食品质量与安全毕业论文—胰蛋白酶对酸奶水解度及酪蛋白磷酸肽生成量的影响26899.doc

本科毕业论文胰蛋白酶对酸奶水解度及酪蛋白磷酸肽生成量的影响 学 院：食品科学与工程学院专 业：食品质量与安全姓 名： 学 号： 指导教师： 职 称：副教授论文提交日期：二一二年六月摘 要本实验以脱脂乳粉为原料，首先采用德氏乳杆菌保加利亚亚种(l18)和嗜热链球菌(st)制备酸奶，以水解度为指标探讨胰蛋白酶水解酸奶的最佳酶解条件及在该条件下cpps的生成量，其中cpps的制备和含量的测定分别采用胰蛋白酶水解法和分光光度法。胰蛋白酶水解纯奶和酸奶的最佳酶解条件为：蛋白溶液浓度3%、ph8.0、在37，酶:底物=1.00:100，时间为3h，在该条件下纯奶的水解度为20.40%，制备cpps的量为每克蛋白质146mg，酸奶的水解度为27.55%，制备cpps的量为每克蛋白质207mg。此时n/有机p比值为8.20。关键字：酪蛋白磷酸肽；水解度；德氏乳杆菌保加利亚亚种；嗜热链球菌abstract in this study，firstly, skim milk powder was used to prepare yogurt by mixing fermentation of lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and streptococcus thermophilus.the degree hydrolysis experiments were found to discuss the optimum conditions of hydrolysis for pure milk and yogurt by trypsin as well as it had effect on the production of cpps under optimum conditions. cpps were prepared by the methods of calcium-ethanol precipitation and the contents were determined by spectrophotometry. the hydrolysis experiments demonstrated the best conditions for hydrolysis of pure milk and yogurt by trypsin. the conditions inculded the ratio of enzyme to substrate which was 1:100, the reaction time which was 3 hours, and the hydrolysis reaction which occurred at 37 and ph 8.0. under this conditions the degree of hydrolysis respectively in pure milk and yogurt were 20.40%, 27.55%, and the yield of cpps were 146mg/g, 207mg/g. key words: casein phosphopeptides;lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus;streptococcus thermophilus;the degree of hydrolysis目 录 1 引言11.1 酸奶11.1.1 酸奶的定义11.1.2 酸奶的营养价值11.1.3 酸奶的保健功能21.2 乳源生物活性肽21.3 酸奶中的cpps31.4 研究意义和主要内容32 材料与方法42.1试验材料、主要试剂和仪器42.1.1 试验原料42.1.2 试验菌种42.1.3 培养基42.1.4 主要化学试剂42.1.5 试验仪器42.2 试验方法42.2.1 菌种活化42.2.2 发酵剂的制备42.2.3 酸奶的发酵工艺52.2.4 胰蛋白酶水解样品制备cpps52.3 磷（p）含量的测定52.3.1 无机磷含量的测定52.3.2 总磷含量的测定52.3.3 p的标准曲线的绘制52.3.4 有机磷的计算62.3.5 r（np）的计算63 结果与分析63.1 时间对酸奶和纯牛奶水解度的影响63.2 酶:底物对水解度的影响73.2.1 酶:底物对纯奶水解度的影响73.2.2 酶:底物对酸奶水解度的影响83.3 p含量的标准曲线93.4 酸奶和纯牛奶来源的cpp的氮磷比104 结论10致谢11参考文献.12作者简介1313学士学位论文1 引言1.1 酸奶1.1.1 酸奶的定义酸奶是指原料乳在特定的微生物的作用下，通过乳酸菌发酵或由乳酸菌、酵母菌的共同发酵制成的酸性乳制品。在保质期内，该类产品中的特征菌必须大量存活，并能继续存活，并且必须保持微生物的活性，不得含有任何致病菌。从某种意义上讲，乳的发酵是乳成分的预消化，如乳糖、蛋白质和脂肪的降解，同时可溶性钙和磷的含量提高，并合成一些b族维生素，因此，与普通乳相比，其营养价值提高1。国际乳业联盟(idf)专家组在1967年年会上对发酵乳作出如下定义：所谓发酵乳是指以(全脂乳、部分脱脂乳、完全脱脂乳、浓缩乳、部分脱脂乳粉或全脂脱脂乳粉还原乳)经均质(或不均质)，杀菌(或灭菌)后，加特定的微生物发酵剂制成的一类产品2。1.1.2 酸奶的营养价值1.1.2.1 酸奶中的碳水化合物容易消化牛乳中的碳水化合物主要是乳糖， 约占4.5% ， 制成酸奶后大约有30%的乳糖变为乳酸和其它有机酸如苯甲酸、柠檬酸、醋酸等。生成的酸味物质有以下功能：提高了乳的保存性；增加乳的滋味；能抑制碱性细菌的生长和繁殖；促进胃肠蠕动，刺激胃和胰腺分泌胃液和胰液；提高人体的消化功能；大大提高机体对ca 、p 、fe 的吸收利用率。此外，乳糖中的部分分解成葡萄糖和半乳糖， 除了供给能源外， 半乳糖也可参与脑苷脂和神经物质的合成， 有助于婴幼儿脑和神经系统的发育。1.1.2.2 酸奶中的蛋白质易于吸收在发酵的过程中，乳酸菌发酵产生蛋白质水解酶，使原料乳中部分蛋白质水解，从而使酸奶中含有比原料乳更多的肽和比例更合理的人体所需的必需氨基酸，从而使酸奶中的蛋白质更易被机体所利用，其中酸奶中游离氨基酸的浓度约比牛奶增加4倍。另外，发酵产生的乳酸使乳蛋白质形成微细的凝块，使酸奶中的蛋白质比牛乳中的蛋白质在肠道中释放速度更慢、更稳定，这样就使蛋白质分解酶在肠道中充分发挥作用，使蛋白质更易被人体消化吸收。1.1.2.3 胆固醇与脂肪的代谢优于牛乳酸奶中的脂肪含量约含3%， 其脂肪球小，易于消化；低级脂肪酸含量较高，容易代谢；必须脂肪酸含量较多；其中乳脂中的磷脂能促进脂肪乳化，调节胆固醇浓度。另外，酸奶中乳酸菌脂酶能作用于脂类物质，不仅产生了少量的游离脂肪酸，而且其脂肪的构造也发生了变化， 易于消化吸收。1.1.2.4 维生素和矿物质含量丰富发酵后，酸奶中含有丰富的可溶性维生素（b族维生素，其中包括维生素b1、b2、b6）和少量的脂溶性维生素。乳酸还可以与乳中的ca、p和fe等矿物质形成易溶于水的乳酸盐，大大提高了ca、p和fe等矿物元素的吸收利用率。酸奶可补充人体缺少的多种维生素和矿物元素。1.1.3 酸奶的保健功能作为世界公认的保健食品，酸奶对人体有多方面的保健功能。酸奶的保健功效源于大量乳酸菌和它的代谢产物，以及发酵过程中产生的活性物质。其营养保健功效主要表现在以下几个方面：(1)缓解“乳糖不耐受症”。 (2) 调节人体肠道中的微生物菌群平衡，抑制肠道有害菌的生长。 (3) 降低胆固醇水平。 (4) 合成某些抗菌素，提高人体的抗病能力。 (5) 预防白内障。研究表明，酸奶可以预防白内障。(6) 能起到美容、明目、固齿和健发的作用。 因此可以说酸奶是仅次于母乳的营养食品。1.2 乳源生物活性肽乳源生物活性肽是指与乳中某些蛋白质肽链的某些片段相同或相似，在乳中固有或在乳蛋白降解过程中产生的具有生物活性的肽类。牛乳中含有大量的蛋白质，具有丰富全价的营养成分，被称为“白色血液”，其中蛋白质含量约为3.3%3.5%，其中大约80%为酪蛋白 (26g/l)，其余的20%为乳清蛋白(6g/l)，是生物活性肽的重要来源3。mellander（1947）4等人从酪蛋白中首次获得了酪蛋白磷酸肽，1979年，brantl等从喂食牛乳酪蛋白的豚鼠回肠中发现具有阿片样活性的短肽-酪啡肽-7(-casomorphin-7)5，这些发现使得外源活性肽的研究备受关注，并且渐渐成为乳品行业的关注热点。已有越来越多的研究表明乳蛋白质经酶水解会产生多种对人体有生理调节功能的活性成分。迄今为止，通过不同蛋白酶水解牛乳蛋白质得到的生物活性肽及其生理功能见表1。表1 来自牛乳蛋白质的生物活性肽及其生理功能6，7生物活性肽蛋白前体生理功能抗微生物肽乳铁蛋白、酪蛋白抗微生物生长抗血管紧张肽酪蛋白具有ace抑制活性、防治高血压抗血栓形成肽 酪蛋白抑制血小板聚集酪蛋白磷酸肽酪蛋白促进钙的吸收和利用免疫活性肽酪蛋白激活免疫系统鸦片肽酪蛋白类吗啡性质在这其中研究最多的是酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides)，简称cpps，cpps主要通过蛋白酶水解牛乳酪蛋白而得到的，cpps的核心部位是成串的磷酸丝氨酸和谷氨酸簇，其基本结构为：-serp-serp-serp-glu-glu-8，近年来发展起微生物发酵法制备cpps，即直接利用微生物发酵过程产生的蛋白酶(复合)降解蛋白质，可使蛋白质的水解度提高，从而相对地降低酶法生产活性肽的成本。国外用微生物蛋白酶对植物蛋白和动物蛋白进行试验研究，发现微生物蛋白酶大多具有溶解性好、活力高、专一性强，来源充足和使用方便等显著优点，因此利用微生物蛋白酶是该研究领域及今后研发的主要方向。1.3 酸奶中的cpps 近几年来国外学者发现天然发酵乳制品中有cpps的存在，主要由发酵乳制品（发酵乳和干酪）加工过程中，由于外源发酵微生物的加入使乳蛋白降解解产生一些生物活性肽，包括cpps，这些肽的存在会促进发酵乳制品的加工和消费。国外有报道发酵乳品中存在由乳酸菌的发酵作用而产生的多肽类物质9kawahara等(2005)对酸奶和纯牛奶用胰蛋白酶处理后得出cpp的量分别为171mg/g，146mg/g，可以看出酸奶中cpp的量明显高于纯奶中10。1.4 研究意义和主要内容 随着人们生活水平的提高，人们不光关注酸奶的营养价值，更加关注酸奶中的活性成分及其保健功能。为进一步明确酸奶和纯牛奶对胰蛋白酶的敏感性及在肠道中可能产生的cpps水平，本文主要探讨胰蛋白酶对酸奶和纯牛奶cpps产量的影响，其次用胰蛋白酶水解酸奶和纯牛奶，以水解度为指标，比较两者cpps的生成量。2 材料与方法2.1.1 试验原料脱脂乳粉：新西兰进口。市售cpps：明治制果2.1.2 试验菌种德氏乳杆菌保加利亚亚种（l18）：内蒙古农业大学微生物实验室提供嗜热链球菌（st）：内蒙古农业大学微生物实验室提供2.1.3 培养基2.1.3.1 乳酸菌保存培养基脱脂乳培养基：将脱脂乳粉按照12%比例复原为脱脂乳，再经过115，10min灭菌制得2.1.4 主要化学试剂 无水乙醇，氢氧化钠，盐酸，三氯乙酸，氯化钙，酶制剂：胰蛋白酶（1:250）美国sigma公司2.1.5 试验仪器名称 型号 产地冷冻离心机 gl-10m 湖南凯达科学仪器有限公司恒温水浴锅 jc-hh-s26 济南精诚实验仪器有限公司紫外可见分光光度计 tu-1810 北京普析通用仪器有限公司超净工作台 sw-cj-2ed 苏州安泰空气技术有限司显微镜 cx31 日本奥林巴斯恒温培养箱 dhp-9082 上海一恒科技有限公司2.2 试验方法2.2.1 菌种活化将80保藏的纯菌种解冻后，用接种环蘸取少许接种到5ml脱脂乳培养基中，43培养至凝乳，活化34代。l18革兰氏染色镜检，阳性，呈单个体长杆状。st革兰氏染色镜检，阳性，呈链球状。2.2.2 发酵剂的制备将活化好的菌种分别接种到100ml的脱脂乳中，接种量为3%，43培养至凝乳，取出后置于4冰箱中保存备用。2.2.3 酸奶的发酵工艺12%脱脂乳巴氏杀菌降温接种保温发酵冷却成熟成品检验2.2.4 胰蛋白酶水解样品制备cpps10样品中蛋白质的浓度为3%，加入适量胰蛋白酶（酶:底物=1.00:100），用3n naoh调ph为8.0，在温度为37进行水解，水解的过程要保持ph为8.0，水解过程持续3h，反应结束后用三氯乙酸灭活胰蛋白酶，后用1n hcl调ph为4.6，4000 r/min 离心30min，取上清液调ph到4.6再4000 r/min 离心30min，取上清，边搅拌边加入20 % cacl2溶液至质量浓度为1.0 %（w/v），再加入等体积的无水乙醇，冰浴30min，后4000 r/min离心30 min，收集沉淀进行透析过夜，冻干沉淀即得cpps。2.3 磷（p）含量的测定102.3.1 无机磷含量的测定将cpps配制成浓度为0.1%（wv）的溶液，吸取0.1%的cpps溶液2ml放入细颈瓶中，加入2ml浓度为70%的高氯酸，再加入2ml浓度为1%的阿米酚和1ml8.3%的钼酸铵，混匀，将其定容至25ml，室温放置20min，720nm处测定吸光度。2.3.2 总磷含量的测定将cpps配制成浓度为0.1%（w/v）的溶液，吸取0.1%的cpp溶液2ml放入细颈瓶中，加入2.2ml浓度为70%的高氯酸，加热混合物20min至无色，将其冷却后加入20l浓度30%的双氧水，加热混合物5min，使双氧水完全挥发，再加入2ml浓度为1%的阿米酚和1ml8.3%的钼酸铵，混匀，将其定容至25ml，室温放置20min，720nm处测定吸光度。2.3.3 p的标准曲线的绘制将干燥至恒重的k2hpo4配制成含p量10g/ml的标准溶液，分别吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于细颈瓶中，用蒸馏水补加至2ml，加入2.2ml浓度为70%的高氯酸，加热混合物20min至无色，将其冷却后加入20l浓度30%的双氧水，加热混合物5min，使双氧水完全挥发，再加入2ml浓度为1%的阿米酚和1ml8.3%的钼酸铵，混匀，将其定容至25ml，室温放置20min，720nm处测定吸光度。以含p量为横坐标，od720的值为纵坐标，绘制标准曲线。2.3.4 有机磷的计算有机磷量=总磷含量无机磷含量 （1）2.3.5 r（np）的计算 （2）3 结果与分析3.1 时间对酸奶和纯牛奶水解度的影响试验在蛋白溶液浓度为3.0， ph=8.0，酶:底物=0.5:100的条件下，研究时间对该酶水解度的影响，结果见表2和图1。表2 不同时间蛋白溶液的水解度时间（min）153060120180240300360酸奶纯奶5.510.503.670.109.180.406.890.5012.400.4610.111.0016.530.5015.620.5018.830.4617.550.5018.830.4618.470.4218.830.4619.430.4018.830.4619.430.40由图1可知，在0180min酸奶的水解度高于纯奶，在180min酸奶的水解度达到最大值为18.83%，此时纯奶的水解度为17.55%，纯奶的水解度在300min能达到最大值为19.43%，根据食物在人体内的滞留时间为3h左右，饮用纯奶在小肠内水解度未达到最大值时，未被水解的部分就会被排出而浪费掉，到3h时，酸奶能达到最大水解度，未被水解的蛋白质降低，与纯奶相比被人体吸收和利用的蛋白质增加。本试验要研究酸奶和纯奶进入小肠后在胰蛋白酶的作用下对cpps的影响，考虑到食物在人体的滞留时间，所以选择3h作为胰蛋白酶水解酸奶和纯奶制备cpps的最佳时间。3.2 酶:底物对水解度的影响3.2.1 酶:底物对纯奶水解度的影响试验在蛋白溶液浓度为3.00%，水解温度为37，ph=8.0的条件下，研究该酶在酶:底物=0.50:100，0.75:100，1.00:100，1.25:100，1.50:100时对纯奶蛋白溶液水解度的影响，结果见表3和图2。表3 不同酶:底物条件下纯奶的水解度时间（min）153060120180240300酶:底物=0.50:100酶:底物=0.75:100酶:底物=1.00:100酶:底物=1.25:100酶:底物=1.50:1003.670.1007.530.099.600.4110.110.2110.930.506.890.5011.660.5512.301.0013.780.5015.060.3710.111.0014.510.5615.301.0017.450.3018.960.6015.620.5017.820.7618.710.5020.210.4622.271.0517.550.5019.750.7620.400.4022.050.3524.570.7018.470.4220.670.7722.240.5022.970.4525.440.7419.430.4021.590.7622.700.2023.430.2925.440.65由表3和图2可知，纯奶的水解度随酶:底物比值的升高而增大，当酶:底物比值为1.00:100，1.25:100，1.50:100，三者在15min反应速率基本相同，在180min时三者的水解度分别为20.40%，22.05%，24.57%，可以看出三者的差距不大，考虑到节约成本的问题选择酶:底物比值为1.00:100。图 2 不同酶:底物条件下纯奶的水解度3.2.2 酶:底物对酸奶水解度的影响试验在蛋白溶液浓度为3.0%，水解温度为37，ph=8.0的条件下，研究该酶在酶:底物=0.50:100，0.75:100，1.00:100，1.25:100，1.50:100时对纯奶蛋白溶液水解度的影响，结果见表4和图3。表4 不同酶:底物条件下酸奶的水解度时间（min）153060120180240300酶:底物=0.50:100酶:底物=0.75:100酶:底物=1.00:100酶:底物=1.25:100酶:底物=1.50:1005.510.508.270.209.190.4010.110.5011.940.509.180.4011.940.5016.530.5016530.5016.530.5012.400.4616.070.4621.120.5321.000.3121.120.4316.530.5019.740.4624.790.9324.710.8124.790.9318.830.4622.040.9227.550.5028.400.5728.920.4518.830.4622.040.9227.550.5028.400.5728.920.4518.830.4622.040.9227.550.5028.400.5728.920.45图3 不同酶:底物条件下酸奶的水解度由图3可知酸奶的水解度随着酶:底物比值的增大而升高，当酶：底物比值为1.00:100，1.25:100，1.50:100，在180min内三者的差异不大，其水解度分别为27.55%， 28.40%，28.92%，考虑到酶的成本问题选择酶:底物为1.00:100作为最佳酶与底物比。 比较纯奶和酸奶反应过程可以看出，在同一酶：底物的比值条件下，酸奶的水解度要高于纯奶的水解度，其原因应该为酸奶经过了微生物的发酵过程，蛋白质由大分子变为小分子，能更好的与胰蛋白酶结合，而纯奶中的蛋白质大部分为酪蛋白，其分子量较大，与胰蛋白酶结合的位点较少，反应速率较低。由此得出胰蛋白酶水解纯奶和酸奶的工艺为酶:底物=1.00:100，反应时间为3h，在温度37，蛋白溶液浓度3%，ph=8.0的条件下。在此酶解条件下，用胰蛋白酶水解纯奶和酸奶制备cpps，得出水解后纯奶和酸奶中cpps的生成量为146mg/g、207mg/g（mg/g表示每克蛋白质被胰蛋白酶水解后生成的cpps的量）。3.3 p含量的标准曲线按2.3.3的试验方法绘制的p的标准曲线见图4，由图4的r值可以看出，此方法在一定浓度范围内浓度与吸光度值间呈正相关关系。 图 4 p的标准曲线3.4 酸奶和纯牛奶来源的cpp的氮磷比本研究用胰蛋白酶水解酸奶制备的cpps（1）， 胰蛋白酶水解纯奶制备的cpps（2），市售的cpps作为研究对象来测定其中的n，p含量，其结果如表5。表5 各种cpps的n、p含量和n/p样品n含量（%）总p含量（%）有机p量（%）r（n/总p）r（n/有机p）116.349.254.413.918.20219.407.703.655.5811.77市售cpps10.162.230.6110.0936.88由表5可知，酸奶中直接提取的cpps其有机p的含量远远高于市售的，说明由酸奶中生成的cpps其肽链长度要低于市售的cpps肽链长度。胰蛋白酶水解酸奶制备的cpps其有机p含量要高于胰蛋白酶水解纯奶制备的cpps，原因可能是胰蛋白酶不仅直接作用于酸奶中未被l18和st利用的酪蛋白，同时也作用于l18和st发酵生成的短链cpps，形成了更多的短肽。而在纯奶中，胰蛋白酶直接作用于纯奶中的酪蛋白，其酶切位点少，生成的cpps的肽链较长。酸奶中提取的cpps有机p含量要高于胰蛋白酶水解酸奶制备的cpps，可能是由于胰蛋白酶水解的部分酪蛋白生成了长链的肽段，导致有机p含量的降低。国内研究者以r（n/p）值的高低作为评价肽段长短的指标，其制备的cpps都经过透析处理，大大降低了无机p的含量，其所测得的p大部分为有机p。由于本试验提取的cpps未进行透析及其他降低无机p含量的处理手段，所以本试验采用r（n/有机p）的值来进行评价。酸奶中提取的cpps其r（n/有机p）的比值最低，表明l18和st在发酵过程中生成的cpps的肽段最短。 4 结论 蛋白溶液浓度3%、ph8.0、在37的条件下，胰蛋白酶水解纯奶和酸奶的最佳时间为3h。 蛋白溶液浓度3%、ph8.0、在37的条件下，胰蛋白酶水解纯奶和酸奶的最佳酶与底物的比值为1:100。 胰蛋白酶水解纯奶和酸奶的最佳酶解条件为：蛋白溶液浓度3%、ph8.0、在37，酶:底物=1.00:100，时间为3h，在该条件下纯奶的水解度为20.40%，制备cpps的量为每克蛋白质146mg，酸奶的水解度为27.55%，制备cpps的量为每克蛋白质207mg。胰蛋白酶水解酸奶获得的cpps中氮与有机磷的比值为8.20。 致 谢本论文完成之际我首先要感谢我的导师。老师对科学研究工作的执着追求，对学科敏锐的洞察力以及高度的把握度，严谨的科学研究态度，渊博的学识，敬业的精神和平易近人的待人态度，给我留下了终身难忘的印象，对我今后的的发展有着深远的影响，是我今后学习的榜样。在此，谨向老师致以我最崇高的敬意和诚挚的感谢!最后，谨以本文献给我的父母，我的成长凝聚了父母太多的付出和心血!谢谢你们从小到大对我的支持和爱护，他们的爱是我成长、生活的勇气，谢谢你们!再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心地感谢！参 考 文 献1 顾瑞霞.乳与乳制品的生理功能特