高产木聚糖酶菌株的选育 毕业论文.doc

毕毕 业业 设设 计（论计（论 文）文） 题题 目目 高产木聚糖酶菌株的选育高产木聚糖酶菌株的选育 姓姓 名名 学学 号号 0910511238 所在学院所在学院 轻工学部 专业班级专业班级 2009 级生物工程 2 班 指导教师指导教师 日日 期期 2013 年 6 月 6 日 i 摘 要 本课题以自制木聚糖样品为唯一碳源，透明圈平板筛选法初筛，摇瓶发酵复筛，从 土壤中筛选出五株产木聚糖酶的菌株，其中株菌 q2 酶活最高，其酶活为 5.858iu/ml。以 q2 菌株为出发菌株，酶活力为评价指标，采用单因素的方法对培养条件进行优化，得出 最优培养条件为：温度 37，接种量为 6%，种龄 16h，初始 ph 值 8.0。然后以 q2 菌株 为出发菌株，进行紫外诱变，透明圈平板筛选法初筛，摇瓶发酵复筛，获得突变株 t3， 酶活达 7.54iu/ml，较出发菌株 q2 提高了 1.32 倍。经遗传稳定性试验，该性状具有一定 的遗传稳定性。 关键词关键词：菌种筛选，木聚糖酶，酶活力，紫外诱变 ii abstract the topics to sample homemade xylan as sole carbon source, transparent circle plate screening screening, rescreening fermentation, screened from soil xylanase five strains, including strains q2 highest activity, its enzymatic activity for the 5.858iu/ml. q2 strain was starting to strain, activity indicators for the evaluation, the use of single-factor approach to culture conditions were optimized, and the optimal culture conditions: temperature 37 , inoculation of 6%, seed age 16h, initial ph 8.0 . then q2 strain as the starting strain by uv mutagenesis, transparent circle plate screening screening, rescreening fermentation obtained mutant t3, activity reached 7.54iu/ml, compared with the starting strain q2 increased 1.32 times. warp genetic stability test, the trait has a certain genetic stability. keywords: strain selection, the xylanase enzyme , enzyme activity, iuv miutagenesis iii 目录目录 摘 要i abstractii 1 前言.1 1.1 木聚糖及木聚糖酶的简介1 1.1.1 木聚糖的结构及其木聚糖酶的分类1 1.1.2 木聚糖酶的分子结构1 1.1.3 木聚糖酶的理化性质1 1.1.4 木聚糖酶的催化机制2 1.2 木聚糖酶的产生与测定方法2 1.2.1 产木聚糖酶的菌株2 1.2.2 产木聚糖酶菌株的筛选方法2 1.2.3 木聚糖酶酶活的测定方法3 1.2.4 木聚糖酶的生产及其影响因素3 1.3 木聚糖酶的应用4 1.3.1 木聚糖酶在造纸工业中的应用4 1.3.2 木聚糖酶在酿造、饲料工业中的应用4 1.3.3 木聚糖酶在食品工业中的应用5 1.4 本课题的研究意义及主要研究内容5 1.5 课题的主要研究内容与目录5 1.5.1 研究内容5 1.5.2 研究目标5 2 材料与方法.7 2.1 实验材料7 2.1.1 分离样品7 2.1.2 试剂配制7 2.1.3 培养基7 2.2 主要仪器及设备8 iv 2.3 主要试剂8 2.4 实验方法9 2.4.1 木聚糖的制备9 2.4.2 木聚糖酶活测定9 2.5 实验步骤10 2.5.1 菌种的分离筛选10 2.5.2 生长曲线的绘制11 2.5.3 致死曲线的绘制11 2.5.4 紫外诱变后初筛11 2.5.5 诱变后摇瓶复筛12 2.5.6 遗传稳定性试验12 3 结果与分析.13 3.1 菌株分离筛选结果13 3.1.1 初筛结果13 3.1.2 摇瓶复筛结果13 3.2 菌株 q2 生长曲线的绘制.14 3.3 菌株 q2 最佳培养条件的优化.15 3.3.1 接种量对菌株 q2 产酶的影响 .15 3.3.2 初始 ph 对菌株 q2 产酶的影响 16 3.3.3 温度对菌株 q2 产酶的影响 .16 3.4 致死曲线的绘制17 3.5 诱变后初筛结果18 3.6 诱变后复筛结果19 3.7 遗传稳定性结果19 3.5 结论19 4 致谢.21 5 参考文献.22 1 1 前言 1.1 木木聚糖及木聚糖酶的简介 1.1.1 木聚糖的结构及其木聚糖酶的分类 木聚糖是属于植物半纤维素的一种，是自然界中丰富的多糖之一，也是自然界中丰 富的可再生资源。木聚糖是由 d-木糖主链（以 -1,4 键相连）和 l阿拉伯糖分枝（-1,2 和 -1,3 相连）所组成的聚合物，由于它是由阿拉伯糖和木糖两种单糖聚合而成，因此也 称阿拉伯木聚糖或戊聚糖1。木聚糖酶属于水解酶的一类，是一种可以将木聚糖降解成低 聚木糖或木糖的复合酶系，包括内切木聚糖酶、外切木聚糖酶和木糖苷酶三种2。木聚糖 酶是具有四级结构的大分子活性蛋白。木聚糖降解酶系包括内切 -1, 4-d-木聚糖酶，-d- 木糖苷酶，-l-呋喃阿拉伯糖苷酶，-d-葡萄糖醛酸苷酶，乙酰木聚糖酯酶3等等酶种 类。木聚糖酶种类繁多，研究者根据木聚糖酶不同的特性可对木聚糖酶进行不同的归 类，最常用的分类方式是 henrissat3 和 bairoch4根据糖苷水解酶及其相关酶具有催化结 构的氨基酸序列的相似性将糖苷水解酶家族进行不同的划分。 木聚糖酶被称为内切 -1, 4-d-木聚糖酶，功能是降解木聚糖的主链骨架，成为木聚 糖降解酶系中最主要的酶。 1.1.2 酶的分子结构 有的木聚糖酶只含有单一结构域，即催化结构域，也有的木聚糖酶同时具备催化结 构域和非催化结构域。多结构域木聚糖酶分子结构中含有催化结构域、纤维素结合结构 域、木聚糖结合结构域、热稳定结构域及其它未知功能的非催化结构域等等等，这些区 域担负着不同的生理功能5。所以，由不同微生物产生的结构和性质上有很大的差别。 1.1.3 酶的理化性质 酶的分子量范围一般为 8145kd，等电点一般在 310 之间，ph 值在 310 内稳定， 2 反应的最适 ph 值范围为 47。产生木聚糖酶的细菌和真菌的最佳温度范围是 4060， 一般细菌木聚糖酶的耐热性要高于真菌木聚糖酶。酶的物理化学性质可以将酶分为两大 类，包括酸性蛋白和碱性蛋白。分子量低于 30kd 的蛋白酶是碱性的，称为碱性蛋白，而 分子量大于 30kd 的蛋白叫做酸性蛋白。细菌一般会产生 2 种木聚糖酶，分子量低于 30kd 的碱性蛋白酶和分子量大于 30kd 的酸性木聚糖酶，但是真菌通常只产生碱性木聚 糖酶，所以，在研究真菌的方面还是有所局限。 1.1.4 木聚糖酶的催化机制 多数研究表明，木聚糖酶的催化机制是由羧基参与酸碱催化反应。首先由活性位点 的谷氨酸的羧基提供 1 个质子给 -1，4-糖苷键，致使糖苷键断裂，然后由带负电的天冬 氨酸、谷氨酸或组氨酸稳定住过渡态碳，再由 h2o 分子提供 oh-给木糖的 c-1，使糖残基 还原提供 h+给谷氨酸的羧基，使酶复原6。根据木聚糖酶与底物作用时是否可释放出阿 拉伯糖，将其分为脱支链酶和非脱支链酶，这中划分取决于木聚糖酶除了裂解主链连接 键外是否可除去阿拉伯糖侧链取代基。 1.2 酶的产生与测定方法 1.2.1 产酶的菌株 在产生木聚糖酶的种属中，微生物的分布很普遍，细菌，放线菌，丝状真菌和一些 酵母7都可以产生木聚糖酶。在最近的研究中，国内在棒曲霉，黑曲霉和里氏木霉等菌种 中找到能够产生木聚糖酶，但是产生的酶的抗热性较差。现在，我国也克隆了许多木聚 糖酶分子的基因，并不同程度上在大肠杆菌中表达。随着世界基因工程的发展，获得活 力好、高稳定性，适合于在工业生产中大规模生产木聚糖酶成为了一种可能的方法。 1.2.2 关于关于筛选酶菌株的方法 关于筛选酶菌株的方法主要有以下几种： (1)rbb-xylan 法8 3 将菌株点种在含有深蓝色 rbb-xylan 的选择平板上，含有木聚糖酶基因的菌株可分 解深蓝色的底物，从而出现比较大的透明圈。 (2)木聚糖底物法 以纯木聚糖为底物，如果出现透明圈菌株，那就是产生木聚糖酶的菌株，此法就是 木聚糖底物法，而且比较简单。 (3)刚果红法 以木聚糖底物法为基准，染色 30min，染料为 0.1%刚果红，然后再用 1mol/lnacl 脱 色 20min，产木聚糖的菌株周围会出现以红色为背景的透明圈，再用 1mol/l 的 hcl 处理， 背景颜色将会染成深蓝色，使透明圈更容易看见。此法的原理是 -1, 4-糖苷键的纤维素底 物可以与刚果红紧密结合形成红色物质，在水解糖苷键后，nacl 溶液可以脱去红色物质。 1.2.3 酶活的测定方法 进行酶的应用、研究的基础是酶活力测定。在国内测定木聚糖酶酶活力的测定方法 有很多，一般比较常用的是 rbb-xylan 法、dns 法9和 somogyi-nelson 法10，rbb- xylan 法测定酶活是通过从 rbb-xylan 中释放出的碎片来测定的，此法还可应用于筛选 产木聚糖酶的微生物，判断可以直接通过观察筛选平板上是否出现明显的透明圈；而后 两种方法原理是测定释放出的还原糖量在酶反应后，然后从标准曲线上计算出酶活大小。 其中 ，dns 法是最常见的方法，此法原理是以酶水解底物木聚糖，产生木糖，用 dns 试剂作终止剂终止还原反应，作为显色剂显示木糖，并在 540nm 处用分光光度计测定 od 值，然后以标准木糖溶液绘制木糖标准曲线，由标准曲线查出此条件下所测得的 od 光值 对应的木糖生成量，就可以可计算出木聚糖酶活力。 1.2.4 木聚糖酶的生产及其影响因素 当前，产木聚糖酶的微生物大多分布在真菌和细菌等微生物的发酵上，而其在产生 木聚糖酶的主要因素是合适诱导底物的选择、最适培养基组成和最优培养条件的控制等 方面。曲霉属和木霉属等微生物从而有选择性产生木聚糖酶已经取得了成功，其中唯一 4 碳源是木聚糖10，而在以纤维素为碳源时，这些菌株会在产生纤维素酶的同时也产生木 聚糖酶。产木聚糖酶的真菌活性通常要高于产木聚糖酶的细菌。放线菌和细菌的最适生 长条件和产酶环境接近于中性，真菌却需要比较酸性的环境，耐碱性杆菌的最适生长环 境和产酶 ph 值在 910。木糖在很多地方既起到碳源作用又会对木聚糖酶的形成产生抑 制，通常诱导物分子的缓慢释放被认为可以提高木聚糖酶的活性。此外影响木聚糖酶产 生菌的还有代谢酶，包括蛋白酶和糖苷转移酶类，影响产生木聚糖酶的过程参数还包括 ph、温度和通风等。 1.3 木聚糖酶的应用 随着研究的不断深入，木聚糖酶在造纸工业、酿造、饲料、及食品工业等行业都有 广泛的应用。 1.3.1 木聚糖酶在造纸工业中的应用 在生物技术的应用方面，纸浆漂白已经得到造纸界的普遍关注。在国内外，在漂白 的机理和作用中研究较多的是木聚糖酶11。与化学方法脱墨相比，酶法脱墨后的纸浆具 有高白度、高自由度和低残留墨等优点。木聚糖酶和纤维素酶是酶法脱墨中研究最多的 酶。酶法脱墨可以应用于回收的废纸，此法可以减缓化学方法带来的环境污染，酶法脱 墨是一种安全、环保和经济有效的方法，已经广泛应用于工业生产中。 1.3.2 木聚糖酶在酿造、饲料工业中的应用 在酒酿造过程中，木聚糖酶主要是破坏原料细胞的结构，加速淀粉，蛋白质等成分 的释放及其它酶的作用，提高了发酵酒精的产率。 动物饲料中半纤维素对于非反当类动物来说几乎没有营养价值，因为这类动物缺乏 合适的降解酶类。然而，这些未消化的半纤维素会在动物肠道中增加食物的粘度，从而 影响消化酶透性，不利于半纤维素降解，影响食物的消化和吸收。如果在动物饲料加入 木聚糖酶，就可以降解这类物质，有利于可利用多糖的降解，从而增加动物饲料的利用 率12。 5 1.3.3 木聚糖酶在食品工业中的应用 在食品工业中，木聚糖酶在小麦面粉的改良方面起着主要的应用。在小麦面粉中， 戊聚糖是主要非淀粉多糖13。添加适量的戊聚糖酶，木聚糖酶在加工面包过程中不仅可 以消除发酵过度的危害，而且还可以提高面团的加工机械性能，增大体积，改善面包芯 质地以及延缓老化等，目前已成为食品工业上研究开发的热点。 1.4 本课题的研究意义及主要研究内容 当前，木聚糖酶的生产已成为国内外关注和研究的焦点。在国内，其中关于产生木 聚糖酶的菌株的研究和报道较普遍，而在研究的对象上面，真菌的关注占主要位置，而 细菌类研究和报道比较少。细菌类与真菌类所产木聚糖酶相比而言，产酶细菌有很多优 点：具有更好的热稳定性和酶解效率；细菌产酶一般偏碱性，这更有利于应用漂白行业。 作为新一代酶制剂，细菌木聚糖酶将得到更为广泛的应用，所以对细菌性木聚糖酶进行 理论和应用方面的研究是很有意义的14。 本研究通过从土壤中筛选产木聚糖酶的菌株、培养条件的优化及紫外诱变选育，希 望能得到产酶量高的菌株。 1.5 课题的主要研究内容与目录 1.5.1 研究内容 1、产碱性木聚糖酶菌株的筛选，从土壤中分离，通过初筛，复筛，最后筛选产碱性 木聚糖酶的菌株， ，从发酵条件的优化方面研究产酶菌株的最佳产酶条件。 2、菌株的紫外诱变提高产酶量，对所筛菌株进行紫外诱变，看能否提高产酶量并且 保持遗传稳定性。 1.5.2 研究目标 1、从土壤中分离到几株产碱性木聚糖酶的菌株，通过产酶培养条件的优化，提高菌 6 株的产酶水平。 2、掌握目标菌株的诱变条件及过程，检测酶活提高的倍数。 7 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 分离样品 采集武汉江夏地区的土壤 2.1.2 试剂配制 1、配制 dns 试剂 称取 3,5二硝基水杨酸 10g 溶于水中，待全部的水杨酸溶解后，加入 20gnaoh、200g 酒石酸钾钠，然后加入蒸馏水溶解，使总体积至 500ml 左右，通过电 炉加热溶解，溶解完后，加 2g 苯酚、0.5gna2so3，电炉加热并伴随搅拌至完全溶解， 冷却，用蒸馏水稀释定容至 1000ml，在棕色瓶中储存，放 1 周后使用。 2、 缓冲溶液 100ml、ph 5.4 的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液：6.4ml、0.1mol/l 的柠檬酸溶液与 13.6ml、0.1mol/l 的柠檬酸钠溶液混合，100ml 容量瓶定容。 2.1.3 培养基 1、筛选培养基(1%) 自制木聚糖 1，硝酸钾 0.1，硫酸镁 0.05，氯化钠 0.05，磷酸氢二钾 0.05，琼脂 2，ph 8.0，121灭菌 20min。 2、 细菌斜面培养基(1%) 蛋白胨 1.0，酵母膏 0.5，氯化钠 0.5，琼脂 2.0，ph 8.0，121灭菌 20min。 3、种子培养基(1%) 自制木聚糖 1.0，蛋白胨 1.0，硫酸镁 0.05，氯化钠 0.4，磷酸氢二钾 0.05，ph 8.0 4、发酵培养基(1%) 8 玉米芯粉 1.0，酵母膏 1.0，硫酸镁 0.1，磷酸氢二钾 0.05，磷酸氢二钠 0.05，ph 8.0，121灭菌 20min。 2.2 主要仪器及设备 仪器名称生产厂家 dg/20-002台式干燥箱重庆实验仪器设备厂 sw-cj-1d 型单人净化工作台苏州净化设备有限公司 zhwy 双城恒温培养摇床上海智城分析仪器制造有限公司 台式离心机 tgc-16c上海安亭科学仪器制造 dnp-9052型电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司 dgb/20-002a 电热干燥箱重庆银河试验仪器有限公司 立式压力蒸汽灭菌器上海博讯试验有限公司医疗设备厂 tg11-高速离心机 上海平凡仪器仪表有限公司 分光光度计上海崇明仪器厂 雷磁 phs-25酸度计上海右一仪器有限公司 2.3 主要试剂 药品纯度生产厂家 玉米芯粉ar新华扬有限公司 燕麦木聚糖ar美国 sigma 公司 硝酸钾ar国药集团化学试剂有限公司 氢氧化钠ar国药集团化学试剂有限公司 酵母浸膏ar北京双弦微生物培养基制品厂 牛肉膏br北京双弦微生物培养基制品厂 蛋白胨ar北京双弦微生物培养基制品厂 磷酸二氢钾ar国药集团化学试剂有限公司 浓硫酸ar国药集团化学试剂有限公司 硫酸镁ar国药集团化学试剂有限公司 磷酸氢二钾ar国药集团化学试剂有限公司 磷酸氢二钠ar国药集团化学试剂有限公司 氯化钠ar上海化学试剂有限公司 氯化铵ar中国医药(集团)上海化学试剂公司 琼脂粉ar武汉市华顺生物科技有限公司 柠檬酸ar上海化学试剂有限公司 柠檬酸钠ar国药集团化学试剂有限公司 苯酚ar国药集团化学试剂有限公司 9 水杨酸ar国药集团化学试剂有限公司 2.4 实验方法 2.4.1 木聚糖的制备 1、工艺流程16 原料粉碎除淀粉(-淀粉酶、糖化酶)灭酶除蛋白(中性蛋白酶)灭酶过滤 碱提 (naoh)超滤醇沉离心收集沉淀 2、提取步骤 将粉碎过 40 目筛的玉米芯水洗沥干后，加 0.3的中温 -淀粉酶及糖化酶，在 ph 值 65 左右、65保温 30 min，之后煮沸 10 min 灭酶；加 0.3中性蛋白酶，调 ph 值 7.0 左右、40 保温 30 min，之后煮沸 10 min 灭酶；用纱布过滤并反复冲洗玉米芯 粉，烘干备用。 取一定量原料按料液比(g：ml)1：5 加入 0.1%的 h2so4，85蒸煮半个小时，除淀 粉、蛋白，然后加入 10%浓度的 naoh，调整液体与固体的比例为 10:1，在 80的温度 下浸提 2h，过滤，取上清液，并用盐酸调至 ph 值为 6.5 左右，再加入两倍体积的 95%乙 醇，8000 r/min 离心 20min，离心得到沉淀是粗木聚糖并用无水乙醇洗涤，在离心得到沉 淀，最后冷冻干燥得木聚糖。 2.4.2 木聚糖酶活测定 本课题采用 dns 法测定酶活力，此法是测定体系中还原产生的还原糖量，以分析纯 木糖为对象作木糖标准曲线，测定 od 值根据标准曲线计算木聚糖酶活性。 (1) 木糖标准曲线的绘制 表 2.1 木糖标准曲线绘制含量 管号123456 1g/ml 木糖溶液(ml)00.20.40.60.81.0 蒸馏水(ml)2.01.81.61.41.21.0 dns 试剂(ml)333333 10 取干净的 25ml 的比色管，分别加入木糖标准溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml， 用蒸馏水补足至 2ml 后加入 dns3.0ml，沸水浴反应 10 分钟，取出冷却，加蒸馏水定 容至 25ml，于分光光度计下测定光密度值(od540)，以 od540为横坐标，木糖含量(mol) 为纵坐标绘制标准曲线，结果见图 3.1。 (2)木聚糖酶活力测定及定义17 1%木聚糖溶液：将 1.0g 木聚糖加热溶解于 ph5.4 的柠檬酸酸缓冲溶液中定容至 100ml，置于 4冰箱中保存备用。 发酵液经 8000 r/min 离心 20min 后取上清，即为粗酶液。将粗酶液稀释 10 倍(取 0.5ml 的上清液，加入 4.5ml 的蒸馏水)后，0.5ml 酶液加入比色管中，再加入 1.5ml 1% 的木聚糖溶液，在 50环境中，准确反应 10min，加入 3.0ml dns 终止反应，煮沸 10min 显色，然后迅速冷却至常温，定容至 15ml，对照为蒸馏水，540nm 处测定 od 值， 由木糖标准曲线计算还原糖的量。 酶活单位定义：上述条件下，每分钟释放 1mol 还原糖(以木糖计)所需要的酶量定义 为一个酶活力单位(iu)。 酶活单位计算：酶活力=(sd1000)/tv150 s-测得光吸收在标准曲线上对应的木糖量(mg) d-稀释倍数(10 倍) 2.5 实验步骤 2.5.1 菌种的分离筛选 (1)菌株筛选流程 平板筛选培养基土样富集后稀释涂布无透明圈(放弃)有透明圈挑选菌落划线 分离，37培养测透明圈与菌落直径之比记录菌落形态、颜色各种斜面培养基挑 选单菌落接斜面发酵培养基测酶活(参照步骤 2.4.2)挑选产酶活力高的菌株 (2)平板初筛 将土样梯度稀释至适当浓度，取 0.1ml 稀释液涂布于筛选平板，37倒置培养 35d，观察、挑取产生透明圈大且清晰的菌株。 11 (3)摇瓶复筛（测酶活参照 2.4.2） 将 5 株菌株分别接入种子培养基，培养至 16h 左右后接入发酵培养基，每组 2 个平 行，37,180r/min 进行摇瓶复筛，每组酶活如表 3.1 所示，发现菌株 q2 产酶水平较高且 稳定，故选择该菌株进行进一步的研究。 2.5.2 生长曲线的绘制 从平板上取菌种接入 50ml 种子培养基 /250ml 三角瓶中，37，180r/min 培养，从 0h 开始到 24h 之间，每隔 2h 于离心管中，其中一份离心后取上清液作为空白对照，另一 份不离心，在 600nm 波长下测定 od 值，以培养时间（h）为横坐标，od 值为纵坐标做 生长曲线（图 3.3） 。得出培养 16 小时对数生长期结束为最佳接种时间。 2.5.3 致死曲线的绘制 在灭菌的小平皿中装 4mlq2 菌悬液，稀释一倍，用紫外灯 15w 照射，照射时间分别 为 10s，20s，30，40s，50，60s，70s，照射后的菌液于红灯下，综合考虑实验的工作量、 操作的方便性和诱变的概率，以下实验的稀释度可选择 10-4、10-5、10-6。在诱变之前先稀 释到 10-1，制成菌悬液，分别取 0.10ml 紫外线诱变处理的悬液分别涂布于平板培养基上， 平板培养基做三个平行，37避光培养 45 天。在初筛培养基上计数存活菌落，计算存 活率；并观察并测量菌落直径及周围透明圈的大小，致死曲线见图 3.7。 2.5.4 紫外诱变后初筛 根据致死曲线的绘制，其中菌株致死率为 80%左右的时间 30s，将 30s 作为最终诱变 时间，用紫外灯 15w 进行紫外诱变处理。诱变处理后，取 0.1ml 菌液在分离培养基上涂 布培养，培养至产生明显透明圈时，观察透明圈并挑选出透明圈与菌落直径比(d/d)较大 的菌落，作为平板筛选的优良菌株。 2.5.5 诱变后摇瓶复筛 把初筛所选六株菌株接种至 50ml 发酵培养基中(250ml 三角瓶中)，37，180r/min 12 培养 72h，测木聚糖酶酶活力，选出木聚糖酶酶活较高的菌株作为复筛的优良菌株。 2.5.6 遗传稳定性试验 将诱变菌株 t1，t2，t3，t4，t5，t6 中酶活最高的菌株 t3 连续转接五代，摇瓶发 酵测定酶活力，判断其酶活稳定性。 13 3 结果与分析 3.1 菌株分离筛选结果菌株分离筛选结果 3.1.1 初筛结果 将土样梯度稀释至适当浓度，取 0.1ml 稀释液涂布于筛选平板，37倒置培养 35d，然后，挑取透明圈与菌落直径之比较大的菌株进行点样法，同样条件培养，结果 如下图 3.1。 图 3.1 初筛平板 3.1.2 摇瓶复筛结果 平板初筛后，挑取透明圈与菌落直径之比较大的 5 株菌株，分别命名为 q1，q2，q3，q4，q5，将五株菌株进行摇瓶发酵复筛，37,180r/min 发酵 72h，离心 取上清液，通过 dns 法测定菌株产木聚糖酶的酶活。其中，通过木糖标准曲线换算成酶 活，木糖标准曲线如下图 3.2： 14 图 3.2 木糖标准曲线 知公式为 y=1.003x-0.0227，其中 y 为 od 值，计算出 x 带入酶活公式 s,计算出酶活。 酶活单位计算：酶活力=(sd1000)/tv150 s-测得光吸收在标准曲线上对应的木糖量(mg) d-稀释倍数(10 倍) t-反应时间(10min) v-取酶体积(0.5ml) 表 3.1. 诱变前菌株酶活 菌株q1q2q3q4q5 0.9135.8582.9070.5810.594酶活(iu/ml) 0.9665.5663.040.6470.634 如上表 3.1 所示，筛选菌株 q2 酶活相对较大，作为以下单因素控制与诱变处理的菌 株。 3.2 菌株 q2 生长曲线的绘制 测定微生物生长量最常用的方法有测体积、称干重和比浊法等，本文主要采用称干 重法测定菌体生物量。将菌株接种到种子液培养基中，37、180 r/min 振荡培养，每隔 2h 取样一次测 od 值，绘制菌株 q2 的生长曲线。 15 图 3.3 q2 生长曲线 图 3.3 表明：以培养 16h 的种子接种时，菌株发酵产酶效果最好。可能是由于这时菌 株 q2 正处于对数生长期，酶系活跃，代谢旺盛，使延滞期缩短，利于产酶。 3.3 菌株 q2 最佳培养条件的优化 本实验中，以 q2 菌株为出发菌株，酶活为评价指标，采用单因素的方法对培养条件 进行优化，实验结果如下。 3.3.1 接种量对菌株 q2 产酶的影响 本课题研究了最适接种量，将种子培养基培养 16h 后，分别以 2%、4%、6%、8%、10%的接种量接种至发酵培养基培养，测定发酵液产酶的酶活力， 结果见图 3.4。 16 图 3.4 接种量对产酶量的影响 图 3.4 可知，接种量为 6%时，菌株 q2 的产酶量最高，酶活是 4.924iu/ml，随着接种 量的增加酶活力呈下降趋势，因为接种量增加，菌株的密度增大，培养基的营养成分可 能供给菌生长和繁殖，而影响了产酶结果。 3.3.2 初始 ph 对菌株 q2 产酶的影响 发酵培养基初始 ph 对菌体的生长和酶的合成都有比较重要的影响，本研究中，将发 酵培养基的初始 ph 调至 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其它条件不变，研究发酵初始 ph 对菌株 q2 发酵产酶的影响，结果见图 3.5。 图 3.5 ph 值对产酶量的影响 由图可以看出，发酵培养基初始 ph 在 7.58.5 时，菌株 q2 产酶情况比较稳定，在 ph8.0 左右酶活力最高，其酶活为 4.888iu/ml，可确定发酵初始 ph 值为 8.0。 17 3.3.3 温度对菌株 q2 产酶的影响 由于微生物的生命活动是由一系列的生物化学反应组成的，这些反应受温度的影响 极为明显，所以该课题分别于 25、28、31、34、37、40条件下进行摇瓶发 酵，考查发酵温度对菌株 q2 产酶的影响，实验结果见图 3.6。 图 3.6 温度对产酶量的影响 由图可以看出，菌株 q2 的适宜发酵温度为 37，酶活是 3.253iu/ml，可能是因为低 温或是高温使菌株的代谢调控机制发生了改变，高温改变酶的结构，低温使酶活力降低， 进而影响到了木聚糖酶的合成及分泌。 3.4 致死曲线的绘制 紫外灯 15w 照射时间分别为 0s，10s，20s，30，40s，50，60s，70s，分别取 0.10ml 菌液涂布于初筛培养基上，37避光培养 45 天。在初筛培养基上计数存活菌落，计算 存活率，致死曲线如图 3.7 表 3.2 紫外线最佳诱变时间确定 诱变时间(s) 010203040506070 18 10-4626.5468.3268.78428.36118 10-5186.3129.3371330.6720.33 菌落数 10-618.315722.50.330.670.33 致死率 （%） 024.65780.1486.696.397.699.6 图 3.7 致死曲线 由图可以看出，细菌 q2 致死率 80%左右的时间为 30s，适合于做诱变育种的参考时 间。所以将最终的诱变照射时间选择为 30s。 3.5 诱变后初筛结果 此次诱变仅少数平板长出菌落，且培养时间为 5 天，可能是培养基营养被消耗尽所 致，故再次配制筛选平板培养，挑选本次透明圈较大的菌株（共 6 株编号 t1/t2/t3/t4/t5/t6） ，用点样法接种于筛选平板，培养 36h 后，有明显透明圈菌株如下： 19 图 3.8 诱变后初筛平板 3.6 诱变后复筛结果 不同菌株反应后的酶活力下，原始数据如下： 表 3.3 诱变后酶活力 由表 3.3 可得，菌株 t3 经过紫外诱变，酶活有提高，增加了 1.32 倍，结果较为理想。 3.7 遗传稳定性结果 对菌株 t3 进行遗传稳定性实验，数据如下： 表 3.4 酶活与代时的关系 菌株q2t1t2t3t4t5t6 酶活力 (iu/ml) 5.8585.683.687.545.145.144.88 倍数 11.030.641.320.900.900.85 代时2345 t3 菌株酶活5.686.746.876.89 20 由上表 3.4 可知，菌株 t3 能保持一定的酶活，具有稳定遗传性。 3.5 结论 以自制木聚糖样品为唯一碳源，透明圈平板筛选法初筛，摇瓶发酵复筛，从土壤中 筛选出五株产木聚糖酶的菌株，其中株菌 q2 酶活最高，其酶活为 5.858iu/ml。以 q2 菌 株为出发菌株，酶活为评价指标，采用单因素的方法对培养条件进行优化，得出最优培 养条件为：温度 37，接种量为 6%，种龄 16h，初始 ph 值 8.0。然后以 q2 菌株为出发 菌株，进行紫外诱变，透明圈平板筛选法初筛，摇瓶发酵复筛，获得突变株 t3，酶活达 7.54iu/ml，较出发菌株 q2 提高了 1.32 倍。经遗传稳定性试验，该性状具有一定的遗传 稳定性。 稳定指数 （%） 75.389.491.191.4 21 4 致谢 在这四个月期间，我通过查找资料，阅读文献，拟定开题报告和实验方案，并不断 修改，进行实验操作，最后终于完成了大学期间的毕业论文。在这做毕业论文期间，我 查阅文献和资料、对信息进行综合整理，认真思考，动手操作，完成了此次毕业论文。 但是，如果没有各位老师研究生学长的帮助，我不可能获得成功。 首先感谢指导老师蔡俊老师的悉心指导，您对于实验的严谨，对实验室纪律的严格 要求是我完成实验的重要保证，您知识的渊博、以及认真的态度是我学习的榜样。另外， 实验室的王常高老师、胡瑛老师在完成自己实验的同时对于我们提出的问题也是尽力解 答。正是这些老师，以身作则，在学生面前竖立了楷模形象，鼓舞了士气，增加了信心， 让我们在实验中不断学习、不断提高，在此对你们表示诚挚的谢意。 另外，实验室的每一位学长和学姐：罗玲、向梦熊、戴军、周安盛、方聪明、刘联 杰学长，都传授了我非常实用的专业知识和实验技术操作，有时更是亲身示范，帮助我 们克服各种困难，没有他们，我不可能这么顺利地完成实验。 22 最后，也要感谢在本领域一直专研研究的各位前辈学者，有你们的理论指导和实践 经验，才让后人得以借鉴。 5 参考文献 1白毓谦,方善康,高东.微生物实验技术m.济南:山东大学出版,1987. 2刘瑞田,曲音波,杨建云.木聚糖酶分子结构研究进展 j.纤维素科学与技术, 1997,5( 3 ): 126. 3henrissat b,b.a.new families in the classification of glycosyl hydrolases based onj.biochem.j1993,293:781788. 4sanjeev k sharma,krishan l kalra,harmeet s grewal.enzymatic saccharification of pretreateds iu nflower stalks j. biomass and bioenergy,2002,23:237-243. 5冯国栋.湖羊瘤胃未培养微生物中木聚糖酶基因的克隆和表达d.浙江工业大学学位论 文,2009. 6debeire p, pri