一般是4:1或3:1。 B. 样品缓冲液离子强度 因为SDS结合到蛋白质分子上的量取决于平衡时SDS单体浓度， 而不是总浓度，只有在较低的离子强度溶液中，SDS单体才具有较 高的平衡浓度，所以样品缓冲液应选用低离子强度，通常是10- 100mmol/l之间。 C. 二硫键是否完全打开 只有蛋白质分子中的二硫键完全被打开，蛋白质分子完全解聚， SDS充分与亚基分子结合，才能准确测定出亚基分子量。二硫键完 全被打开要取决于巯基乙醇的质量和使用的剂量。若蛋白质分子的 二硫键只是部分被打开，这是测出的分子量是蛋白质分子和亚基分 子的混合物。 等电聚焦电泳(isoelectric focusing, IEF ） a. 原理: 通常是指聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳。它是60年代初建立起 来的一种蛋白质分离手段，现在已经成为单向蛋白质电泳分辨率最 高的一种分离技术。 它是利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点的差异进行电泳 分离和分析。蛋白质在一个稳定的线性pH梯度的凝胶中电泳，蛋白 质朝着与自身电荷相反的方向移动，在移动的过程中不断被凝胶中 的反离子中和，最后静电荷完全被中和而停止运动，聚焦在等电点 的位置。 b.蛋白质与两性电解质 (1)蛋白质的等电点 蛋白质属于一种两性电解质。在不同的pH环境中所带的正负电 荷不同。若在某特定的pH环境中其净电荷为零，此时的pH为该蛋白 质的等电点，在电场下不泳动。 (2)载体两性电解质： 在等电聚焦电泳中，载体两性电解质具有以下两种功能 ： A 中和功能： 两性电解质的性质在分离系统中形成一个平衡稳定的pH 梯度，提供中和蛋白质电荷的离子，具有pH缓冲能。 B 载电功能： 两性电解质作为电的载体，具有运载“电流”的能力， 有良好的导电性能 水平板式电泳槽 垂直板式电泳槽 等电聚焦时，蛋白质混合物的分离是在具有PH梯度的介质 中进行的。在电场中，每种蛋白质成分将移向并“聚焦” （停留在等于其等电点的PH梯度处，形成一个很窄的区带 。它的分辨率很高，可以把人的血清分成40多个区带。适 于做同工酶的鉴定。 方法: 制胶 加样 电泳 固定 染色 脱色 计算 等电聚焦 双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进 行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（ 按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋 白质图。 肽的