晚期氧化蛋白产物单克隆抗体的制备和初步应用(免疫学专业论文参考).pdf

南方医科大学2 0 0 8 级硕士学位论文 晚期氧化蛋白产物单克隆抗体的制备和初步应用 课题来源：与南方医院肾内科合作课题 专业名称 学位申请人 指导教师 答辩委员会主席 答辩委员会成员 免疫学 侯晓睿 富宁教授 刘北一副教授 论文评阅人邱晓彦教授( 北京大学) 周秋根教授一( 南方医科大学) 2 0 11 年4 月15 日 学一 一 一 一学一学大一，、一，一，一大一大技一学一学一学一科一科科一大一大一大一医一医中一山一头一南一方一方华一中一汕一謦一南一南 000000 授一授一授一授一授一授 教一教一教一教一教一教 尘有一生一俭一燕一良 关一长一康一军一小一政沈一吴一李一向一车一陈 免疫炎症性疾病和恶性肿瘤( 结肠、直肠癌、乳腺癌等) ，因此a o p p 被认为是 体内氧化应激的敏感生物学标志。 近年不断增加的研究证据表明，血浆a o p p 水平增高促使该分子在肾脏和 血管等组织中沉积并与慢性肾脏病( c h r o n i ck i d n e yd i s e a s e ，c k d ) 及动脉粥样硬 化病变的发生发展密切相关。慢性a o p p 在体内堆积促进糖尿病动物模型的肾 脏的炎症反应和肾组织损伤，促使c k d 动物模型的肾脏炎症和纤维化，并促使 高脂血症动物发生动脉粥样硬化性病变。这些研究结果均表明，a o p p 潴留不仅 是反映体内氧化应激的指标，其本身可能是一类促进组织炎症和纤维化的生物 致病分子。深入探讨a o p p 在组织中的分布及其与病变的关系对于阐明a o p p 致病的分子基础至关重要，并有可能为上述疾病的发生发展提供新的生物学标 志或干预靶标。 中文摘要 然而，目前检测组织中a o p p 水平尚缺乏理想方法。检查外周血a o p p 则 通常采用比色分析法以3 4 0 r i m 处吸光度值以反映标本中a o p p 水平，这是基于 a o p p 结构含双酪氨酸，在酸性条件下于3 4 0 n m 处有一特异吸收峰。此法虽然 简便，但易受血脂、纤维蛋白的干扰而影响其准确性；且不能用于对病变组织 或细胞中的a o p p 定位。 我们拟建立免疫学检查方法克服上述缺点。采用体外次氯酸修饰的白蛋白 作为抗原，成功制备了特异性识别a o p p 的单克隆抗体，通过w e s t e r nb l o t 、免 疫组织化学染色首次证实单抗识别血清和沉积于肾脏中的a o p p ，初步建立双单 抗、单多抗及多单抗夹心e l i s a 法鉴定人工制备的a o p p ，为深入研究a o p p 这种内源性致病分子提供了必要工具。此外，我们利用噬菌体肽库筛选技术对 a o p p 模拟表位进行了初步探讨。 第一章特异性识别天然a o p p 单克隆抗体制备和鉴定 以次氯酸( h o c i ) 氧化不同种属血白蛋白( 包括人血清白蛋白h s a 、小鼠血 清白蛋白m s a 、牛血清白蛋白b s a 、兔血清白蛋白r s a ) 和人纤维蛋白原、人 i g g 、人低密度脂蛋白( l d l ) ，按蛋白：h o c l 摩尔比为1 ：1 4 0 等体积混合，室温 放置3 0 分钟。制备的a o p p 在p b s 中透析2 4 小时，除去游离的h o c i 。a o p p 含量通过测定酸性条件下3 4 0 n m 的吸光度，以氯胺t 为标准测得。 用 a o p p m s a 为免疫原加佐剂免疫b a l b c 小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 ( n s 1 ) 融合，按常规方法制备杂交瘤。以a o p p h s a 为抗原包被酶标板，并 以未氧化正常h a s 做平行筛选以排除与正常蛋白的交叉反应。间接e l i s a 鉴定 筛选特异性识别a o p p h s a 的杂交瘤克隆，所获两株命名为3 f 2 和4 c 5 ；扩大 培养后制备腹水，用辛酸硫酸铵沉淀法、h i t r a pp r o t e i n g 杀和层析柱从腹水中纯 化抗体。抗体类别鉴定显示3 f 2 为i g g l ，4 c 5 为i g g 2 a 。 间接e l i s a 结果显示2 株单抗均能与不同种属来源的氧化型白蛋白 ( a o p p h s a 、a o p p b s a 、a o p p m s a 、a o p p r s a ) 、h o c i 人纤维蛋白原、 n 硕士学位论文 h o c i 一人i g g 、h o c l l d l 特异性结合，而与未氧化蛋白及c u 2 + 氧化的l d l 、糖 基化蛋白均无交叉反应。竞争e l i s a 鉴定表明这两株单抗分别识别a o p p 不同 位点。w e s t e r nb l o t 结果显示，在变性与非变性条件下，3 f 2 可特异性结合人工 制备的a o p p h s a 、h o c l 一i g g 、h o c i 人纤维蛋白原。 单抗3 f 2 亦可识别天然血浆与组织中的a o p p 。能在一定程度上区分血液透 析患者和正常人血浆中a o p p 含量的差别以及慢性肾衰患者透析前后血浆a o p p 含量的不同。免疫组织化学法检查显示3 f 2 可特异性结合沉积于大鼠模型及各 种慢性肾脏病患者肾组织中的a o p p ，这种结合可被外源a o p p 阻断。此外， 3 f 2 可阻断a o p p 诱导小鼠单核细胞株r a w 2 6 4 7 细胞胞内氧化反应簇( r o s ) 生成。 第二章建立双抗体夹心e l i s a 检测血浆a o p p 的尝试 以h l t r a pp r o t e i ng 柱纯化抗体3 f 2 和4 c 5 ，纯度达9 5 以上并按照操作流 程标记生物素。分别以双单抗、多单抗夹心、单多抗夹心e l i s a 方法检测人工 制备的a o p p 并进行了体系的优化。在抗体包被浓度为l i t g r r d ，封闭液为0 2 5 酪蛋白，洗液与抗体稀释液均为0 5 p b s t ，检测抗体浓度为0 5 9 9 m l 时即可良 好检测标准品。之后，我们又试用了竞争e l i s a 的方法，以人工制备的 a o p p h s a1 2 5 1 - l g m l 包被酶标板，倍比稀释a o p p h s a ( 0 - 4 9 9 m 1 ) 、慢性肾衰 患者、健康成人血清与0 s g g m lb i o 3 f 2 等体积混匀后加入板孔中，最后加入 h r p 亲和素。标准曲线的拟合度良好，而且各种抗体组合的双夹心e l i s a 均可 特应性地检出人工体外制备的a o p p ，且敏感度可达n g m l 水平但是肾衰患者与 正常人的测定值之间没有统计学意义。因此又尝试用敏感性更强的时间分辨荧 光检测法检测患者血清a o p p ，按照普通夹心e l i s a 的条件摸索，即以4 c 5 i g g m l 包被酶标板，酪蛋白封闭后，加入不同浓度的标准品a o p p h s a ，反应 3 0 m i n 后加入b i o 一3 f 20 5 t t g m l ，3 0 m i n 后加入铕标记的亲和素，15 m i n 后加入增 强液，3 7 反应5 m i n 后多功能酶标仪测值。所建立的标准曲线已经符合i 临床检 i i l 中文摘要 测的需要，但是在血清样本的检测上面，还是存在一定的问题，最佳的包被与 检测条件还要改变。 第三章a o p p 表位模拟序列的筛选 鉴于已确定的自然和人工制各的a o p p 均为在体内外次氯酸氧化的白蛋白、 脂蛋白或其他蛋白，即已形成非天然抗原表位。本章工作的目的旨在探索体内 是否有自然存在的类似于a o p p 表位的序列，如果存在，将会对机体产生何种 影响。 我们以亲和层析纯化的抗a o p p 多克隆抗体为靶标，对噬菌体随机十二肽 库进行了三轮筛选后，鉴定出1 8 个阳性克隆，均可与多抗产生较强的结合，且 不为吸板克隆。挑选6 个阳性克隆经d n a 测序得到三条序列： g w l e e n l f d h t r 、s s a l n d m l r d q r 、d s l q d m l a d e w q 。上述序列中具有 近似的l x d m l x d ( x 为任意氨基酸) 核心序列，提示这一核心序列有可能是 模拟a o p p 共同表位的优势序列。其次又以抗a o p p 单克隆抗体3 f 2 为靶标， 筛选噬菌体十二肽库，经三轮筛选、e l i s a 鉴定获得1 8 个与3 f 2 特异结合的噬 菌体克隆，但这些阳性克隆与抗a o p p 多抗和4 c 5 单抗无交叉反应。d n a 测序 得到s s y s q d a a t l r l 、l n t p y r n q l a y p 、l p y f d s y d s a l p 、 a h p m p m t q l f t s 四条序列中未发现保守序列。最后，在以单抗4 c 5 为靶分子 筛选噬菌体十二肽库，经e l i s a 鉴定得到的1 2 个克隆与4 c 5 特异结合，其中 一个克隆( n o 2 ) 与多抗及单抗3 f 2 较强结合。d n a 测序得到的三种序列， l s p l p h p i t r t v 、q n l p e w l a l h l d 、r a s p d l l e h q l m ，但未发现保守序列。 采用n c b i 数据库( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v b l a s t ) 的b l a s t p 程序在蛋白质水平 上对筛选的所有序列分别进行同源性搜索，其结果显示这些序列存在于某些真 菌属、藻类的蛋白分子上，而并不存在于正常的人类与哺乳动物蛋白分子中。 即模拟a o p p 抗原表位的序列并不存在于已知的正常人与哺乳动物蛋白分子中， i v v s u p e r v i s o r ：f un i n g l i ub e i y i a b s t r a c t a d v a n c e do x i d a t i o np r o t e i np r o d u c t s ( a o p p s ) a r et h ed i t y r o s i n e - c o n t a i n i n ga n d c r o s s l i n k i n gp r o t e i np r o d u c t sf o r m e dd u r i n go x i d a t i v es t r e s s p l a s m aa o p p sm i g h t b ef o r m e dm a i n l yb yt h ee x p o s u r eo fs e r u ma l b u m i nt o h y p o c h l o r o u sa c i d ( h o c l ) i n c r e a s e dl e v e lo fc i r c u l a t i n ga o p p si np a t i e n t sw i t hc h r o n i cr e n a lf a i l u r e ( c r f ) ， h e m o d i a l y s i s ( h d ) w a sf o u n df i r s t l y , t h e nt h i sp h e n o m e n o ni np a t i e n t s 谢t hd i a b e t e s ， o b e s i t yo rm e t a b o l i cs y n d r o m e ，a t h e r o s c l e r o s i s ，a n do t h e rc o m m o nd i s e a s e sw a s c o n f i r m e d a d d i t i o n a l l y ，i n c r e a s i n ga o p pw a sa l s or e p o r t e d i np a t i e n t s 诵m r h e u m a t o i da r t h r i t i s ，l a l c e r a t i v ec o l i t i sa n do t h e ri m m u n ea n di n f l a m m a t o r yd i s e a s e s a n dm a l i g n a n tt u m o r s ( c o l o n ，r e c t u m ，b r e a s t , e t c ) c o n s e q u e n t l y , a o p p sh a v eb e e n c o n s i d e r e da st h es e n s i t i v em a r k e r so fo x i d a n t - m e d i a t e dp r o t e i nd a m a g e i nr e c e n ty e a r s ，i n c r e a s i n ge v i d e n c e sh a v es h o w nt h a te l e v a t e dl e v e l so fp l a s m a a o p pi sc l o s e l yr e l a t e dt oo c c u r r e n c ea n dd e v e l o p m e n to fc h r o n i ck i d n e yd i s e a s e ( c k d ) a n da t h e r o s c l e r o t i c d i s e a s e i th a sb e e nd e m o n s t r a t e dt h a tc h r o n i c a c c u m u l a t i o no fa o p p nv i v oc a nl e a dt oi n f l a m m a t i o na n dr e n a lt i s s u ei n j u r yi m a n i m a lm o d e lo fd i a b e t i ck i d n e y , a n dp r o m o t er e n a li n f l a m m a t i o na n df i b r o s i si n c k da n i m a lm o d e l s ，a n da l s oc a u s ea t h e r o s c l e r o s i sv e n e r e a l c h a n g e s i n h y p e r l i p i d e m i aa n i m a l s t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a ta o p pi sn o to n l yam a r k e ro f a b s t r a c t o x i d a t i v es t r e s s ，b u ta l s oab i o l o g i c a l p a t h o g e n i c m o l e c u l e sf o r p r o m o t i n g i n f l a m m a t i o na n df i b r o s i s c o n f i r m i n gt h e d i s t r i b u t i o no fa o p pi nt h eo r a n go r t i s s u e sa n dt h er o l ei np a t h o g e n e s i si sv i t a lf o rc l a r i f y i n gt h em o l e c u l a rb a s i so f d i s e a s e s c o n s e q u e n t l y , a o p pm a yb e an e wb i o l o g i c a lm a r k e rf o rd i a g n o s i s ， e v a l u a t i o no fp r o g n o s i si np a t i e n t s 、析t l la b o v ed i s e a s e s , a n da l s ob e c o m ea n i n t e r v e n t i o nt a r g e tf o rr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to fn e w t h e r a p y s i n c ea o p pw i t hd o u b l et y r o s i n e b a s e ds t r u c t u r e ，c a ne x h i b i tas p e c i f i cp l a c ei n t h e3 4 0 n ma b s o r p t i o np e a ku n d e rt h ea c i d i cc o n d i t i o n ，t h ec u r r e n t l ym e t h o df o rb l o o d s a m p l e si sc o l o r i m e t r i ca s s a yw i t hc h r o m i n e - te q u i v a l e n ta tt h ea b s o r b a n c ea t3 4 0 n m t or e f l e c tt h ea o p pl e v e l a l t h o u g ht h i sm e t h o di s s i m p l e ，t h e r e a r es o m e d i s a d v a n t a g e ss u c ha sb e i n gi n t e r f e r e db yh y p e d i p i d m i a , f i b r i ne t e ，a n dn e v e r b eu s e d f o rl o c a l i z a t i o no f a o p pi nl e s i o nt i s s u e so rc e l l s i nt h i sw o r k ，t h e r e f o r e ，w ew o u l dl i k et od e v e l o p et h ei m m u n o a s s a yb a s e do n m o n o c l o n a la n t i b o d y ( m a b ) t od e t e c ts p e c i f i c a l l yt h ea o p pb o t hi ns e r u ma n d t i s s u e s p a r ti p r e p a r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fm o n o c l o n a ia n t i b o d ya g a i s ta o p p a o p pw a sp r e p a r e d nv i t r oa c c o r d i n gt ot h em e t h o dd e s c r i b e db yw i t k o - s a r s a t a n do u rl a b o r a t o r y b r i e f l y , e n d o t o x i nf r e eh s a ( h u m a ns e r u m a l b u m i n ) m s a ( m u r i n e s e r u m a l b u m i n ) b s a ( b o v i n s e r l l n a l b u m i n ) r s a ( r a b b i t s e r u m a l b u m i n ) a n dh u m a nf i b r i n o g e n , i m m u n o g l o b u l i nga n dl o w - d e n s i t yl i p o p r o t e i n ( l d l ) w e r ei n c u b a t e dw i t hh o c la tm o l a rr a t i o1 ：14 0a tr o o mt e m p e r a t u r ef o r3 0 m i na n dt h e nd i a l y z e da g a i n s tp b st or e m o v ea n yf r e eh o c ii nt h es o l u t i o n a o p p c o n t e n tw a sd e t e r m i n e db ym e a s u r i n ga b s o r b a n c ea t3 4 0 n mi na c i d i cc o n d i t i o n , a n d w a sc a l i b r a t e dw i t hc h l o r a m i n e s - t a o p p s w e r ea tac o n c e n t r a t i o no f4 5 士o 5 n m o l m gi nh o c i - o x i d a t e dp r o t e i na n do n l y0 2 a ：o 0 2u m o l m gi nu n o x i d a t e dp r o t e i n s i x w e e k - o l df e m a l eb a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e dw i t ha o p p - m s ae m u l s i f i e dw i t h 硕士学位论文 a d j u v a n t f o r5t i m e s t h em a b st oa o p pw e r eg e n e r a t e da c c o r d i n gt ot h e c o n v e n t i o n a lp r o t o c 0 1 i nb r i e f l y , s p l e e nc e l l sf r o mi m m u n i z e dm i c ew e r ef u s e d 、柝t l l m y e l o m ac e l ll i n en s 一1t of o r mt h eh y b r i d o m ac e l l s t h ea n t i - a o p pa n t i b o d i e si nt h e h y b r i d o m ac u l t u r es u p e r n a t a n t sw e r es c r e e n e db yi n d i r e c te l i s a w i t l la o p p h u m a n s e r u ma l b u m i n ( a o p p - h s a ) a sa n t i g e na n dh s aa sc o n t r o lt oe x c l u d et h e p r o d u c t i o no fa n t i b o d yt on o r m a lp r o t e i n t h es e l e c t e dh y b r i d o m ac e l l sw e r ei n j e c t e d i n t om i c ep r e t r e a t e db yf r e u n di n c o m p l e t ea d j u v a n ti n s t e a do fp r e s t e i nt og e n e r a t e a s c i t e si n c l u d i n gm o n o c l o n a la n t i b o d i e s t h em a b sf r o ma s c i t e sw e r ep u r i f i e db y p r e c i p i t a t i o n 、析t hc a p r y l i ca c i da n da n a m o n i u ms u l f a t ea n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y u s i n gh i t r a pp r o t e i ngh p , a n dt h ep u r i t yo fm a b sw a sd e f i n e da sm o r et h a n9 0 t h ei m m u n o g l o b u l i n ei s o t y p e sf o r3 f 2a n d4 c 5w e r ei d e n t i f i e da si g g la n di g g 2 a , r e s p e c t i v e l y t h e s et w om a b sw e r ep r o v e d t os p e c i f i c a l l yb i n d 、析t l lh o c i - o x i d a t i v ea l b u m i nf r o md i f f e r e n tg e n e r a ( m o u s e ，r a b b i t ，b o v i n ea n dh u m a n ) ，b u tn o t 、析t 1 1n a t i v ef o r m s t h eb i n d i n ga c t i v i t yo fm a b si n c r e a s e di n p a r a l l e l 、i t l lt h e i n t e n s i t yo fh o c l - o x i d a t i o n i na d d i t i o n ，t h em a b sa l s or e a c t e dw i t hh o c l m o d i f i e dl d l ( h o c l 一l d l ) ，h o c i - i g ga n dh o c l - f i b r i n o g e n , b u tn o t 谢mt h e o x i d i z e dl d l ( o x l d l ) g e n e r a t e db yc u 2 + ，an o n - p h y s i o l o g i c a la g e n t m o r e o v e r , m a b sd i dn o tr e a c t 、析mg l y c o s y l a t e dp r o t e i n s w ea l s op r o v e dt h a t3 f 2a n d4 c 5 c a nr e c o g n i z et h ed i f f e r e n te p i t o p eo na o p p a st h ec u r r e n ta s s a yl i k ec h r o m i n - te q u i v a l e n t , a o p pi saq u a n t i t i v ep a r a m e t e r u s e df o rc o m p a r i s o no fd i f f e r e n c eb e t w e e ni nh e a l t h ya n dp a t i e n t s ，w ep r o v e dt h a t t h e w e s t e r nb l o tb a s e do nn a t i v ep a g ea n ds d s p a g ec o u l db eu s e dt od i s t i n g u i s ht h e t h ed i f f e r e n c eo fs e r u mo rp l a s m aa o p pl e v e l sb e t w e e nh dp a t i e n t sa n dh e a l t h y c o n t r o l s m o s ti m p o r t a n t l y , as i g n i f i c a n ta c c u m u l a t i o no fa o p p 、7 l ，i t hd i f f e r e n t d i s t r i b u t i o np a r e r n sw a so b s e r v e di nt h er e n a lt i s s u eo fm o d e lr a t sa n dp a t i e n t sw i t h c k d f o rt h ef u r t h e rc o m f i r m a t i o n , t h es t a i n i n gi nt u b u l e sb y3 f 2w a sc o m p l e t e l y a b s t r a c t b l o c k e db ye x o g e n o u sa o p p i na d d i t i o n ，m a b3 f 2i n h i b i t e dt h ep r o d u c t i o no fr o s b yr a w 2 6 4 7c e l l ss t i m u l a t e dw i t ha o p p p a r ti i t h ee s t a b l i s h m e n to fs a n d w i c he l i s ad e t e c t i o ns y s t e mf o ra o p p t w om a b sa n do n ep o l y c l o n a la n t i b o d y ( p c a b ) a g a i n s ta o p p , a n dt h e i r c o n j u g a t e s 、析t hp e r o x i d a s ef l i p p ) o rb i o t i nw e r eu s e dt os e tu pt h es a n d w i c he l i s a w i t he i g h tk i n d so fa n t i b o d yp a i r si n c l u d i n gm a b - m a b ，p c a b m a b ，m a b - p e a b 弱 c a p t u r ea n t i b a o d ya n dd e t e c t i n ga n t i b o d y , r e p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l m o s t a l lo fs a n d w i c he l i s ab ya b o v ea n t i b o d yp a i r sc a nb eu s e dt od e t e r m i n e da r t i f i c i a l a o p po ro x i d a t e d - a l b u m i ni nv i t r ov e r y s p e c i f i c a l l ys e n s i t i v e l y h o w e v e r , t h e s e s a n d w i c he l i s as y s t e m sc o u l dn o tb eu s e dt od i s t i n g u i s ht h ed i f f e r e n c eo fa o p p l e v e li nn o r m a ld o n o r sa n dc k d p a t i e n s ，a l t h o u rt h es e n s i t i v i t yo ft h e s es y s t e mw e r e p r o b e dt ob ea b o u t10n g m lo fa o p pw h i l et h es e r u ma o p p 弱p g m ll e v e l t h eo n e o fr e a s o n sf o rt h i sp h e n o m e n u mm i g h tb ea t t r i b u t e dt oa t h o r o u g h l yw a s h i n gd u r i n g e l i s a ，w h i c hm a yi n d u c et h ea o p pa g g r e g a t et ob ed i s a g g r e g a t e do rt ob em o n o m e r f r o mp o l y m e rf o r m ，s u g g e s t i n gt h a tt h em o r es e n s i t i v em e t h o df o rm o n o m e rw o u l dh e r e q u i r e d t h e r e f o r e ，w eh a v et r i e dt od e v e l o pad o u b l em a b ss a n d w i c hs y s e mb y t i m e - r e s o l v e df l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a y ( t r f i a ) t h a ti sm o r es e n s i t i v ea n ds t a b l e i nb r i e f l y , t h em a b4 c 5w a su s e d 鹤c a p t u r ea n t i b o d y , a n d0 5 p g m lb i o t i n - l a b e l e d 3 f 2w a su s e d 弱d e t e c t i n ga n t i b o d yf o ri n c u b a t i o na t3 7 0 cf o r3 0m i na n df o l l o w e d b ya d d i n ge u - s t r e p t a v i d i nc o n j u g a t ea t3 7 0 cf o r15 m i n , a n df o l l o w e db yt h o r o u g h l y w a s h i n g ；t h e nt h ep o t e n t i a t o rw a sa d d e da n di n c u b a t e da t3 7 0 cf o r5m i n t h e f l u o r e s c e n c ew a sr e a da t4 5 0h i l lu s i n ga l la u t o m a t i cm i c r o p l a t er e a d e r ( p e r k i ne l m e r w a l l a c14 2 0 ) u n f o r t t m a t e l y , t h er e s u l t si sr a t h e rs a m e 私t h a tb ye l i s a ，w h i c hi s s p e c i f i ca n ds e n s i t i v ef o rd e t e r m i n i n ga r t i f i c i a la o p p , b u tn o tf o rn a n a ls e l u ma o p p 硕士学位论文 n o w , w ew o u l ds t a r tan e wa t t e m p t i o nb yi m m u n o t u r b i d i m e t r i cm e t h o d st h a tc o u l d b ed e t e r m i n e db yo n es t e pa n dw i t h o u ta n yw a s h i n g p a r ti i i s c r e e n i n go fp e p t i d es e q u e n c em i m i ct oa o p pf r o mp h a g e d i s p l a y e dp e p t i d el i b r a r y s i n c et h ea o p pi ns e r u mo rt i s s u ea sw e l la sa r t i f i c i a la o p pa r en o tn a t u r a l e p i t o p et h a tm a yf o r mn e ws e q u e n c e ，w ew a n tt ok n o ww h e t h e rt h e r ei sa n ys a m eo r s i m i l a rs e q u e n c et oe p i t o p eo na o p po rn o t t h ea f f i n i t yp u r i f i e dp o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s ta o p pw a su s e da sat a r g e tt o s c r e e nt h e12 - m e rp h a g ed i s p l a yp e p t i d el i b r a r y a f t e rt h r e er o u n d so fs c r e e n i n g ，a t o t a lo f18c l o n e sw e r ei s o l a t e dt h a ts h o w e ds p e c i f i cr e a c t i v i t yw i t ht h ep c a b ， s e l e c t i o no fs i xp o s i t i v ec l o n e sw e r es e q u e n c e db yt h et h r e ed n as e q u e n c e s ： g w l e e n l f d h t r , s s a l n d m l r d q r ，d s l q d m l a d e w q t h ea n a l y s i so f a m i n oa c i d s e q u e n c e r e v e a l e dt h em i m o t o p e s e q u e n c e 、析t l lac o m m o nm o t i f l x d m l x d ( x i sr a n d o ma m i n oa c i d ) ，s u g g e s t i n gt h a ti tm a yb eaa o p pm i m i c s e q u e n c e t h es a m es c r e e n i n gw e r ea l s op e r f o r m e db ym a b3 f 2a n d4 c 5 ，a n d f o l l o w e db yi d e n t i f i c a t i o no fa n t i g e n i e i t ya n dd n as e q u e n c i n g s i xo fd e f i n e d s e q u e n c e sw e r ea n a l y s i sb yn c b ib l a s t pp r o g r a m ( h t t p ：w