细胞氧化应激基本概念

1、细胞氧化 细胞生命活动过程中所需的能量约有 95%是来自于线粒体，其来源是将细胞 内的供能物质氧化、分 解、释放能量，并排出 CO2 和 H2O，这一过程称之为细胞氧化（cellular oxidation)，又称细胞呼吸 （cellular respiration)。其基本步骤有：糖酵乙酰辅酶 A（CoA)的形成、进行三羧酸循环及电子传递 和化学渗透偶联磷酸化作用。酶能使细胞的氧化过程在此比较低的温度下进行，并释放出仅仅使细胞能够 扑获和储存的能量。这个受生物学控制的氧化结果起初就和简单的燃烧现象一样：复杂的分子被降解为水， 二氧化碳，并释放能量。这个过程中一些经过交换的电子永久地逃离细胞的呼吸或从呼吸中心遗漏掉并同 周围的氧分子相互作用，产生有毒性氧分子自由基。在细胞呼吸的过程中，估计有 2-5%的电子转化为 过氧化物分子和其他类型的氧化自由基，自由基的持续增加就对机体组织造成大量的氧化压力。自由基被 认为与大约 60 种(而且至少是 60 种)疾病的发生有关，科学有证据证实，抗氧化剂能停止甚至逆转(在某 些疾病中)由于自由基所导致的损伤。自由基与机体细胞发生作用后，给机体留下了毁灭性的灾难。在细 胞膜上留下了许多微笑的孔洞，使细胞的分子结构发生改变，破坏了细胞的蛋白和脂类分子。一旦我们机 体细胞内有足够的抗氧化剂储备，我们就能将自由基对机体的损伤程度降到最低。 2、OS 氧化应激（Oxidative Stress，OS）是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞 炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用， 并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。指机体在内外环境有害刺激的条件下，体内产生活性氧自由 基（Reactive Oxygen Species，ROS）和活性氮自由基（Reactive Ntrogen Species，RNS）所引起的细 胞和组织的生理和病理反应。ROS 有超氧阴离子（.O2-） 、羟自由基（.OH-）和过氧化氢（H2O2）等等； RNS 有一氧化氮（NO） 、二氧化碳（CO2）和过氧亚硝酸盐（.ONOO-）等等。由于它们可以直接或间接氧化 或损伤 DNA、蛋白质和脂质，可诱发基因的突变、蛋白质变性和脂质过氧化，被认为是人体衰老和各种重 要疾病如肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病（老年痴呆） 、糖尿病-最重要的危氧化应激和抗氧化不单 纯是一种生化反应，它更有着极其复杂的细胞和分子机制，包括膜氧化、线粒体代谢、内质网应激、核的 重构、DNA 损伤修复、基因转录表达、泛素和泛素化、自吞和溶酶体、细胞外基质、信号传递、蛋白折叠 等多重的细胞和分子改变。 3、ROS 需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，包括：O2 -、H2O2 及 HO2、OH 等。 4、细胞凋亡 细胞凋亡（apoptosis ）是维持正常组织形态和一定功能的主动自杀过程，是在基因控制下按照一定 程序进行的细胞死亡，故又称为程序性细胞死亡（ PCD ） 5、SOD 超氧化物歧化酶 Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称： SOD。SOD 是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断 地补充 SOD 具有抗衰老的特殊效果。是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植 物，微生物等。SOD 具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD 在生物体内的水平高 低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达 60 多种。它可对抗与阻断因氧 自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。 6、P53 因编码一种分子质量为 53 kDa 的蛋白质而得名，是一种抗癌基因。其表达产物为基因调节蛋白（P53 蛋白） ，当 DNA 受到损伤时表达产物急剧增加，可抑制细胞周期进一步运转。一旦 p53 基因发生突变，P53 蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变，人类癌症中约有一半是由于该基因发生突变失活。 7、MTT 四甲基偶氮唑盐，MTT 主要有两个用途 1药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定； 2细胞增殖及细胞活性测定。 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 （Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪 在 490nm 波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的 吸光度值（OD 值） ，来判断活细胞数量，OD 值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性 越小） 。 8、黄嘌呤氧化酶法测定抗氧化能力 黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺成亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺 酸与甲萘胺作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含 SOD 时，则对超氧阴离 子自由基有专一性抑止作用，使可形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于空白管的吸光度值， 通过公式计算可求出被测样品中 SOD 的活力。 9、信号通路 当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根据这种信息来做出反 应的现象，叫做信号通路。 信号通路分为两类： 一是当信号分子是胆固醇等脂质时，它们可以轻易穿过细胞膜，在细胞质内与目的受体相结合； 一是当信号分子是多肽时，它们只能与细胞膜上的蛋白质等受体结合，这些受体大都是跨膜蛋白，通 过构象变化，将信号从膜外 domain 传到膜内的 domain，然后再与下一级别受体作用，通过磷酸化等修饰 化激活下一级别通路。 信号通路（signal pathway）的提出最早可以追溯到 1972 年，不过那时被称为信号转换（signal transmission） 。1980 年，M. Rodbell 在一篇综述中提到信号转导（signal transduction） ，此后这个概 念就被广泛使用了4。信号通路是指能将细胞外的分子信号经细胞膜传入细胞内发挥效应的一系列酶促 反应通路。这些细胞外的分子信号（称为配体，ligand）包括激素、生长因子、细胞因子、神经递质以及 其它小分子化合物等。当配体特异性地结合到细胞膜或细胞内的受体（receptor）后，在细胞内的信号又 是如何传递的呢？ 细胞内各种不同的生化反应途径都是由一系列不同的蛋白组成的，执行着不同的生理生化功能。各个 信号通路中上游蛋白对下游蛋白活性的调节（包括激活或抑制作用）主要是通过添加或去除磷酸基团，从 而改变下游蛋白的立体构象完成的。所以，构成信号通路的主要成员是蛋白激酶和磷酸酶，它们能够快速 改变和恢复下游蛋白的构象。从细胞受体接收外界信号到最后做出综合性应答，不仅是一个信号转导过程， 更重要的是将外界信号进行逐步放大的过程。受体蛋白将细胞外信号转变为细胞内信号，经信号级联放大、 分散和调节，最终产生一系列综合性的细胞应答，包括下游基因表达的调节、细胞内酶活性的变化、细胞 骨架构型和 DNA 合成的改变等（如图 3） 。这些变化并非都是由一种信号引起的，也可以通过几种信号的 不同组合产生不同的反应. 10、细胞因子 细胞因子（cytokine,CK）是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多 肽。 细胞因子是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有 免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可被分为白细胞介素、 干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。众多细胞因子在体内通过旁分泌、 自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性，形成了十分复 杂的细胞因子调节网络，参与人体多种重要的生理功能。 根据产生细胞因子的细胞种类不同分类 细胞因子 1.淋巴因子（lymphokine) 于命名，主要由淋巴细胞产生，包括 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和 NK 细胞等。 重要的淋巴因子有 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN- 、TNF-、GM-CSF 和神经白细胞素等。 2.单核因子（monokine） 主要由单核细胞或巨噬细胞产生，如 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-、G-CSF 和 M-CSF 等。 3.非淋巴细胞、非单核-巨噬细胞产生的细胞因子 主要由骨髓和胸腺中的基质细胞、血管内皮细胞、成 纤维细胞等细胞产生，如 EPO、IL-7、IL-11、SCF、内皮细胞源性 IL-8 和 IFN- 等。 （二）根据细胞因子主要的功能不同分类 1.白细胞介素（interleukin, IL) 1979 年开始命名。由淋巴细胞、单核细胞或其它非单个核细胞产生 的细胞因子，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用，凡命名的白细胞介素 的 cDNA 基因克隆和表达均已成功，已报道有三十余种（IL-1IL-35） 。 2.集落刺激因子（colony stimulating factor, CSF) 根据不同细胞因子刺激造血干细胞或分化不同阶 段的造血细胞在半固体培养基中形成不同的细胞集落，分别命名为 G（粒细胞）-CSF、M（巨噬细胞）- CSF、GM（粒细胞、巨噬细胞）-CSF、Multi（多重）-CSF（IL-3） 、SCF、EPO 等。不同 CSF 不仅可刺激不 同发育阶段的造血干细胞和祖细胞增殖的分化，还可促进成熟细胞的功能。 3.干扰素（interferon, IFN) 1957 年发现的细胞因子，最初发现某一种病毒感染的细胞能产生一种物 质可干扰另一种病毒的感染和复制，因此而得名。根据干扰素产生的来源和结构不同，可分为 IFN- 、IFN- 和 IFN-，他们分别由白细胞、成纤维细胞和活化 T 细胞所产生。各种不同的 IFN 生物学活 性基本相同，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。 4.肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF) 最初发现这种物质能造成肿瘤组织坏死而得名。根据 其产生来源和结构不同，可分为 TNF- 和 TNF- 两类，前者由单核-巨噬细胞产生，后者由活化 T 细胞 产生，又名淋巴毒素（lymphotoxin, LT)。两类 TNF 基本的生物学活性相似，除具有杀伤肿瘤细胞外，还 有免疫调节、参与发热和炎症的发生。大剂量 TNF- 可引起恶液质，因而 TNF- 又称恶液质素 （cachectin)。 5.转化生长因子- 家族（transforming growth factor- family, TGF- family) 由多种细胞产生， 主要包括 TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF12 以及骨形成蛋白（BMP）等。 6.生长因子（growth factor,GF）如表皮生长因子（EGF） 、血小板衍生的生长因子（PDGF） 、成纤维细胞 生长因子（FGF） 、肝细胞生长因子（HGF） 、胰岛素样生长因子-I（IGF-1） 、IGF-、白血病抑制因子 （LIF） 、神经生长因子（NGF） 、抑瘤素 M（OSM） 、血小板衍生的内皮细胞生长因子（PDECGF） 、转化生长 因子-（TGF-） 、血管内皮细胞生长因子（VEGF）等。 7.趋化因子家族（chemokinefamily) 包括两个亚族：（1）C-X-C/ 亚族，主要趋化中性粒细胞，主要 的成员有 IL-8、黑素瘤细胞生长刺激活性(GRO/MGSA） 、血小板因子-4（PF-4） 、血小板碱性蛋白、蛋白水 解来源的产物 CTAP-和 -thromboglobulin、炎症蛋白 10（IP-10） 、ENA-78；（2）C-C/ 亚族，主要 趋化单核细胞，这个亚族的成员包括巨噬细胞炎症蛋白 1（MIP-1） 、MIP-1、RANTES、单核细胞趋 化蛋白-1（MCP-1/MCAF） 、MCP-2、MCP-3 和 I-309。 受体 概念 细胞因子是由多种细胞产生的，具有广泛调节细胞功能作用的多肽分子， 细胞因子不仅作用于免疫系统 和造血系统，还广泛作用于神经、内分泌系统，对细胞间相互作用、细胞的增殖分化和效应功能有重要的 调节作用。细胞因子发挥广泛多样的生物学功能是通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞 内部。因此，了解细胞因子受体的结构和功能对于深入研究细胞因子的生物学功能是必不可少的。随着对 细胞因子受体的深入研究，发现了细胞因子受体不同亚单位中有共享链现象，这对阐明众多细胞因子生物 学活性的相似性和差异性从受体水平上提供了依据。绝大多数细胞因子受体存在着可溶性形式，掌握可溶 性细胞因子受体产生的规律及其生理和病理意义，必将扩展人们对细胞因子网络作用的认识。检测细胞因 子及其受体的水平已成为基础和临床免疫学研究中的一个重要的方面。 分类 一、细胞因子受体的结构和分类 根据细胞因子受体 cDNA 序列以及受体胞膜外区氨基酸序列的同源性和结构征，可将细胞因子受体主要分 为四种类型：免疫球蛋白超家族（IGSF） 、造血细胞因子受体超家族、神经生长因子受体超家族和趋化因 子受体。此外，还有些细胞因子受体的结构尚未完全搞清，如 IL-10R、IL-12R 等；有的细胞因子受体结 构虽已搞清，但尚未归类，如 IL-2R 链（CD25） 。 （一）免疫球蛋白超家族 该家族成员胞膜外部分均具有一个或数个免疫球蛋白（Ig）样结构。已知，属于 IGSF 成员的细胞因子受 体的 IL-1RtI（CD121a） 、IL-1Rt（CD121b） 、IL-6R 链（CD126） 、gp130(CDw130)、G-CSFR、M- CSFR（CD115） 、SCFR（CD117）和 PDGFR，并可分为几种不同的结构类型，不同 IGSF 结构类型的受体其信 号转导途径也有差别。 （1）M-CSFR、SCFR 和 PDGFR：胞膜外区均含有 5 个 Ig 样结构域，其中靠近胞膜区为 1 个 V 样结构，其余 4 个为 C2 样结构。受体通常以二聚体形式与相应的同源二聚体配体结合。受体胞浆区本身含有蛋白酷氨 酸激酶（proteintyrosinekinase,PTK）结构。 （2）IL-1RtI 和 IL-1Rt：胞膜外区均含有 3 个 C2 样结构，受体胞浆区丝氨酸/苏氨酸磷酸化可能与受 体介导的信号转导有关。 （3）IL-6R 链、gp130 以及 G-CSFR：胞膜外区 N 端均含 1 个 C2 样区，在靠近胞膜侧各有 1 个红细胞生 成素受体超家族结构域，此外在胞有胞膜外区还含有 2-4 个纤粘连素结构域。gp130 胞浆区酷氨酸磷酸化 与信号转导有关。这种结构类型的受体其相应配体 IL-6、OSM、LIF 和 G-CSF 在氨基酸序列和分子结构上 也有很大的相似性。 （二）造血细胞因子受体超家族 造血细胞因子受体超家族（haemopoieticcytokinereceptorsuperfamily）又称细胞因子受体家族 （cytokinereceptorfamily） ，可分为红细胞生成素受人本超家族 （erythropoietinreceptorsuperfamily，ERS）和干扰素受体家族（interferonreceptorfamily） 。 1.ERSERS 所有成员胞膜外区与红细胞生成素（erythropoietin,EPO）受体胞膜外区体在氨基酸序列上有 较高的同源性，分子结构上也有较大的相似性，故得名。 （1）ERS 的成员：属于 ERS 的成员有 EPOR、血小板生成素 R、IL-2 链（CD122） 、IL-2R 链、IL-3R 链（CD123） 、IL-3R、IIL-4R（CDw124） 、IL-5R 链、IL-5 链、IL-5R 链、IL-6R 链（CD126） 、 gp130(CDw123)、IL-7R、IL-9R、IL-11R、IL-1240kDa 亚单位、G-CSFR、GM-CSFR 链、GM=CSFR 链、 LIFR、CNTFR 等，此外，某些激素如生长激素受体（GRGR）和促乳素受体（PRLR）亦属于 ERS。 （2）ERS 的结构特征：红细胞生成素受体超家族成员在胞膜外与配体结合部位有一个约含 210 氨基酸残 基的牲性同源区域，主要特点同源区靠近 N 端有 4 个高并能保守的半胱氨酸残基 Cysl、Cys2、Cys3、Cys4 和 1 个保守的钯氨酸，Cys1 与 Cys2 之间、Cys3 与 Cys4 之间形成两个二硫键。 同源区靠近细胞膜处，约在细胞膜外 1822 氨基酸基处有一个色氨酸一丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基序， 所谓 Trp-Ser-Xaa-Trp-Ser 即 WSXWS 基序，其生物学功能尚不明了。IL-3 链、IL-3R 链、GM-CSFR 链、LIFR 办有两个 ERS 结构域，其中 GM-CSFR 链第一个 ERS 结构中有一个类似 WSXWS 基序，即为脯氨 酸一丝氨酸-赖氨酸-色氨酸-丝氨酸（PSKWS）基序。1994 年 Hilton 等合成 WSXWS 基序相应的寡核苷酸为 探针，从成鼠肝 cDNA 文库中克隆小鼠 IL-11 受体 链 cDNA 获得成功。IL-6R 链和 gp130 以及 G-CSFrN 端有一个 IGSF 结构。IL-7R 靠近 N 端侧的部位只有 Cys1 和 Cys3，与其它成员相比，缺乏 Cys2 和 Cys4 以 及色氨酸残基。IL-1240kDa 亚单位有 ERS 的同源结构，但为非膜结合的，而且与 IL-12 另一 35kDa 亚单 位通过二硫键开成异源双体。GM-CSFrN 端在 ERS 中可以看作由 2 个型纤维粘连素组成，每个型纤维 粘连素结构域由 7 股反平行 折叠股形成一个桶状结构，两个桶状结构之间的槽是配体膜外保守区域有 明显的进化同源性，这种同源性的程度与 IGSF 成员间相似。EPoR 似科与其它家族成员有更高的同源性， 在进化上可能处于主导的地位。ERS 的胞浆区长度不一，从 54 个氨基酸残基到 568 个氨基酸残基，除 IL- 2R 链与 EPOR 之间胞浆区有一定同源性外，其它成员在胞浆区未见明显的同源性。ERS 成员胞浆区本身 均不具备 PTK 结构，其信号传递的途径和机理也有所不同。IL-2R 链胞浆区的本双重性区与胞浆中酪氨 酸激酶相关联，富含丝氨酸区与非激酶信赖途径有关。IL-2R 链胞浆区具有 SH2 结构，参与信号传递。 细胞浆中的 PTK 和 PKC 可能参与 IL-4R 介导的信号传递。gp130 胞浆区丝氨酸富含区以及酷氨酸磷酸化与 gp130 介导的信号转导有关。此外，酪氨酸磷酸化与 IL-7R、GM-CSFR 链、IL-3R 链、IL-5R 链介导 的信号转导有关。 2.干扰素受体家族属于这一家族的成员有 IFN-/R、IFN-R 和组织因子（TF） （为凝固白酶因子的 细胞膜受体） ，其结构与红细胞生成素受体家族相似，但 N 端只含有两个保守性的 Cys，两个 Cys 之间有 7 个氨基酸。近膜处也有两个保守的 Cys，两个 Cys 之间间隔有 20-22 个氨基酸。IFN-/R 由两个上述 的结构域所组成。 （三）神经生长因子受体超家族 1.NGFR 超家族的成员属于该家族成员除神经生长因子受体（nervegrowthfactorreceptorNGFR）外，不有 TNF-R（CD120a） 、TNF-R（CD120b） 、CD40、CD27、T 细胞 cDNA-41BB 编码产物、大鼠 T 细胞抗原 OX40 和人髓样细胞表面活化抗原 Fas（CD95） 。 2.NGFR 超家族的结构特点 NGFR 超家族成员其胞膜外由 3-6 个约 40 个氨基酸组成的富含 Cys 区域，如 NGFR、TNF-R、TNF-R有 4 个结构域，CD95 有 3 个结构域，CD30 有 6 个结构域。所有成员 N 端第一个 区域中均含 6 个保守的 Cys 以及 Tyr、Gly、Thr 残基各一个，其它区域亦含 4-6 个 Cys。TNF- R、CD95、CD40 分子之间胞浆区约有 40-50%同源性。 （四）趋化因子受体 1988 年 IL-8 基因克隆成功以来，已形成了称之为趋化因子（chemokine）的一个家族。到目前为止，趋 化因子家族的成员至少有 19 个。部分趋化因子的受体已基本搞清，它们都性属于 G 蛋白偶联受体（GTP- bindingproteincoupledreceptor）,由于此类受体有 7 个穿膜区，又称 7 个穿膜区受体超家族 （sevenpredicatedtransmembranedomainreceptorsuperfamily,STRsuperfamily） 。G 蛋白偶联受体（或 STR）包括的范围很广，除了趋化因子受体外，如某些氨基酸、乙酰胆碱、单胺受体，经典的趋化剂 （C5a、fMLP、PAF）受体等都属于 G 蛋白偶联受体/STR。 1.趋化因子受体的种类和结构 （1）趋化因子受体的种类：已发现的趋化因子受体种类有 IL-8RA、IL-8RB、MIP-1/RANTEsR、NCP-1R 和细胞趋化因子受体（redbloodcellchemokinereceptorRBCCKR） 。有人将能与 IL-8 结合的 IL-8RA、IL- 8RB 和 RBCCKR（Duffy 抗原）归为 IL-8 受体家族。 （2）趋化因子受体的结构：所有趋化因子受体都属于 G 蛋白偶联受体/STR，N 端在胞膜外，C 端位于胞浆 内。7 个穿膜区（transmembranedomain，TMD）为 螺旋，在 TMD、和由 螺旋内保守 的肺腑氨酸所扭结（kinked）,胞膜外和胞浆内各有由亲水氨基酸所组成的三个一不，分别简称为 e1- e3(e:extracellularconnectingloops)和 il-i3（iintracellularconnectingloops） 。e1 和 e2 之间由两 个保守的 Cys 形成一个二硫键，有些受体在胞外 N 端和 e3 之间也形成二硫键，如 IL-8Ra30Cys 与 277ys 形成二硫键。在 STR 超家族中，趋化因子受体以及经典的趋化剂受体具有以下特点：（1）其长度在 STR 超家族中最短，约为 350 氨基酸，其主要原因是 N 端、C 端较短，i3 环只含 16-22 个氨基酸；（2）在氨 基酸水平上同源性大于 20%；（3）i3 富含碱性氨基酸，带正电；（4）N 端仿酸，带负是电；（5）胞浆 区含有多个丝氨酸和苏氨酸，可能是磷酸化位点；（6）mRNAs 多表达于白细胞。 2. IL-8 受体家族 IL-8R 家族是趋化因子受体中能与 IL-8 结合的不同受体的总称，包括 IL-8RA、IL-8RB 和 RBCCKR。 （1）IL-8RA：IL-8RAcDNA1991 年基因克隆成功，是 Holmes 等从中性粒细胞 cDNA 表达文库中分离得到， 人 IL-8RA 基因定位于染色体 2q35，与 IL-8RB 基因密切连锁和高度同源，可能是从同一祖先基因经复制 而来。从 cDNA 推算出 IL-8RA 由 350 氨基酸组成，有 5 个 N 连接的糖基化位点。裸肽分子量为 40kDa，糖 基化后 5569kDa，在氨基酸水平上与 IL-8RB 的同源性为 77%。IL-8RA 只与配体 IL-8（碱性，PI8.0- 8.5）结合，这与 IL-8RA 的结构有关，IL-8RaN 端酸性氨基酸是与 IL-8 结合的位置，N 端 Asp11 和 e3 中 Gly275 和 Arg280 对于与配体结合至关重要，由于 Cys30 与 Cys277 之间形成二硫键，Asp11、Glu275 和 Arg280 在空间置上十分接近，共同参与同配体的结合。IL-8RA 基因表达的细胞种类较为广泛，如中性粒 细胞、单核细胞、PGA 活化的 T 细胞、单核细胞样细胞系、黑素瘤细胞、滑液成纤维细胞、HL60 细胞和前 髓样细胞系 THP-1 等。 （2）IL-8RB：IL-8RBcDNA 是首先从 HL60 细胞中克隆成功，推断的氨基酸残基数为 335，有一个潜在的 N 连接糖基化位点。IL-8RB 可与 CXC 亚族中 IL-8、GRO、GRO、GRO 和 NAP-2 结合。人 IL-8RB 主要表 达于髓样细胞，如中性粒细胞、HL60、THP-1 和 AML193 细胞。 （3）RBCCKR：这种受体结合配体的特异性较宽，又称 multi-specificreceptor,可结合 CXC 亚族中的 IL- 8、NAP-2、GRO 和 CC 亚族中的 MCP-1 和 RANTES。人 RBCCKRcDNA1993 年克隆成功，基因定位于 1q21- q25，成熟受体分子由 338 个氨基酸组成，分子量为 39kDa，与 IL-8RB 和 MIP-1/RANTESR 分别有 27%和 23%同源性。胞膜外区为 66 个氨基酸，含有 2 个潜在的 N 连接糖基化点，酸性。C 端胞浆区长 24 个氨基 酸残基，RBC-CKR 似乎不 G 蛋白调节，可能是一种 G 蛋白的非偶联受体。RBCCKR 是人红细胞 Duffy 抗原 （gpD） ，也是微小间日疟原虫（Plasmodiumvivax）受体。Duffy 血型阴性个体尽管存在着该血型的原因， 但不表达 Duffy 抗原/RBCCKR。RBCCKR 作为一种清除受体（clearancereceptor)清除血液中趋化因子。这 种受体与配体结合的亲和力 Kd 为 5nM，正常血清中 IL-8 水平在 pM 水平。在成人呼吸窘迫综合征（ARDS） 、 脓毒症时，血清 IL-8 水平可升高至 8nM，过高水平的 IL-8 结合到 RBCCKR 而得以清除。IL-8 等趋化因子 结合到红细胞上后即失去了对靶细胞作用。红细胞的这种清除作用的意义还在于维持一个合适的趋化因子 浓度，保证中性粒细胞等敏感地从血液中向趋化因子浓度高的炎症部位动。RBCCKR 除表达在红细胞上外， 还表达在肾脏、大脑，基因表在这还见于脾、肺和胸腺等。 3.受体的信号转导 IL-8RA 和 IL-8RB 中紧接第三个穿膜区（TMD）的第二个胞内环（i2）有一段高度保 守的 DRYLAIVHA 序列，与受体信号的转导密切相关，其中 DRY 对于受体有效地偶联 G 蛋白是必要的，如用 突变方法改变此序列，虽然不影响受体与配体的结合，但几乎完全丧失了配体刺激的生物学活性。IL-8R 与配体结合后使与受体结合的异源三体 G 蛋白分解为 亚单位和 亚单位， 亚单位活化磷脂酶 C（phospholipaseCPLC） ，导致胞浆内三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）增加，分别诱导胞浆内 Ca 库释放 Ca2 和 PKC 的活化。此外，IL-8RA 和 IL-8RBC 端丝氨酸和苏氨酸残基的磷酸化可能与信号的转导 有关。 4.趋化因子受体与病毒发现某些感染人或灵长类病毒的开放读框产物与某些趋化因子受体有较高的同源性， 这可能与病毒的致病以及病毒所具有的某些生物学特性有关。 （1）人巨细胞病毒（humancytomegalovirusHCMV）:是一种可感染人上皮细胞、髓样和淋巴样细胞的 疱疹病毒（Herpesvirus)。HCMV3 个开放读框 US27、US28 和 UL33 所推断的氨基酸序列在分子结构上均 可模拟 STR，其中 US28 产物与人 MIP-1/RANTEsR 约有 30%同源性，与该受体 N 端的同源性高达 56%。US28 产物可与趋化因子 亚族中 MIP-1、MIP-1、MCP-1 和 RANTES 相结合，但不能结合 亚 族中的趋化因子。 （2）Saimiri 疱疹病毒（HerpesvirussaimiriHVS）:是一种感染灵长类动物嗜 T 细胞的 疱疹病毒 （Herpesvirus)。HVS 开放读框 ECRF3 产物与 IL-8R 有近 30%的同源性，与 IL-8RbN 端的同源性为 44%。ECRF3 产物与 IL-8、GRO 和 NAP-2 均可发生一定程度的结合。 HCMV-US28 和 HVS-ECRF3 探针不能与人基因组 DNA 杂交，提示疱疹病毒不仅从宿主体内获得了趋化因子受 体基因拷贝，而且进行了修饰。类似的现象见于嗜人 B 淋巴细胞的 疱疹病毒-EB 病毒(EBV)，EBV 开放 读框 BCRF1 是从宿主体内获得的 IL-10 基因，BCRF1 产物又称为病毒 IL-10(vIL-10)，可模拟哺乳动物 IL-10 的抗炎症和抗增殖效应。 共享链 二、细胞因子受体中的共享链 大多数细胞因子受体是由两个或两个以上的亚单位组成的异源二聚体或多聚体，通常包括一个特异性配体 结合 链和一个参与信号的 链。 链构成低亲和力受体， 链一般单独不能与细胞因子结合，但参 与高亲和力受体的形成和信号转导。应用配体竞争结合试验、功能相似性分析以及分子克隆技术发现在细 胞因子受体中存在着不同细胞因子受体共享同一种链的现象。 （一）细胞因子受体共享链的种类 在众多的细胞因子中，某些细胞因子的作用十分相似，如 IL-3、IL-5、GM-CSF 都作用于造血系统，促进 造血干细胞或定向干细胞的增殖。IL-6、IL-11、LIF、OSM 都能作用于肝细胞、巨核细胞、浆细胞瘤，发 挥相似的生物学作用。IL-2、IL-4、IL-7、IL-9 和 IL-13 均具有刺激 T 细胞或和 B 细胞增殖的作用。上 述细胞因子功能的相似性已部分在受体水平得到解释，在很大程度上是由细胞因子受体共享链所决定的。 已知，细胞因子共享链主要有 gp310、GM-CSFR 链和 IL-2R 链。 1、gp130/LIFR 为 IL-6R、单抗 MT18 在骨髓瘤细胞系 U266 共沉淀中得到一种 130kDa 的糖蛋白，命名为 gp130。1990 年 Hibi 克隆成功，gp130，属于造血因子受体家族。IL-6、IL-11 均能刺激 IL-6 信赖的小鼠 浆细胞瘤系 T1165 的增殖，能在 IL-3、GM-CSF 的作用下缩短骨髓多能干细胞的 Go 期，增强 IL-3 依赖的 人和小鼠的巨核细胞集落的形成，促进体内、体外的特异性抗体反应，诱导肝细胞急性期蛋白的产生。抗 gp130 能阴断 IL-6、IL-11 两种细胞因子分别诱导的 TF1 细胞的增殖，而抗 IL-5R 只能阴断 IL-6 诱导的 TF1 的增殖，表明 IL-6、IL-11 受体共用一个信号转导链。OSM 受体存在着低亲和力及高亲和力两种受体， 低亲和力受体即 gp130，gp130 与 LIFR 构成高亲和力受体。与在 IL-6R、IL-11R 中不同，gp130 在 OSMR 中只形成低亲和力受体且不能单独转导细胞因子信号。高亲和力的 LIF 受体由 LIFR 和 gp130 组成，OSM 与 LIF 能竞争结合高亲和力 LIF 受体，但不竞争结合低亲和力的 LIF 受体。 （4）IL-11R 链（小鼠）与 IL-6R 链和 CNTFR 链氨基酸同源性分别为 24%和 22%。 2、KH97/AIC2B 为 IL-3R、IL-5R、GM-CSFR 所共用。在造血方面，IL-3 与 GM-CSF 均能促进未成熟细胞、 混合细胞及粒细胞-巨噬细胞集落的形成，激活单核细胞，促进嗜酸性粒细胞集落形成。IL-5 除了促进 B 细胞分化和分泌抗体外，也具有刺激嗜酸性粒细胞分化作用。用 GM-CSFR 链分别与 IL-3、IL-5、GM- CSFR 链共转染的试验证明，这三种细胞因子高亲和力受体中的 链在小鼠和人分别为 AIC2B 和 KH97， 它们有 56%的同源性。 3、IL-2 受体 链除 IL-2R 含有 链外，IL-4R、IL-7R、IL-9R 和 IL-13R 复合物中也共用 IL-2R 链 （c） 。这些受体的相应配体是一组主要作用于 T 细胞的生长因子。以 IL-2 链异常为主要特征的 X 联 锁严重免疫缺陷综合症患者显示出 T 细胞发育异常，T 细胞的缺乏或数量明显减少，提示 IL-2 链在 T 细胞的发育中起至关重要的作用。IL-4、IL-7 均在 T 细胞的发育中起作用，它们共用一条信号转导链 IL- 2R 链来传递 T 细胞增殖的信号。在 IL-2 受体系统中， 链构成低亲和力受体，中亲和力受体由 、 链组成，高亲和力受体由 、 三条链组成，其中， 链相当于其它细胞因子受体的 链， 参参与信号传递，而 链则相当于 链，主要发挥识别和结合配体的作用。 （二）共享链与细胞因子受体信号转导 细胞因子信号转导首先需要配体与受体结合并诱导受体二聚体（或三聚体）的形成，使二聚体（或三聚体） 胞浆部分的相互作用，由此引起不同途径的信号转导。在 IL-2R 系统中，受 、 链的二聚作用对于信 号的转导是必须的，缺乏 链胞浆区的 IL-2R 不能转导 IL-2 刺激所发生的信号。大多数的细胞因子对细 胞的刺激及信号转导与酪氨酸激酶的活化及细胞内蛋白的酪氨酸磷酸化有关，细胞因子与受体结合可以引 起受体成分的酪氨酸磷酸化。ERS 胞浆区近膜端的 60 个氨基酸残基是高度保守的，这段同源序列对 IL- 6、G-CSF、EPO、IL-7 的信号转导起着关键作用，提示这些受体可能利用相似的胞膜内信号转导机制。 1、gp130 介导信号转导在 IL-6R、IL-11R、OSMR、LIFR、CNTFR 的信号转导共用链 gp130 中，其胞浆区约 277 个氨基酸残基中包含丝氨酸富含区、核苷酸结合区及 4 个 GTP 结合模式区。其中的丝氨酸富含区也存 在于 G-CSFR、IL-2R、IL-4R 和 EPOR，其它的 ERS 成员有着明显的同源性。其中一个片段在所有 ERS 成 员中都是保守的，另一个片段存在于 G-CSFR、EPOR、KH97 中。这两个短的片段中，无论哪个发生突变都 将使 gp130 不能发生酪氨酸磷酸化，丧失信号转导的能。LIFR/gp130 异源双体也与酪氨酸磷 gp130 不能 发生要酪氨酸磷酸化，丧失信号转导的功能。LIFR/gp130 异源双体也与酪氨酸磷酸化有关。虽然大多数 造血因子受体家族成员均不具有酪氨酸激酶结构域，但它们与酪氨酸激酶型生长因子受体相似，生长因子 引起与之相关的受体酪氨酸激酶二聚体的形成和激活，而造血因子可能是诱导其受体的二聚体形成并导致 相关酪氨酸激酶的活化。发现在 IL-6、IL-11 刺激的 TF1 细胞中检测出分子量 97/95kDa 的蛋白发生了酪 氨酸磷酸化，抗 gp130 的信号转导中很重要。在不同的细胞系 3T3-L1、B 细胞杂交瘤、髓样白血病系中发 现有不同分子量蛋白的要酪氨酸磷酸化，提示在不同的细胞系中存在细胞特异的酪氨酸激酶及各自特异的 底物，这可能是共用 gp130 的 IL-6、IL-11、LIF、CNTF、OSM 在不同细胞中生物学作用差异的原因一。 JAK2 是一种非受体型的酪氨酸激酶，可以被 EPO、IL-3、G-CSF、IL-6 等多种细胞因子刺激所激活，JAK2 可能是这些不同的细胞因子受体信号转导途径中的一个共同因素，这种与受体相联的 JAK2 激酶可能因受 体结构的不同而催化不同的底物，从而导致了 JAK2 介导了许多不同的生和的学功能。此外，gp130 在 IL- 6、IL-11、CNTF、LIF 的刺激后也发生了自身的酪氨酸磷酸抡。 2、KH97/AIC2B 介导信号传导在 IL-3、IL-5、GM-CSF 的信号转导链 KH97/AIC2B 的胞浆区内也存在着两个 产生不同信号所必需的区域：一个是 Glu517 上游近膜端的约 60 个氨基酸的区域，它是诱导 c-myc 和 pim-1 所必需的；另一个区域是 Leu623 至 Ser763 约 140 个氨基酸的胞浆区域，是 Ras、Raf、MAP（丝裂 原激活的蛋白激酶）的激活以 c-fos、c-jun 的诱导所必需的。hGM-CSFR、 链无任何已知酶的催化区， 共转染 hGM-CSF、 链的 Ba/F3 细胞的地冽同 C-Myc、pim-1 水平的延长增加相关联的。在小鼠淋巴细 胞系转染 GM-CSF、 链后可以引韦胞内数种蛋白的酪氨酸磷酸化并引起增殖反应，、 链共转染小 鼠 NIH3T3 细胞表达 GM-CSFR 高亲和力受体，可引起表达的 链胞浆区和另外一个有包浆内 40-45kDa 蛋 白的酪氨酸快速磷酸化。 可溶性 三、可溶性细胞因子受体 在自然关态下，细胞因子受体（cytokinereceptorCK-R）主要以膜结合细胞因子受体（membrane- boundcytokinereceptormCK-R）和存在于血清等体液中可溶性细胞因子受体 （solublecytokinereceptorsCK-R）两种形式存在。细胞因子复杂的生物学活性主要是通过基与相应的 mCK-R 结合后所介导的，而 sCK-R 却具有独特的生物学意义。sCK-R 水平变化与某些疾病的关系日益受到 学者们的重视。部分重组 sCK-R（rsCK-R）基因工程产品已进入临床验证，关于 sCK-R 的产生机理，结构 特点及基免疫学功能等方面的基础研究也取得了长足的进展。 （一）sCK-R 的产生机理及作用特点 人 T 细胞白血病病毒 I 型（HTLV-I）感染的 HUT102B2、MT-2 等细胞，髓样白血病细胞（HL-60，KG1）及 某些人 B 细胞系（Raji）除了表达多种 mCK-R 外还可以通过不同方式产生 sCK-R，如 HUT102B2 细胞培养 丰清中也可检出高水平 sCK-2R 和 sIL-6R。人 PMC 体外经 PHA 刺激培养后也产生大量 sCK-2R 和 sCK-6R。 1.sCK-R 的产生大多 sCK-R 主要来自膜受体的脱落，因此将膜受体阳笥细胞溶解是获得大量 sCK-R 的一种 方法。大多数 sCK-R 氨基酸序列与 mCK-R 胞膜外区同源，只缺少跨膜区及胞浆区，但仍可与相应配体发生 特异性结合所应。除了膜受体的裂解、脱落产生 sCK-R 形式外，另一种产生 sCK-R 的机理是通过受体 mRNA 不同剪接，产生分泌型 mRNA，通过翻译后直接分泌到细胞外，已经证实，细胞内可含有同一种 CK-R 不同形式的 cDNA。sIL-4R、sIL-5R 链、sIL-6R 链、sIL-7R 以及 sG-CSFR 等可以这种形式产生。 2.sCK-R 的生物学作用多数 sCK-R 与相应细胞因子结合的亲和力较与 mCK-R 为低，可能与 sCK-R 为单链结 构或缺少某些结构区域有关。也有的 sCK-R 如 sIL-4R 同天然 mIL-4R 与相应配体结合的亲和力是相同的， 即使低剂量 sIL-4R 也可特异地抑制 IL-4 诱导的细胞增殖反应。sCK-R 以其多种方式发挥其独特的免疫学 功能。 （1）做为细胞因子转运蛋白，将细胞因子运至机体有关产啊位，造成局部细胞因子高浓度区以充分发挥 细胞因子的生物学效应。 （2）是膜受体正常代谢途径，有利于处于活化状态细胞恢复至正常水平。 （3）竞争性地结合 mCK-R 相应配体，抑制 mCK-R 所介导的生物学作用。 （二）sCK-R 与临床 1.检测 sCK-R 水平在临床中的应用检测某些 sCK-R 水平辅助临床对某些疾病的早期诊断，了解病程的发展 与转归，并可对患者免疫功能状态及预后进行评估，对临床治疗也有一定指导意义。 （1）sIL-2R 的检测：来国内外学者对 sIL-2R 进行了大量研究，发现其在血清及其他体不认中水平的变 化与临床多种疾病如器官移植排异反应、病毒性感染、恶性肿瘤、创伤及自身免疫性疾病等的病情、病程 密切相关。 （2）其他 sCK-R 的检测：在尿中发现一种 50kDasIL-6R 分子称为 IL-6R-SUP，可以促进小剂量 IL-6 诱导 的小鼠浆细胞瘤 T1165 的生长。多发性骨髓瘤病人血浆中 sIL-6R 水平明显升高。风湿性疾病患者血清 sTNFR 水平异常增设，关工了腔滑液中亦可检出高水平 sTNF-R，且活动期水平明显高于非活动期。政党妇 女尿中仅可检测到 TNF-R类型的 sTNFR，而妊娠妇女尿中 TNF-rI 和 TNF-R两种类型 sTNFR 均可被检出， 随胎龄增加 sTNFR 水平逐渐升高，分娩后随之降低，这可能是使胎儿免受 TNF 作用的一种防护机制。肝脏 感染性腹水及癌性腹水中亦可检出高水平 sTNFR。此外还发现，sTNFR 水平的增设与患者肾功能的减退密 切相关。 2.sCK-R 在临床应用前景大多数 sCK-R 与细胞因子结合后阴断细胞因子与膜受体结合，从而抑制细胞因子 的生物学活性，应用 sCK-R 减轻或防止炎症性细胞因子造成的病理损害提供了新的治疗途径。动物实验结 果表明，局部注射 sIL-1R 可抑制 IL-1 介导的炎症反应。sIL-1R 可降低小鼠同种异体心脏移植的排异反 应以及大鼠实验性关节炎和过敏性大脑炎。在体外 sIL-1R 可明显抑制急性髓样白血病病人骨髓细胞的增 殖。应用 IL-1R 基因工程产品开始对治疗关节炎、糖尿病以及防治器官移植排斥等进入临床验证。动物体 内注射 sIL-4R 可延长同种异人本移植物的存活，抑制 GVHR，降低 I 型超敏反应。应用 sTNFR 可减轻 TNF 在自身免疫性疾病中所介导的病理损害，并可减轻败血症休克。 5 原理 为了维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭，防止肿瘤发生，机体的许多细胞，特别是免疫细胞合 成和分泌许多种微量的多肽类因子。它们在细胞之间传递信息，调节细胞的生理过程，提高机体的免疫力， 在异常情况下也有可能引起发烧、炎症、休克等病理过程。这样一大类因子已发现的有上百种，统称为细 胞因子，包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核细胞产生的单核因子、各种生长因子等。许多细胞因子是根 据它们的功能命名的，如白细胞介素（IL） 、干扰素（IFN） 、集落刺激因子（CSF） 、肿瘤坏死因子(TNF)、 红细胞生成素（EPO）等。 6 作用 细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。细胞因子与其受体集合后启动复杂的 细胞内分子间的相互作用，最终引起细胞基因转录的变化。 参与免疫应答与免疫调节，调节固有免疫和适应性免疫应答；刺激造血功能；刺激细胞活化、增殖和分化； 诱