毕业设计（论文）-环境浓度微囊藻毒素-LR对水稻生态毒性效应研究.doc

提供全套毕业论文图纸，欢迎咨询 本科毕业论文 题 目：环境浓度微囊藻毒素-lr对水稻生态 毒性效应研究学 院：化学工程学院 专 业：环境工程 班 级: 1002051 学 号：100205119 学生姓名： 指导教师： 职称: 讲师 职称：副研究员二零一四年 五月 二十日环境浓度微囊藻毒素-lr对水稻生态毒性效应研究摘 要 近年来，我国蓝藻水华暴发分布日趋广泛且严重，大量微囊藻毒素随着农业灌溉用水进入农田，目前对该过程中高等植物对蓝藻毒素的吸收及由此引发的多种毒性效应的机制尚未明确。本实验以水稻为研究对象，采用现代分析技术和分子生态毒理学方法，考察了微囊藻毒素对受试作物的毒性差异，研究了不同浓度微囊藻毒素对水稻生长发育的影响，检测指标包括:1)植株营养学指标如株高、鲜重、根长；2)生理生化指标如过氧化物酶活性、谷胱甘肽含量、丙二醛含量；3)光合作用指标如净光合作用、叶绿素荧光、蒸腾速率等。主要研究结果表现为：微囊藻毒素浓度对株高、鲜重、跟长等在mc-lr浓度为0.1 ug/l的时候有促进作用，紧接着1ug/l的浓度下就有了明显的抑制作用，浓度为50 ug/l的抑制作用极显著；而微囊藻毒素对植株鲜重、丙二醛含量、叶绿素荧光和蒸腾速率则表现为抑制作用，且浓度越高，抑制作用越明显。该研究对阐明环境浓度微囊藻毒素-lr对陆生高等植物的生态毒性效应特点具有重要意义。关键词：微囊藻毒素；毒性机制；水稻；生理生态 environment concentration microcystin - lr ecological toxicity effect of rice researchabstract in recent years, the distribution of algal bloom increasingly widespread and severe. it cause a large number of blue-green algae toxins entering the crop field along with the agricultural irrigation water. so far people know few about how higher plants absorb these toxins and the resulting toxicity mechanisms. with rice as the research object, we use modern analytic techniques and molecular ecotoxicology method to examine the toxicity of microcystin on a crop of difference and study the different concentration of algal toxins on rice growth and development. detection plant nutrition indicators, including 1) plant nutrition indicators such as amylase, plant height, fresh weight, root length, 2) physiological and biochemical indicators such as alkaline phosphatase activity, glutathione, malondialdehyde content, 3) photosynthesis indicators such as net photosynthesis, chlorophyll fluorescence, transpiration rate. the results shows that microcystin concentration on plant height, fresh weight, with long in mc - lr concentration is 0.1 ug/l has a promoting effect, followed by 1 ug/l concentrations had obvious inhibitory effect, the concentration of 50 ug/l inhibition significantly. and microcystin algae toxins to plant fresh weight, malondialdehyde content, transpiration rate and chlorophyll fluorescence is characterized by inhibition, and the higher the concentration, the more obvious inhibitory effect. this study will be of great significance to clarify the environment concentration microcystin ecological toxic effects on the terrestrial higher plant characteristics.keywords: microcystin ; toxicity mechanism; rice; physiological ecology 目录1绪论11.1 课题研究背景11.1.1水环境富营养化污染现状11.1.2微囊藻毒素的产生及理化性质21.1.3水稻的生物学特征41.2国内外相关研究41.3课题的提出51.3.1研究的目的和意义51.3.2 研究的特色及创新点52材料与方法72.1实验材料72.2微囊藻毒素与营养液配制72.3水稻的处理过程82.3.1水稻种子的培养82.3.2对水稻进行染毒92.3.3水稻生物量收集102.4水稻叶子预处理102.4.1提取水稻叶片粗酶液102.4.2蛋白质含量的测定102.5植株营养学指标的测定102.6生理生化指标的测定112.7光合作用指标的测定112.8 水稻rna浓度和完整性测试122.8.1rna的提取122.8.2测总rna完整性和浓度132.9 数据分析143结果与分析153.1植株营养学指标153.1.1株高153.1.2根长163.1.3植物鲜重173.2微囊藻对水稻根生理生化影响183.2.1过氧化物酶活性183.2.2谷胱甘肽含量193.2.3丙二醛含量203.3微囊藻毒素对光合作用的影响213.3.1净光合速率213.3.2叶绿素荧光223.3.3蒸腾速率233.4不同浓度微囊藻毒素-lr暴露下水稻对毒素的吸收和累积24结论26致 谢28参考文献29南京林业大学本科生毕业论文311绪论1.1 课题研究背景1.1.1水环境富营养化污染现状我国目前以及今后相当长一段时期内的重大水环境问题其中之一就是湖泊等水体的富营养化，蓝藻水华的暴发则是水体富营养化引起的生物污染现象，是使湖泊生态系统受损的主要原因之一。近年来，我国已成为世界上蓝藻水华分布最广泛、暴发最严重且水华蓝藻种类最多的国家之一。如太湖、滇池和巢湖均有高频率、大面积的蓝藻水华发生，某些地区的水华蓝藻浓度已超过1010个细胞/l。蓝藻的大量生长会显著改变水体的理化环境，使得水体溶解氧减少，透明度降低并且散发腥臭味。此外，蓝藻水华还会造成水体的“二次污染”，除众所周知的藻毒素外，蓝藻在生长和衰亡过程中会还会产生一些其它环境污染物，如甲硫醇、甲硫醚等异味物质和氨氮、亚硝酸盐等，严重影响饮用水及水产品的品质，造成严重的经济损失，危及供水安全和人类健康1,2。我国是一个人口大国，人口大约占全世界人口的21.5%，而水资源却极度短缺，大约只有世界水资源的8%，所以水华现象在我国显得尤为严重。不容置否，水体富营养化的问题在我国已经成为水环境问题的重大问题之一，影响我国的经济乃至社会的发展。改革开放以来，我国的经济发展迅速，在经济发展的同时，我们往往忽略了自然环境的保护，这也导致我国水华时间频发，水体环境日渐恶劣，威胁到了我国国民的生活安全。太湖，滇池，巢湖并称为我国的三大湖，这三大湖泊的水华现象更是时常爆发3。江苏省无锡市的主要自来水厂停产就是由于蓝藻水华的爆发而导致的，这严重影响了居民的生活，水华爆发期间，一切当地自来水厂的供水停止，居民用水甚至需要从临近的城镇调用，造成了极大的危害,对此，近年我国对水体水华以及蓝藻的爆发投入了大量的人力物力进行研究，希望能够知悉它的发生机理，但是，却鲜有进展。水华的现象仍在不断出现，大规模爆发后，堆积的藻类细胞衰亡后释放出了大量的有毒异味物质，由此引发的衍生物污染已经威胁到了整个生态系统。这些衍生污染物的产生，主要有毒污染物，比如微囊藻毒素的毒理机制及其如何影响水体生态系统导致生态灾害，都是我国迫不及待需要解决的问题。因此，系统研究微囊藻毒素对粮食作物的毒性，能为寻找农业生产上采用合理的应对措施提供理论支持，保证农产品安全，避免危及人畜健康，现实意义十分重大。近年来，富营养化地区经常将含蓝藻水华的水用于灌溉，因此蓝藻毒素对粮食作物的危害性及因此引起的健康风险开始引起相关研究学者的兴趣，但从已有的研究报道了解到，不同作物对微囊藻毒素的耐受度和响应情况并不一致，到目前为止，还没有研究报道对此给出明确地解释，但研究显示，经过较低浓度的微囊藻毒素的处理后，受试标本水稻的发芽率并没有显著的差别，而当毒素达到100 ug/l时，水稻的生长发育受到了明显抑制，更高浓度的微囊藻毒素导致大部分的水稻幼苗坏死。所以，微囊藻毒素同样可以通过植物对人类的健康产生危害，在这样的背景下，本试验以主要粮食作物水稻为研究对象，系统、深入研究微囊藻毒素对受试作物的生态毒性效应。1.1.2微囊藻毒素的产生及理化性质根据调查得知，大多数的蓝藻种群都能产生一种甚至多种藻毒素，因此如果只是根据生物类群来判断蓝藻毒素种类是比较困难的。产生毒素的蓝藻种类主要包括微囊藻（microcystis）、鱼腥藻（anabaena）、拟柱胞藻（cylindrospermopsis） 、浮丝藻（plankthotrix）、鞘丝藻（lyngbya）、束丝藻（aphanizomenon）、颤藻（oscillatoria）和节球藻（nodularia），产生包括微囊藻毒素（microcystins，mcs）、鱼腥藻毒素（anatoxins）、拟柱胞藻毒素（cylindrospermopsin）、节球藻毒素（nodularins）、石房蛤毒素（saxitoxins）、拟类毒素-a(s)（anatoxin-a(s)）、和脂多糖内毒素（lipopolysaccharide）在内的众多毒素，不同种类的藻毒素在毒性结构和致毒机理上也有所差异4,5。微囊藻毒素是最为常见的一种蓝藻毒素，这是一类环状七肽物质，一般结构为：环(d-丙氨酸-l-x-赤-d-甲基天冬氨酸-l-z-adda-d-异谷氨酸-n-甲基脱氢丙氨酸)，其中adda残基（3-氨基-9-甲氨基-2,6,8-三甲基-10-苯基-6-二烯酸）是特殊的20个碳原子的氨基酸，x、z为两种在2、4位上可变的l-氨基酸，迄今为止，已发现有七十多种不同的mcs异构体，其中mc-lr、rr和yr是存在毒性较大、含量较高、最为普遍的三种mcs异构体，l，r和y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸，mc-lr结构见图1。mcs的结构决定了其性质较为稳定，耐热且耐ph值变化、不挥发、不易沉淀或被吸附于沉淀物和悬浮颗粒物中，易溶于水、丙酮和甲醇，此外由于mcs分子结构含有羧基、氨基和酰氨基，所以在不同ph值下，mcs会有不同的离子化倾向6。mcs主要由微囊藻产生，但并非所有的微囊藻都能产生mcs，现在mcs分子的产生机理已确定，是由一类包含聚酮合成酶（polyketide synthases，pkss）、肽类合成酶（peptide synthetase）和其它修饰酶在内的巨酶复合体通过非核糖体（nonribosome）途径合成的7。非核糖体肽类合成酶在结构上是高度保守的，通过一个硫模板（thio-template）机制催化肽的合成，与直链、环肽和分支环肽的合成有关。编码mcs合成酶的基因簇已经得到测序鉴定，这是一个55kb的基因簇，由一混合型非核糖体肽类合成酶（聚酮合成酶性质，mcya-mcye和mcyg）的6个开放式阅读框（orfs）和4个小型的被认为具有前体和裁剪功能（mcyf和mcyh-mcyj）的oprs组成。mcs的产生也能收到多种内在及外在因素影响，比如，kaebernick 等（2000）研究发现光照能影响mcs合成酶产量，mcyb和mcyd转录水平在强光照条件下有所提升，红光、蓝光以及一些特定的人为应激因素等，如产烷微生物（methylogen）和nacl的存在能减弱其转录水平8,9,10。因此，mcs的产生虽然是由微囊藻内在基因决定的，但环境条件可以调节和控制基因的表达，从而影响到毒素合成。图1.1 微囊藻毒素mc-lr的结构示意图1.1.3水稻的生物学特征水稻，属须根系，是一年生禾本科植物，叶长而扁，由许多小穗组成，共有24条染色体，高约 1.2 米。所结子实即稻谷，去壳后称大米或米。不定根发达，穗为圆锥花序，自花授粉。中国是世界上水稻的主要生产国。由于生物科技和基因工程技术近年来快速发展，科学家在 1998 年开始水稻基因组的分析与 整理，称为国际水稻基因组测序计划（international rice genome sequencing project；简称是 irgsp）。到 2002 年为止，整个水稻的基因图谱都已被解读。水稻的基因体是高等生物中基因定序最完整的，采用水稻作为受试生物，其清晰的遗传背景将有利分子生物学试验的顺利开展。1.2国内外相关研究微囊藻毒素被认为是一种具有自我强化机制作用的生态生长调节素，进入水体会影响水生植物种类的多样性，从而帮助蓝藻获得竞争优势，直至形成水华。水生植物则直接受到水体里面的mcs 影响，并可能通过他感作用（allelopathy）与产生毒素的藻类发生相互作用。在mcs对植物的毒性作用机制中，最主要的致毒机理可能是内源性ros水平的诱导升高。经mc-rr处理后，细长聚球藻（synechococcus elongatus）的生长明显受到抑制，ros水平升高引发氧化胁迫，导致丙二醛（mda）含量显著升高。mc-lr诱导甲藻（peridinium gatunense）产生的氧化应激与丝裂原活化蛋白激酶（mapks）途径上关键酶的激活有着密切关系。但是，mcs对浮游植物生理上的作用不仅仅是抑制，胡智泉11等发现1000g / l的mc-rr处理可显著促进了绿藻蛋白核小球藻、斜生栅藻和鱼腥藻的生长，可见微囊藻毒素在浮游植物种群演替中扮演的重要角色。已有研究证实金鱼藻（ceratophyllum dermesum）能够吸收水中的mc-lr，诱导植株ros水平升高；微粒体和谷胱甘肽硫转移酶（gst）活性升高，说明了在植物体内mc-lr参与了生物转化，与gsh结合形成共轭产物，使gsh含量下降。在抗氧化系统中，使细胞成分免受ros伤害的重要物质之一是还原性谷胱甘肽（gsh），而研究表明gsh结合mcs形成的共轭产物是生物对mcs最初解毒反应。pflugmacher（2004）通过hplc-maldi-tof检测出了金鱼藻体内的mc-lr-gsh（m/z 1302.79），直接证实了植物体内也存在着这一mcs解毒步骤；mc-lr的胁迫还能降低金鱼藻光合作用产氧量、改变金鱼藻色素表达模式和抑制其生长。szigeti等（2010）证实mc-lr暴露对金鱼藻生长造成抑制的原因是其通过干扰细胞骨架重组的方式抑制了金鱼藻芽尖细胞延伸。此外，尹黎燕等（2004）12发现mc-rr会对大型沉水植物苦草（vallisneria natans）的生长和发育产生不利影响，mc-rr处理后，苦草种子的发芽、子叶生长、真叶的形成和生长、不定根的形成和生长以及根毛的生长都受到了一定的抑制作用。就目前研究现状来看，当前微囊藻毒素对水生植物的毒理学研究开展得较少，相关研究还有待继续深入。1.3课题的提出1.3.1研究的目的和意义我国的滇池、巢湖、太湖等地区，由于湖泊富营养化严重，有大量的微囊藻毒素随着农业灌溉用水进入农田，目前，虽然已有学者对水稻、菠菜、莴苣、油菜、白菜等在微囊藻毒素暴露下的相关毒理效应进行了初步研究13,14,15，但相关研究明显不够深入，不同实验室的研究结果有时也有出入。综合 mc 对植物毒性效应的研究结果来看，大部分研究人员均观测到了 mc会对植物的光合作用造成一定的影响，可以表现在叶绿素含量的下降、chl a/chl b比值的改变、叶绿体超微结构收到一定损伤等，但对光合作用相关差异表达基因的筛选研究还鲜见报道，在这样的背景下，本研究以主要粮食作物水稻为对象，系统、深入研究微囊藻毒素对受试作物的生态毒性效应影响，用现代分子生物学手段分析其致毒机理，将为同类研究提供有价值的基础数据。1.3.2 研究的特色及创新点本研究围绕含蓝藻水华湖水用于田间灌溉的现实，主要研究微囊藻毒素对农作物生理生化指标的影响及作用机制，将传统毒理学方法、分子生物学、基因组学等方法相结合，从分子、细胞和个体水平较系统地建立起微囊藻毒素对水稻的光合作用影响研究的方法学，并应用生态毒理因组学等前沿生态毒理技术，初步阐明微囊藻毒素对水稻生态毒性效应的影响机制。采用低浓度长期胁迫的水培染毒方式，系统研究微囊藻毒素对水稻可能产生的生态毒性效应，并采用专业仪器测量水稻光合作用相关方面的，并进行数据分析，将对微囊藻毒素毒理学研究领域起重要的补充作用。2材料与方法2.1实验材料供体材料：微囊藻毒素mc-lr（alexis）受体材料：水稻种子（日本晴）实验地点：环境部南京环境科学研究所2.2微囊藻毒素与营养液配制微囊藻毒素母液配制：用乙醇溶解1mg微囊藻毒素粉末，使用提取枪反复冲洗至粉末完全溶解，15ml乙醇反复冲洗后，加入185ml超纯水定容至200ml，浓度为0.005mg/ml. 表2.1 水稻营养液元素营养液中元素含量使用盐类盐类用量 g大量元素每个取10ml1000ml，每一个n40尿素11.43p10nah2po4 2h2o5.04k40k2so48.93ca40cacl211.08mg40mgso47h2o40.50微量元素储备液250ml,一起mn0.5mncl24h2o0.375mo0.05(nh4)6mo7o242h2o0.0185b0.2h3bo30.2335zn0.01znso47h2o0.00875cu0.01cuso45h2o0.00775fe2.0fecl26h2o1.925柠檬酸（一水合物）2.9975注：制备铁和微量元素储备液时，先分别溶解各种盐类，再加入50ml硫酸以混匀，之后用蒸馏水稀释至1l。使用时，每1l营养液添加1.25ml微量元素储备液。将上述加入1000ml的容量瓶中使用蒸馏水定容混匀制成母营养液。（母液稀释后要用1mol/l的naoh调节ph至4.98）2.3水稻的处理过程2.3.1水稻种子的培养在干净的五个培养皿中分别放入200粒水稻种子，超纯水完全浸没放入恒温培养箱内，调节黑暗。把水稻培养皿取出把水倒掉，并用漏网筛以免水稻种子和水一道流失。剪三层纱布浸湿盖在种子上，再放入恒温培养箱，其中加入一盆水，以免纱布水分流失，并不定期观察补水（在纱布上喷洒水分）。在40个培养皿中，每个取10粒发芽比较好的种子插在泡沫塑料盖上，芽朝上根朝下，泡沫塑料盖预先戳10个小洞，并每个加入100ml稀释10倍的营养液，用锡箔纸包好，锡箔纸包至300ml处（避免根部光照），放进恒温培养箱培养,每两天换一次营养液。（条件：温度25，湿度75/70%，时间：光照14/暗反应10h）。 图2.2 1000粒饱满水稻种子进行浸种2.3.2对水稻进行染毒对水稻进行染毒实验，每两天换一次毒液，共培养34天。首先要制备稀释5倍的水稻营养液5l，加3.5ml naoh，调节ph至4.95。设置纯藻毒素的浓度梯度： 0.1, 1, 10,50g/l ，每一个浓度设置8个平行，培养皿上依次贴好标签。每一个浓度梯度分别为：0.1g/l mc-lr：100ml营养液+0.01ml纯藻毒素；1g/l mc-lr：100ml营养液+0.1ml纯藻毒素；10g/l mc-lr：99ml营养液+1ml纯藻毒素；50g/l mc-lr：95ml营养液+5ml纯藻毒素。（纯藻毒素浓度为0.001mg/ml)。培养至第7天时，改用稀释3倍的营养液，每一个浓度梯度分别为：0.1g/l mc-lr：150ml营养液+0.15ml纯藻毒素；1g/l mc-lr：150ml营养液+0.15ml纯藻毒素； 10g/l mc-lr：148.5ml营养液+1.5ml纯藻毒素；50g/l mc-lr：142.5ml营养液+7.5ml纯藻毒素。培养至第15天时，改用稀释2倍的营养液，加入营养液和纯藻毒素的量不变。第34天开始停止加入纯藻毒素，加入营养液不变，继续观察水稻的生长。2.3.3水稻生物量收集第10、20、34天每个浓度各取3盆植株，各挑10株长势均一的水稻，称量鲜重、整株重、株高、根长，记录数据后，贴上标签，放入-80oc冰箱中保存。2.4水稻叶子预处理2.4.1提取水稻叶片粗酶液每一个浓度的每一个平行样各称取0.1g冻存的叶片，立即于液氮下研磨成粉末状，加入1.5ml 50mm磷酸缓冲溶液（含1mm edta，1mm pmsf，5mm 抗坏血酸， 0.3% triton x-100和4%聚乙烯咯烷酮（pvp)，ph7.8)。提取液在10000 rpm下离心20min，上清液分装写好标签并储存在-80冰箱待测。所有操作均在-4下进行。2.4.2蛋白质含量的测定利用考马斯亮蓝法和纯的牛血清蛋白，根据722s型分光光度计测出蛋白质的标准曲线，并测出每一个浓度每一个平行样的蛋白质含量，记录数据，用来测定pod，mda，gsh作为基准单位。2.5植株营养学指标的测定测定水稻株高，根长和鲜重，每个浓度组拍照。然后，叶子和根茎剪开分别放入密封袋中写好标签保存于-80oc，以待以后测一系列数据。2.6生理生化指标的测定采用分光光度计测量蛋白含量来研究微囊藻毒素对水稻幼苗叶片和根中这些酶活性的影响。用酶标法测定过氧化物酶，微量还原型谷胱甘肽，植物丙二醛活性测定。(注：酶活性均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定) 酶标法的基本原理是将酶用胶联剂与抗体或抗原结合为酶标抗体或抗原，此酶标抗体或抗原可与组织内或固相载体上相应抗体或抗原发生特异反应，并牢固地结合，形成仍保持活性的免疫复合物。之后当加入相应底物时，底物会被酶催化而呈现出相应反应颜色，而颜色深浅是与相应抗体或抗原含量成正比。2.7光合作用指标的测定 分别于10，18，20，29，34，40天使用便携式光合测定仪（li-6400xt）测定水稻叶片净光合速率，叶绿素荧光，蒸腾速率。测定水稻叶片叶绿素荧光时，激发光强为最大光强的50%（1500 mol/m2/s），暗适应时间不少于30 min，记录时间5 s，均在室温下进行测定。光合效能活性的大小由可变荧光（fv）与最大荧光（fm）的比值fv/fm表示。图2.3 li-6400xt 光合作用测定仪2.8 水稻rna浓度和完整性测试2.8.1rna的提取（1）称取约0.1g叶片放入无rna酶的研钵中立即研磨成粉末状，迅速转入无rna酶的2ml离心管中，加入1ml trizol盖紧管盖，用力摇晃混匀。（2）分相 向离心管中加0.2ml氯仿之后盖紧样品管盖，为使其充分混匀，用力摇晃试管15s，之后冰上静置5min。4条件下，12000g/min离心15min。（3）沉淀 将上层水相（约400-500ul）转入到新的1.5ml ep管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后冰上放置15min，4 12000g/min离心10min。此时离心管底部出现白色胶状沉淀，即rna。（4）洗涤 将上清液小心倒掉，留下沉淀。用枪头把1ml 75%预冷乙醇沿离心管底部对胶状沉淀上下吹打几次。4条件下，7500g/min离心5min。（4）再溶解 小心倒掉上清液，离心5s。用枪头将离心管内残留乙醇吸出。放置超净工作台，约1-2min。加入20-50ul depc处理水（，用枪头吹打几次，以便rna快速溶解。（5）保存 提取的rna保存于-80超低温冰箱中。2.8.2测总rna完整性和浓度利用琼脂糖和1xtae混匀加热，冷却加入eb后制胶，将之前提取好的rna加入之后进行电泳，在紫外透射检测仪上观察rna电泳结果。若电泳后出现3条带即5s、18s和28s rna，则rna完整性较好（一般可见前2条）。图2.4 电泳仪 采用nanodrop1000微量光度计法测量rna的浓度图2.5 nanodrop1000微量光度计2.9 数据分析 实验结果表示为平均数标准误差（mean sde）；使用 spss 统计软件和单边anova 法对组间数据进行差异性显著分析，p0.05表示显著差异，图中标记为*，p0.01表示极显著差异，图中标记为*；origin 8.0统计软件处理数据。3结果与分析注：数据仅供环保部南京环科所使用。3.1植株营养学指标3.1.1株高图3.1不同浓度mc-lr对水稻株高的影响分别于10、20、34天从每个浓度组和空白组的每一个培养皿中各取出10株长势均一的水稻植株，利用三角尺测出每株株高，并记录下来。根据图3.1显示，微囊藻毒素浓度对株高有一定影响，在mc-lr为浓度为0.1 ug/l的低浓度时有促进作用，在高浓度（50 ug/l)的抑制作用极显著（p0.01）。3.1.2根长 图3.2不同浓度mc-lr对水稻根长的影响 分别于10、20、34天从每个浓度组和空白组的每一个烧杯中各取出10株长势均一的水稻，利用三角尺测出每株株高，并记录下来。根据图3.2显示，微囊藻毒素-lr在低浓度（0.1-1ug/l）时会对水稻根的生长起到促进作用，而随着浓度增高，抑制作用显著增加，并在浓度达到50ug/l时，抑制作用表现为极显著（p0.01）。植物根系是活跃的合成器官和吸收器官，根的根系活力水平和生长情况会直接影响地上部分的生长和营养状况及产量水平。水稻不能直接吸收利用mc-lr，但其作为一种外源性的有毒污染物，在高浓度条件下会使植物产生一些过激反应，经根吸收以后，通过根系运输到达植物体各组织器官，并通过一系列酶学反应过程，影响其生长。3.1.3植物鲜重图3.3不同浓度mc-lr对水稻植物鲜重的影响分别于10、20、34天从每个浓度组和空白组的每一个烧杯中各取出10株长势均一的水稻，利用电子天平测出每株植株鲜重，并记录下来。根据图3.3显示，微囊藻毒素在浓度低时会对水稻的增长起到促进作用，而随着浓度增高，抑制作用显著增加，在浓度为10ug/l时抑制作用为显著（p0.05），而高浓度组（50ug/l）对植物的增长起极显著抑制作用（p0.01）。3.2微囊藻对水稻根生理生化影响3.2.1过氧化物酶活性图3.4 不同浓度mc-lr对水稻过氧化物酶活性的影响我们采取不同浓度的微囊藻毒素（0.1-50ug/l）对水稻进行长期染毒培养试验，根据图中3.4数据显示，微囊藻毒素-lr在低浓度（0.1 ug/l）情况下，对水稻过氧化物活性有抑制作用（p0.05），而在1ug/l浓度作用下，则表现为极显著促进作用（p0.01），但随着浓度增加，抑制作用开始出现，尤其是在浓度为10-50 ug/l的时候出现了极显著的抑制作用（p0.01）。植物体中含有大量过氧化物酶，是活性较高的一种酶。它与生长素的氧化、光合作用及呼吸作用等都有关系。它的活性在植物生长发育过程中不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。3.2.2谷胱甘肽含量 图3.5 不同浓度mc-lr对水稻谷胱甘肽含量的影响根据图3.5显示，低浓度微囊藻毒素可诱导gsh的含量增加，并在0.1 ug/l 的mc-lr作用下，出现显著诱导（p0.05），然而，随着浓度的进一步增加，gsh含量又下降到正常值，在高浓度组（50 ug/l)作用下，gsh含量与对照组相比有着极显著下降的现象（p0.01）。谷胱甘肽具有抗氧化作用和耦合解毒作用，能帮助保持正常的免疫系统的功能，半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故常简写为g-sh），易与砷、铅、汞等重金属和碘乙酸、芥子气、自由基等毒素以及药物（如扑热息痛）等结合，因而具有耦合解毒作用。谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在抗肿瘤、延缓衰老、增强免疫力等功能性食品广泛应用。3.2.3丙二醛含量图3.6 不同浓度mc-lr对水稻丙二醛含量的影响根据图3.6显示，在mc-lr为1.0 ug/l时，植株机体出现了脂质过氧化损伤，随着浓度进一步升高，mda含量有所下降，并在10 ug/l的时候降到最低。丙二醛是多不饱和脂肪酸过氧化物的降解产物，与脂蛋白交联有毒性作用。脂质过氧化终产物丙二醛(mda)在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性。生物体内，脂质与自由基发生过氧化反应，丙二醛为过氧化终产物，会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性。3.3微囊藻毒素对光合作用的影响3.3.1净光合速率图3.7 不同浓度mc-lr对水稻净光合速率的影响据图3.7所知，在mc-lr低浓度（0.1 -1ug/l）的时候，对水稻净光合速率起显著促进作用（p0.05），紧接着就有下降的趋势，而在高浓度mc-lr（10-50 ug/l)则表现为极显著的抑制作用（p0.01）。叶绿体中的色素吸收光能将水分解产生h和氧的过程。光解水，产生氧气，将光能转变成化学能，产生atp。3.3.2叶绿素荧光图3.8 不同浓度mc-lr对水稻叶绿素荧光的影响据图3.8显示，低浓度组mc-lr对水稻叶绿素荧光有一定的抑制作用，而高浓度组的mc-lr（50 ug/l)造成了水稻叶绿素荧光极显著下降（p0.01）。由于mc-lr的生物抑制作用，水稻在生长过程中不仅在增长量，叶片数等指标上随mc-lr浓度增加而下降，而且mc-lr对于水稻本身的生理功能也产生了一定的毒害作用。光合作用是植物生长的基础生理过程，抑制植物生长的因素包括影响植物的光合作用过程。叶绿素的含量和组成是光合作用的物质基础，叶绿素的含量降低就会使光合作用减弱，从而导致植物生物量下降，使植物不能正常新陈代谢。因此叶绿素含量高低在一定程度上反映了光合作用水平。3.3.3蒸腾速率图3.9 不同浓度mc-lr对水稻蒸腾速率的影响据图3.9显示，mc-lr浓度越高，对水稻的抑制作用越显著，且在整个实验过程中对水稻的蒸腾速率都起到抑制作用，在浓度达到10-50ug/l时抑制作用为极显著（p0.01）。植物蒸腾作用主要是气孔蒸腾， 气孔蒸腾显著受co2、温度和光等因素的调节。气孔运动影响的因素之一是co2，co2在浓度很低时会促进气孔张开，而在高浓度时能导致气孔迅速关闭（光下或暗中结果一样）。高浓度的mc-lr，会促进co2的产生，使co2浓度升高，增加质膜透性，导致k + 泄漏，质膜内外的溶质势梯度减弱，另一方面也会使细胞内酸化，影响跨膜质子浓度差的建立。因此， mc-lr浓度高时，会抑制水稻植株的气孔蒸腾。3.4不同浓度微囊藻毒素-lr暴露下水稻对毒素的吸收和累积图 3.10 不同浓度mc-lr暴露对水稻吸收和累积毒素影响：上（叶片），下（根）如图3.10所示，叶片中毒素含量低于根部吸收的毒素含量，从总体上看不同浓度胁迫下毒素含量经历了一个先上升后下降的过程，而在mc-lr含量大于10 g/l 后，植物组织中的mc-lr随暴露时间延长有了一个清除的过程，说明这与体内gsh共轭反应是密切关联的。综上所述，mc-lr不仅影响植物的生长，对植物的叶绿素含量、形态等也都会产生影响，主要表现在重量减少，叶片的光合作用率减少、幼苗发生变形、谷胱甘肽含量减少等方面。可能跟其对动物致毒机理类似，微囊藻毒素能强烈抑制植物中过氧化物酶的活性，因此可能影响营养物质的迁移吸收及根韧皮部的功能，从而影响茎叶的生长。从研究资料得知，mc-lr的确对作物具有毒性作用，而且随着灌溉用水进入农田之后也能导致植物形态学上的变化和抗氧化系统损伤。这其中具体的毒性效应较为复杂，且不同结构的微囊藻毒素表现出一定的毒性差异，植物种类和生长阶段不同对微囊藻毒素的敏感性也有差异。结论本研究选用水稻为受试生物，研究环境浓度下的mc-lr在水稻从发芽到成长过程中的累积以及由此引起的各种营养学指标，生理生化效应及光合作用影响，并在此基础上探讨低浓度mc-lr对水生植物的致毒机制并筛选相关敏感生物标志物，研究结果表现为：1.mc-lr对受试作物水稻的毒性影响存在差异，而水稻对微囊藻毒素的毒性反应也不一致，毒素在抑制水稻发芽率的同时，对植物的营养学指标、生理生化表现以及光合作用也造成了一定的影响。2.mc-lr对水稻的生长、形态会产生影响，从现象来看主要表现在幼苗发生变形，从营养学指标来看，不同浓度mc-lr对水稻的生物量和生长速率有显著的抑制作用。测得的株高、根长、鲜重等生理指标数值与空白对照组相比，均偏低，这说明mc-lr对水稻具有明显的抑制效应。水稻的生长随mc-lr浓度的升高而逐渐减缓，而在实验终止时，50ug/l的高浓度mc-lr染毒组生物量最低。空白对照组的水稻在整个实验过程中生长正常，叶片呈深绿色，叶形规则完好。而染毒的水稻出现叶片发黄，新生叶片较小等明显的生长抑制现象，说明mc-lr对水稻植株的生长发育有一定程度的伤害和抑制。3.mc-lr对水稻过氧化物酶、谷胱甘肽含量、丙二醛含量也都会产生影响，主要表现含量的减少，而过氧化物酶、谷胱甘肽含量、丙二醛含量与水稻植株的生长发育，免疫系统的正常维持有关，说明mc-lr对水稻生长的抑制与其对生物体内酶活性的抑制也有一定关系。4.光合作用的影响主要表现在净光合速率，叶片荧光速率，蒸腾速率等光合作用指标数值均低于空白组，表现出极显著的抑制作用。而实验结束时高浓度mc-lr染毒组的数值最低。说明mc-lr对水稻生长的抑制与其对光合活性的抑制有关。综合整个实验过程，得出以下结论：低浓度的mc-lr会存在长期胁迫对营养生长期水稻生长发育、株高、鲜重和过氧化物酶、谷胱甘肽含量、丙二醛含量以及叶片叶绿素含量、蒸腾速率、净光合速率等产生影响的现象。植物的根系是活跃的合成器官和吸收器官，根的根系活力水平和生长情况会直接影响植物地上部分的营养状况和生长。水稻无法直接吸收利用mc-lr，它作为一个外来性的毒性物质，会在达到一定浓度的时候使植物产生一些过激反应，经过根吸收，运输到植物的各个器官中，通过一系列的化学反应，影响植物的生长发育，导致植物苗高、根长、鲜重在低浓度下起稍微的促进发育作用，而在高浓度下则表现为极显著抑制发育作用。由于时间原因，在微囊藻毒素对水稻生理机制的影响的研究不是很透彻，对其产生生态灾害方面尚不是很清楚，但是根据我们目前实验数据可得：虽然累积量较低，但水稻根部确实能吸收和积累mc-lr，这无疑证明了mc-lr具有进入食物链的潜在风险，而mc-lr会抑制水稻的体内酶的合成以及正常光合作用过程，导致水稻无法正常生长，造成产量降低等结果。所以在以后的种植作物过程中，要特别注意含有微囊藻的水会影响水稻根部的生长，要谨慎使用。本实验中采用了考马斯亮蓝法，trizol法提取rna，光合作用仪等技术定性、定量分析mc-lr对水稻根、叶组织的影响，通过采取低浓度长期胁迫水稻的水培染毒方式以及对照组实验，从微囊藻毒素浓度由低到高的变化，揭示了微囊藻毒素对水稻的影响事实，该研究对阐明微囊藻毒素对陆生高等植物的生态毒性效应特点具有十分重要的现实意义。致 谢首先我要特别感谢我的指导老师姜锦林老师，陈荣平老师和张敏敏师姐。从论文的选题、实验到最后论文的撰写都离不开老师和师姐的耐心指导和帮助，是他们的敦促让我在这短短的三个月学习掌握了大量专业知识和实验方法。姜老师和张师姐勤奋踏实的工作作风、严谨求实的治学态度、宽容豁达的为人态度使我受益匪浅，不仅是我将来事业上学习的榜样，也为我的整个人生点亮了航程。在即将离开这熟悉的校园，再次表示深深的敬意。同时，也祝愿姜老师，陈老师和张师姐工作顺利、学习进步，身体健康，万事如意！感谢这篇论文所涉及到的学者，本文引用了数位学者的研究文献，如果没有各位学者研究成果的帮助和启发，我将很难完成这篇论文的写作!感谢评审论文和出席论文答辩会的各位老师在百忙中给予悉心的指导!最后，衷心的感谢所有关心和帮助过我的人们，在你们的支持下我才能顺利完成我的毕业论文，有了你们，我的大学生活也变得完美，在此对他们表示最诚挚的谢意！参考文献1 pflugmacher s. promotion of oxidative stress in the aquatic macrophyte ceratophyllum demersum during biotransformation of the cyanobacterial toxin microcystin-lr. aquat toxicol, 2004, 70:169178.2 姜锦林, 宋睿, 任静华, 等. 蓝藻水华衍生的微囊藻毒素污染及其对水生生物的生态毒理学研究. 化学进展, 2011, 23:246253.3 吴庆龙, 谢平, 杨柳燕, 等. 湖泊蓝藻水华生态灾害形成机理及防治的基础研究. 地球科学进展, 2008, 23:11151123.4 amado ll, monserrat jm. oxidative stress generation by microcystins in aquatic animals: why and how. environ int, 2010, 6:226235.5 campos a, vasconcelos v. molecular mechanisms of microcystin toxicity in animal cells. int j mol sci, 2010, 11:268287.6 chen jz, song lr, dai j, et al. effects of microcystins on the growth and the activity of superoxide dismutase and peroxidase of rape (brassica napus l.) and rice (oryza sativa l.). toxicon, 2004, 43:393400.7 chen j, han fx, wang f, et al. accumulation and phytotoxicity of microcystin-lr in rice (oryza sativa). ecotox environ safe, 2012, 76:193199.8 clark sp, davis ma, ryan tp, et al. hepatic gene expression changes in mice associated with prolonged sublethal microcystin exposure. toxicol path, 2007, 35:594605. 9 唐承佳. 太湖贡湖湾水源地微囊藻毒素和含硫衍生污染物研究. 学位论文,2010,37:590-610.10 戴家银, 王建设. 生态毒理基因组学和生态毒理蛋白质组学研究进展. 生态学报, 2006, 26:930934.11 胡智泉, 刘永定, 肖波. 微囊藻毒素对几种淡水微藻的生长和光合活性的影响. 生态环境, 2008, 17:885890.12 尹黎燕, 黄家权, 李敦海等. 微囊藻毒素对沉水植物苦草生长发育的影响. 水生生物学报, 2004,144:752758.13 chen j, zhang d, xie p, et al. simultaneous determination of microcystin contaminations in various vertebrates (fish, turtle, duck and water bird) from a larg