转抗虫基因水稻 毕业论文.doc

摘要水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为约40%的人口提供了主要食粮。虫害是造成水稻减产减收的主要原因之一。水稻虫害种类繁多，我国每年因虫害造成的产量损失占到水稻总产量的 5% 以上，给水稻的生产带来了极大危害。目前，我国控制水稻虫害最主要的方法是使用化学杀虫剂，但化学防治带来一系列问题，如环境污染，生产成本提高和食用安全性降低等。因此，通过培育自身能够抵抗虫害的水稻品种来防治水稻虫害无疑是最经济安全的有效策略。从已有的研究来看，仅依靠常规育种难以解决抗虫种质资源稀缺的问题，因此，通过基因工程手段导入外源抗虫基因，进而培育抗虫转基因水稻越来越受到人们的重视。近年来转bt基因抗虫水稻已经在生产上得到了广泛的应用，随着抗虫转基因水稻的大规模种植，bt基因抗虫谱相对狭窄及害虫易产生耐受性等问题相继引起了人们的关注。因此，从自然界中分离克隆出更多、更有效的基因成为解决这些问题的方法之一。籼稻是亚洲栽培稻的重要亚种，全世界水稻栽培品种中有80%以上属于籼稻，其组织培养研究具有重要意义。而籼稻的组培特性普遍较差，再生率很低，导致一些生产上应用价值较大的优良品种转化仍然难以成功或转化频率低，因而研究优质籼稻的愈伤组织形成和植株再生能力对于遗传转化率提高十分必要。农杆菌介导法因具有转化拷贝数低等独特的优势，而广泛应用于转基因抗虫水稻研究中。然而，水稻不同品种间遗传差异性比较大，且转化反应对水稻基因型依赖性强，从而增加了农杆菌介导的水稻遗传转化的复杂性和随机性。因此，通过对农杆菌介导的水稻转化体系的优化提高转化率十分必要。本研究主要进行了以下方面的工作：1. 在新型bt基因cry30fa1和cry54aa1序列的两端分别增加酶切位点序列，送基因合成公司合成，然后将目的基因片段与中间克隆载体puprok分别进行双酶切，连接，获得含目的基因的中间载体。测序鉴定得到序列正确的阳性载体，用内切酶切下目的基因片段并插pcdmar-hyg载体，最终获得高效表达双元载体pcdmar-cry30fa1-hyg与pcdmar-cry54aa1-hyg，并通过酶切和测序的方法鉴定出上述载体的正确性。2. 通过对愈伤组织继代次数与继代培养基中加入抗坏血酸（vc）浓度的优化，调整愈伤组织生长状态，提高胚性愈伤组织数量。结果表明r125与r818的愈伤组织继代2-3次，分化率最高；继代培养基中加入vc浓度为40mg/l，能减少愈伤组织褐化率且对其分化能力无影响。3. 通过对洗菌后及分化前愈伤组织的干燥处理，改良农杆菌介导的水稻遗传转化体系。结果表明洗菌后进行干燥及分化前愈伤组织在滤纸上干燥2天，能够加快分化速度，提高分化率。4. 农杆菌介导法将外源基因cry30fa1与cry54aa1转入三系恢复系r125与r818中，通过pcr检测与潮霉素溶液检测转基因植株。结果表明cry30fa1与cry54aa1转r125未获得转基因阳性植株；cry54aa1转r818也未获得转基因阳性植株；cry30fa1转r818共获得233株转基因再生植株，经过潮霉素溶液检测和分子检测，其中46株为含目的基因的阳性植株。关键词：籼稻；cry30fa1基因；cry54aa1基因；抗虫；农杆菌介导法abstractrice is one of the most important grain crops in the world, for about 40% of the worlds population taking it as their staple food. however，insect damage is one of the main reasons to decrease the rice yield. there are a large variety of rice pests in china. the rice production loss is more than 5% of total yield because of insect damage. at present, the main method to control rice pest is to utilize chemical pesticides. however, it caused a lot of problems, such as environmental pollution, higher production cost, food safety, etc. breeding new rice varieties that produce insecticidal proteins by themselves is undoubtedly the most economical and security strategy. on the basis of previous reports, it is difficult to solve the problem by traditional breeding because of rice germplasm resources are scarce. given this, it is more important to use genetic engineering to breed resistant rice.in recent years, pest resistant rice with bt genes in production have already been on a wide range of applications. with large-scale cultivation of insect-resistant transgenic rice, bt gene zoophobous spectrum is relatively narrow and tolerance to pests and other problems have been attracted the attention of people. therefore, separating and cloning new pest resistant genes from the natural world became more and more effective methods to solve these problems.indica rice is a major subspecie of asian cultivated rice, and more than 80% of the rice cultivars in the world belongs to indica rice, so it is important significance to study tissue culture. tissue culture of indica rice is generally poor and regeneration rate is very low, causing some production value on a large varieties of transformation are still difficult to successfully transform or frequency low. therefore, the study of high quality indica rice callus formation and plant regeneration ability of genetic transformation rate is necessary.agrobacterium tumefaciens-mediated transformation has technique advantages including low copies, and is widely used in the study of insect-resistant transgenic rice. however, the relatively large genetic differences between different varieties of rice, and the transformation strong dependence on rice genotypes, increase complexity and randomness of the agrobacterium tumefaciens-mediated transformation in rice. therefore, the optimization of agrobacterium tumefaciens-mediated rice transformation system to improve transformation rates is necessary.this research has the following main areas of work:1. seqences of new bt genes cry30fa1 and cry54aa1 that had been added cleavage site sequences at both ends, were sent to gene company to synthesis. then all of target gene fragments and middle cloning vector puprok were cut separately by two enzymes and connected to form middle carriers of the target gene fragments. positive vectors were got by sequences identification, and were digested by endonuclease to separate target gene fragments. then target gene fragments were inserted into pcdmar-hyg vector to form eventual expression binary vectors pcdmar-cry30fa1-hyg and pcdmar-cry54aa1-hyg. all of positive plasmids were identified by digestion and sequencing.2. by optimizing callus subculture time and different concentration of ascorbic acid (vc) in subculture media, callus growth state was adjusted and embryo callus were increased. results showed that when r125 and r818 callus were subcultured 2 to 3 times, the differentiation rate was the highest; subculture media with 40 mg/l vc could reduce the rate of callus browning with no effect on their differentiation capacity.3. by drying callus after washing agrobacterium and before differentiation, the system of agrobacterium tumefaciens mediated transformation was improved. results showed that after washing agrobacterium and before regeneration the caulls were dried 2days on filter papers, differentiation speed was accelerated and differentiation rate was increased.4. agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of exogenous genes cry30fa1 and cry54aa1 into caulls of rice restorers r125 and r818, then identified gentic plants by pcr and hyg b solution. as a result, r125 was no transgenic plants; r818 was only transformed into the gene of cry30fa1.there were 233 transgenic plants, but only 46 plants of them were transgenic plants identified by pcr and hyg b solution.key words: indica rice; cry30fa1and cry54aa1; pest-resistant; agrobacterium tumefaciens-mediated 缩写词(abbreviation) 缩写名英文名中文名6-ba6-benzylaminopurine6-苄基氨基嘌呤asacetosyringone乙酰丁香酮2, 4 -d2,4-dichlorophenoxy acetic acid2, 4-二氯苯氧乙酸bpbase pair碱基对titimentin替曼汀hyghygromycin b潮霉素b tbacillus thuringiensis苏云金芽孢杆菌naanaphthalene acetic acid萘乙酸odoptical density光密度pcrpolymerase chain reaction聚合酶链式反应rifrifampicin利福平sdssodium doaecyl sulfate十二烷基硫酸钠ebethidium bromide溴化乙锭kankanamycin卡那霉素ktkinetin激动素edtaethylenediaminete-traacetic acid乙二胺四乙酸目录摘要1abstract3缩写词(abbreviation)51.文献综述81.1 抗虫基因的种类及特点81.1.1 bt毒蛋白基因91.1.2 蛋白酶抑制剂基因101.1.3 植物外源凝集素基因111.1.4 淀粉酶抑制剂基因111.1.5 动物来源的抗虫基因111.1.6 其它抗虫基因121.1.7 抗虫基因存在的主要问题及解决策略121.2 水稻基因工程育种的技术体系131.2.1 构建嵌合基因131.2.2 选择转化载体141.2.3 选择转化受体141.2.4 转化方法151.2.5 转化体的筛选和转基因植株的分子鉴定161.3 农杆菌介导的水稻遗传转化的研究161.3.1 农杆菌菌株与质粒载体171.3.2 农杆菌vir区基因活性的诱导171.3.3 培养基成分181.3.4 愈伤组织的预处理181.3.5 农杆菌悬浮侵染环境181.3.6 共培养环境和时间181.3.7 共培养后农杆菌的抑制191.3.8 筛选标记基因以及筛选剂的选择191.4 转抗虫基因水稻201.4.1 转bt基因水稻201.4.2 其它抗虫基因水稻201.5 转抗虫基因水稻安全性研究211.5.1 转抗虫基因水稻的食品安全性问题211.5.2 转抗虫基因水稻的生态安全性问题221.6 本研究的立题依据与目的意义222.实验材料和方法232.1 实验材料232.1.1 供试水稻品种232.1.2 菌株和质粒232.1.3 培养基232.1.4 化学试剂242.1.5 重要仪器设备252.2 实验方法252.2.1 载体的构建与鉴定252.2.2 重组质粒的农杆菌转化262.2.3 胚性愈伤组织的诱导及继代272.2.4 农杆菌介导的遗传转化272.2.5 转基因植株再生282.2.6 结果统计方法282.2.7 水稻叶片dna提取282.2.8 水稻转基因再生植株潮霉素抗性检测292.2.9 转基因植株的pcr检测293.实验结果与分析303.1 新型bt基因含选择标记农杆菌转化载体的构建与鉴定303.1.1 含新型bt基因中间载体puprok-cry30fa1与puprok-cry54aa1的构建与鉴定303.1.2 含新型bt基因双元载体pcdmar-cry30fa1-hyg与pcdmar-cry54aa1-hyg的构建与鉴定323.2 籼性水稻成熟胚愈伤组织的获得353.2.1 抗坏血酸对籼性水稻成熟胚愈伤组织获得的影响研究353.2.2 继代次数对籼性水稻成熟胚愈伤组织获得的影响363.3 农杆菌介导的转新型bt基因籼性水稻的获得363.3.1 筛选压对愈伤组织转化率的影响373.3.2 干燥处理对愈伤组织分化的影响383.4 转基因抗性植株t0代的检测393.4.1 转基因抗性植株t0代离体叶片的潮霉素检测393.4.2 转基因再生植株t0代的pcr检测404.讨论与结论414.1 新型杀虫基因cry30fa1与cry54aa1的实际应用性414.2 籼稻愈伤组织的培养与转化体系的优化424.2.1 组织培养过程中的褐化问题424.2.2 愈伤组织继代次数对转化率的影响434.2.3 干燥处理对抗性愈伤组织分化的影响434.2.4 筛选压对抗性愈伤组织获得的影响444.3 双t-dna共转化获得去除标记基因的转基因植株444.4 用离体叶片检测转基因水稻对潮霉素抗性的可行性455.后续研究设想46参考文献47致谢54附录55571.文献综述水稻是世界上最重要的粮食作物之一，为世界上近30亿的人口提供了主要的食物，并且是我们饮食中35%-60%的能量来源1。据统计，到2025年水稻产量需增加60%才能满足日益增长的人口需求2。因此，在世界人口快速增加和土地资源锐减的今天，提高单位面积土地的水稻产量具有非常重要意义。同时，水稻也是虫害最多的粮食作物之一，田间害虫种类达624种以上，每年仅由于螟虫危害所造成的直接经济损失就达64.5亿元，使用化学杀虫剂防治螟虫的费用每年达45.7-60亿元，所以每年由稻螟虫危害引起的总经济损失就能达到110.12-124.15亿元3。我国每年因虫害造成的产量损失占水稻总产量的 5% 以上，给水稻的生产带来了极大危害。因此，减少病虫危害是降低生产成本、提高水稻产量的一个重要途径。长期以来，害虫防治过多的依赖于化学农药。化学农药的施用在减少虫害的同时还伴随着一些副作用，如提高生产成本、污染生态环境、危害人体健康、破坏生态系统、诱导害虫产生抗药性、杀死害虫的天敌、引起次要害虫的大发生等，从而使化学农药控制虫害的方法在生产应用受到了一定的限制。随着现代生物技术的迅猛发展，植物抗虫基因工程研究不断深入，人们对农作物虫害的防治逐渐形成了新的思路与途径。通过基因工程手段转入外源抗虫基因，培育抗虫新品种可从根本上解决问题，而且对哺乳动物和一些有益昆虫不产生毒害作用，也不会造成环境污染，在生产上具有广阔的应用前景。目前，人们已从植物本身、细菌中以及一些动物体内发现并分离克隆到许多抗虫基因，其中某些抗虫基因已转入农作物并进行田间试验，并有一些品种已商品化，其中以转苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因进入植物的研究最为广泛和深入。1.1 抗虫基因的种类及特点目前我们已经发现并获得了很多种抗虫基因，这些抗虫基因根据来源进行分类，大体可以分为以下三类：第一类是从细菌如苏云金芽孢杆菌中分离得到的抗虫基因，主要是bt毒蛋白基因；第二类是从植物中分离出来的基因，包括蛋白酶抑制剂基因，外源凝集素基因，淀粉酶抑制剂基因等；第三类是从动物体内分离出来的毒素基因，如蜘蛛毒素基因和蝎毒素基因等4。1.1.1 bt毒蛋白基因（1）bt毒蛋白的作用机理bt毒蛋白基因是水稻抗虫基因工程中运用最为广泛的基因之一，它来源于一种革兰氏阳性菌苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringensis，bt)。苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白（insecticide crystal proteins，icps）又称内毒素，是一类在苏云金芽孢杆菌芽孢形成期产生的具有特异杀虫活性的晶体蛋白，其在伴孢晶体内以原毒素的形式存在。当被昆虫摄食之后在昆虫的肠道内经蛋白酶水解转变为带有末端且具有杀虫活性的毒性多肽分子，它可与敏感昆虫中肠上皮细胞表面的特异受体相互作用诱导细胞膜产生一些特异性小孔扰乱细胞内外的渗透压，引起细胞膨胀甚至裂解，从而导致昆虫停止进食，最终死亡5。（2）bt毒蛋白基因分类由于苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因具有多样性，bt毒蛋白的基因分类一直是细菌学家们争论不休的问题，直到1975年才正式列为一个独立的种，种以下又根据鞭毛抗原的血清型和生理生化特征的不同分为不同的亚种，后来由于无鞭毛亚种的出现，又把营养细胞的酯酶型作为辅助分类依据6。据粗略统计，已经有60 余种bt基因被报道。icps与昆虫肠道细胞表面受体相互作用的特异性决定了bt毒蛋白的抗虫谱。不同基因型杀虫谱不同，毒蛋白的大小及形状也不一样。根据它们杀虫谱的范围，可将bt杀虫基因分成六大类，即cry、cry、cry、cry、cry和 cyt。在每一类型下根据氨基酸序列的同源性，又分为a，b，c等不同的基因型。在同一基因型下根据限制性内切酶的酶谱和分子量的大小，又分为a，b，c等不同的基因亚型7。其分类如表1.18。表1.1目前发现的一些bt毒蛋白大体分类及杀虫谱table1.1 the general classification of bt -endotoxin found currently and insecticidal spectrum种类毒蛋白名称杀虫范围crycryia(a) cryia(b) cryia(c) cryib cryib(b) cryic cryid cryie cryif cryig cryix鳞翅目crycryiia cryiib cryiic鳞翅目、双翅目crycrya cryb cryb2 cryc cryd鞘翅目cryivcryiva cryivb cryivc cryivd双翅目cryvcryva(a) cryva(b) cryvb cryvc鞘翅目、鳞翅目cytcyta双翅目1.1.2 蛋白酶抑制剂基因蛋白酶抑制剂(proteinase inhibitor，pi)是植物本身起防御作用的并且是自然界含量最丰富的蛋白质种类之一，而且某些纯化的蛋白酶抑制剂对昆虫的生长和发育具有明显地抑制作用9。其抗虫机理是在昆虫的消化道内pi能与蛋白消化酶作用，形成酶抑制剂复合物(ei)，消化酶的蛋白水解作用被阻断或减弱；同时，消化酶在ei的刺激下会过量分泌，通过神经系统的反馈作用，使昆虫产生厌食反应或消化不良，从而杀死昆虫达到抗虫目的10。在植物中，目前发现的蛋白酶抑制剂主要有三类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂11。其中用来抗虫且研究最多是丝氨酸蛋白酶抑制剂，这是因为膜翅目、直翅目、双翅目以及大部分鳞翅目和某些鞘翅目昆虫消化道内的消化酶是丝氨酸蛋白酶12。目前已经有多种植物导入了丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，其中豇豆胰蛋白酶抑制剂（cpti）是抗虫效果最为有效的丝氨酸蛋白酶抑制剂，现已有多种植物如棉花13、烟草14、水稻15等导入了cpti基因，获得的转基因植株对鳞翅目和鞘翅目害虫均具有较好的抗虫效果。蛋白酶抑制剂是从植物本身发掘的抗虫基因，由于昆虫与人、畜在消化机制上不同，转入蛋白酶抑制剂基因的食用农作物对人、畜不会产生副作用，因此，蛋白酶抑制剂基因要比其它细菌或动物来源的抗虫基因更易于被公众心理上接受16。但是，蛋白酶抑制剂基因在植物抗虫基因工程中也存在不足，其在转基因植物中表达量太低，不能满足抗虫所需要的表达量，因此在实际应用中还有一定困难。1.1.3 植物外源凝集素基因外源凝集素(lectin)存在于自然界许多植物中，是分布较为广泛的一类非免疫球蛋白，其中豆科植物的种子中含量最为丰富。外源凝集素对昆虫的抗虫机理还研究得不十分清楚，一般认为外源凝集素一旦被害虫摄食，就会与肠道围食膜上的糖蛋白结合，特异地识别并可逆地结合糖类复合物，影响害虫对营养物质的正常吸收17，18，从而杀死害虫，达到抗虫的目的。同时还发现，外源凝集素还可通过促进消化道内细菌的繁殖并诱发病灶，对害虫的消化道造成损伤。转植物凝集素基因的农作物虽然能够抗虫，但是有些对人也有毒害作用，然而雪花莲外源凝集素基因（gna）19和豌豆外源凝集素基因（pea lectin）20 因为对人、畜不产生毒性或毒性很低，已被成功转入烟草和马铃薯等多种作物中，结果表明抗虫效果良好，因此受到人们的重视21。1.1.4 淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂(-alny1aseinhibitor，-ai)是一种在植物中普遍存在，尤其在禾谷类和豆科作物的种子中含量最为丰富，且能够起抗虫作用的蛋白质。其抗虫机理是-ai能抑制昆虫消化道内的-淀粉酶活性，致使昆虫摄取食物中的淀粉进入消化道后不能被消化，导致害虫不能正常的摄取能量，从而引起非正常发育或死亡22。因此，-淀粉酶抑制剂可作为抗虫基因转入农作物，达到转基因植物自身抗虫的目的。1.1.5 动物来源的抗虫基因在这一类基因中，研究的较多的是来自哺乳动物和烟草天蛾的蛋白酶抑制剂基因。但这些抑制剂基因转入植物后并未产生抗性或产生较弱的抗性。如来自牛的蛋白酶抑制剂在体外抑制实验时均能显著抑制昆虫中肠提取物的降解，然而，当用转入此基因的马铃薯饲喂害虫幼虫时，并未出现预期的抗虫效果，反而幼虫的体重超过对照23。来自烟草天蛾的蛋白酶抑制剂基因转入棉花和烟草表现较弱的抗性24。另一类研究较多的是蝎和蜘蛛产生的毒素，这些毒素能专一的作用于昆虫而对哺乳动物则无害或毒性很低。如将5种蝎毒素基因转入烟草，发现转基因烟草对棉铃虫和棉青虫有很强的致死性25，转蜘蛛毒素基因的烟草也表现出了明显地抗虫作用26。1.1.6 其它抗虫基因胆固醇氧化酶(cholesterol oxidase,cho)基因和营养杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein，vip)基因都是来源于链霉菌属的第二代抗虫基因，它们都有较强的杀虫活性。此外，几丁质酶基因、豌豆脂肪氧化酶基因和核糖体失活蛋白基因等在植物抗虫基因工程中也具有很大的应用潜力。1.1.7 抗虫基因存在的主要问题及解决策略虽然在一定程度上，抗虫基因转入植物后，改良了某些农艺性状，减少了作物的虫害，提高了产量，但是也存在一些的问题：（1）抗虫基因的种类虽然众多，总体来说抗虫谱比较广泛，但从严格意义上来说，每一种抗虫基因杀虫谱却相对狭窄，如bt基因种类很多，每一种bt基因都有一定范围的抗虫谱，所有种类的bt基因可以杀灭多种害虫，但是每一种bt基因只能杀灭一种或几种害虫，而且经过一段时间以后，昆虫会对某些特定的抗虫基因产生耐受性，抗虫基因的抗性不会持久；（2）有些抗虫基因的表达量较低，不能达到杀虫所需要的浓度，如cpti基因导入植物后，只有远高于bt毒蛋白的表达浓度才能起到杀虫作用，但是它表达浓度的提高很可能会对植物产生某些负面影响；（3）某些抗虫基因不仅抑制或杀死害虫，对人、畜也有毒性，如某些植物凝集素除对害虫有较强的抑制或杀死作用外，对人、畜也有较低毒性，如果将这种凝集素基因转入农作物，则不会被公众所接受；（4）其它种类的抗虫基因如来源于动物的抗虫基因对害虫的抗虫机理仍不清楚，对它们的研究仍处于积极探索中。针对目前植物转抗虫基因后存在的主要问题，我们可以采取下列措施来解决:（1）对已有的基因进行适当的分子修饰或改造，也可以人工合成新的抗虫基因以提高其抗虫性；（2）从自然界中分离更多、更有效的抗虫基因；（3）同时使用两个或两个以上的抗虫基因转化同一种植物，或多次转化，获得抗虫基因集中的植物；（4）应用更新、更专一地能高效调控基因表达的启动子以调节基因的表达；（5）在作物栽培上采取“高剂量/避难所”策略，即转基因植物与非转基因植物间隔种植，与生态防治相结合。1.2 水稻基因工程育种的技术体系基因工程育种研究最早始于20世纪70年代，是利用分子生物学和基因工程手段，有目的地将外源基因导入并整合到植物基因组中，通过外源基因在受体植物内的表达和遗传，或通过对内源基因表达的调控，从而改良受体植物性状的一种技术。1.2.1 构建嵌合基因 基因的表达调控主要是依靠其本身的调控序列，如启动子和终止子，而不是其编码序列。外源基因整合到受体植物中能够高效表达的最重要的条件之一就是要有一个强启动子序列。烟草花叶病毒（camv35s）是最早应用于基因工程中的组成型启动子，但该启动子在单子叶植物中的活性相对较低，现在在转化时多采用一些新发现的强启动子，如玉米泛生素基因启动子(pub1)、水稻肌动基因actl启动子(pactin 1)及玉米嵌合启动子（pemu）等，其中使用最为广泛的是玉米泛生素启动子。而终止子大多采用胭脂碱合成酶基因(nos)的终止子(nost)27。在构建嵌合基因时，除启动子、目标基因和终止子外，还要加入一个选择标记基因或报告基因，以便转基因受体的筛选与检测。目前常用的选择标记基因主要有潮霉素磷酸转移基因(hpt)、新霉素磷酸转移酶基因(npt)等抗生素类选择标记基因和抗除草剂基因（bar）等。常用的报告基因有绿色荧光蛋白基因(gfp)和-葡糖苷酸酶基因(gus)等28。1.2.2 选择转化载体在运用基因枪法，电激法等对dna直接进行转化时，不需要构建特殊的载体，可直接将含目的基因的质粒转入植物细胞。而根癌农杆菌介导的遗传转化，则需构建含t-dna的载体，将目的基因插入t-dna，以适应农杆菌通过t-dna将目的基因导入并整合到受体基因组中，现在研究最常用的是ti质粒29。在根癌农杆菌介导的水稻遗传转化中，所用载体大多数为双t-dna载体，其中一个t-dna含有目的基因，另一个t-dna含有标记基因或报告基因，以便于转目的基因受体的筛选与检测及转基因后代选择标记基因的去除。1.2.3 选择转化受体良好的转化受体是基因转化成功的前提条件，因此在选择的转化受体应具有稳定的外植体来源，高效稳定的再生能力，对选择性抗生素敏感等特征。目前，用于水稻遗传转化的受体主要有下列几种：（1）愈伤组织 愈伤组织是目前水稻遗传转化应用最为广泛的转化受体，用于水稻遗传转化的愈伤组织大多是由水稻成熟胚、幼胚、幼穗诱导得到的胚性愈伤组织。水稻的成熟胚因取材不受季节环境限制，且愈伤组织转化效率高，而被广泛应用于水稻的遗传转化。水稻的幼胚与幼穗获得的愈伤组织虽然转化效率很高，但取材受季节和环境的限制，现阶段应用较少。 （2）原生质体 20世纪80年代末至90年代初，toriyama等用peg法成功转化了水稻的原生质体，得到的水稻转基因植株可育 30后，人们开始将水稻原生质体作为peg法转化水稻的受体。对水稻原生质体可以直接高效地进行转化，而且转化率较高，但原生质体因培养时间长，培养条件要求高，分离制备非常困难等原因，现已很少应用。（3）幼嫩的子房、卵细胞 通过直接对幼嫩的子房、未成熟的卵细胞及种胚注射外源dna的方法导入外源基因31，此方法易于得到转基因种子，避免了转化体夭亡及不育现象，避开了繁琐的细胞及组织培养过程，但是转化后代群体较大，转基因植株的筛选与检测工作量较大。1.2.4 转化方法（1）农杆菌介导法 此方法自zembryski等利用农杆菌介导法转化烟草获得首例转基因植株后32，逐渐得到推广。由于大多数单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，限制了此法在单子叶植物中的应用。20世纪90年代以后，人们对农杆菌的侵染机理做了深入的研究，对整个转化过程了解清楚后，针对单子叶植物对农杆菌的转化过程进行了适当地改良，使应用此法对水稻，玉米等单子叶植物的遗传转化取得了成功。hiei等33利用此法转化粳稻得到了转基因植株； rashid等34、瞿文学等35应用此法转化籼稻也相继取得了成功，dong等36也报道农杆菌介导法转化爪哇稻取得成功，这些研究都有利地证实了农杆菌介导法转化水稻的可行性。农杆菌介导的遗传转化获得的转基因植株目的基因拷贝数少，不易发生染色体变异，后代性状遗传也比较稳定。然而由于水稻品种间的遗传差异比较大，且此方法对转化受体的基因型依赖性强，从而增大了转化过程的复杂性和随机性。（2）基因枪转化法 christou等率先应用基因枪法将bar基因转入水稻幼胚，获得可育的转基因植株 37。基因枪法转化水稻周期短而且不受外植体限制，幼胚、成熟胚的胚性愈伤组织，原生质体及根尖和芽尖的分生组织等多种外植体都能应用基因枪转化法进行转化。目前已有大量的水稻品种采用此法转外源基因获得了成功。但是转基因植株中外源基因导入随机性强，往往以多拷贝形式整合，后代的遗传稳定性较差。基因枪法转化对细胞的损伤性大，使很多转化细胞死亡。基因枪的价格也很昂贵，转化所需成本高。（3） peg 法 此法是利用高浓度的peg具有极强的亲水性，能使dna大分子沉淀，促进水稻原生质体与外源dna相互靠近并作用，促使原生质体直接摄取外源dna。整个操作过程需要的设备简单，成本低，但原生质体分离制备困难，培养周期长，培养条件高，且再生频率低，依赖于基因型等，从而使这一方法的应用受到限制。 （4）电激法 此方法是利用瞬间高压的电脉冲作用于受体细胞，使受体细胞表面产生暂时的孔隙，从而将外源dna分子导入细胞内的一种方法，也称为电穿孔法。这种方法与peg法一样也是以原生质体作为转化受体，因此也具有原生质体的分离制备困难，操作周期长，植株再生率低和基因型依赖性等问题。（5）花粉管通道法 此方法是将外源dna分子在授粉后注射入花粉管，然后沿着花粉管通道进入胚囊，转化未成熟的卵细胞，进而借助天然种胚系统形成转基因种胚。谢道昕等应用此法将bt基因成功导入水稻，并获得了变异的子代38。由于该方法可直接在田间进行操作，成本低，易于推广。但这一方法的转化效率低，操作过程还受开花季节限制，重复性差，对后代的筛选工作量很大。（6）其他方法 朱祯将人干扰素基因应用转化脂介导法导入水稻原生质体中，获得了转基因植株39；李宝健等运用电注射法将外源基因直接导入水稻种胚，获得转基因植株40；杨剑波等人用低能粒子束介导法获得转基因水稻41。1.2.5 转化体的筛选和转基因植株的分子鉴定在转化过程中，通常将外源基因与筛选标记基因共同转化受体，为鉴定转化受体是否转进了外源基因，一般通过对标记基因的检测进行初步筛选。转入选择标记基因的受体一般表现为对相应的作用底物的抗性，如各种抗生素或除草剂。初筛之后通过分子生物学方法进一步筛选含目的基因的转基因植株。转基因植株的分子鉴定可以通过以下5种方法进行：（1）报告基因的酶法检测，报告基因就是一种指示基因，如gfp独特的荧光特性，用来指示是否转入外源基因。（2）pcr法检测，提取转基因植株dna，采用特异引物在体外对目的基因的dna片段进行特异扩增，检测是否转入外源基因。（3）southern杂交，用特异的dna探针检测外源基因在植物中的整合位置及拷贝数等。（4）northern杂交，它是检测基因在转录水平上的表达情况，用特定的dna探针来检测rna，研究转基因植株中外源基因的表达及调控。（5）western杂交，是一种将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法，能直接显示目标基因在转化体中是否经过转录、翻译，最终合成蛋白质而影响植株的性状表现，它是检测目标基因在翻译水平上的表达情况。1.3 农杆菌介导的水稻遗传转化的研究baba等于1986年通过peg法将农杆菌原生质与水稻原生质体介导融合，获得能表达胭脂碱的水稻愈伤组织42，自此人们开始了对农杆菌介导法转化水稻广泛的研究。chan等成功获得了可遗传的农杆菌介导的转化水稻植株 43。随后，hiei等通过利用“超双元”载体和在共培养基中加入乙酰丁香酮等改良了转化条件，从而提高了农杆菌介导的水稻转化频率33。至此，农杆菌介导的水稻遗传转化技术获得突破性进展并日益成熟。农杆菌介导的水稻遗传转化是农杆菌菌株与转化受体细胞之间的相互作用，与愈伤组织的培养及农杆菌的侵染转化过程有关的影响因素，都会对转化效果产生影响。因此，对整个遗传转化体系的优化是获得转基因植株的重要条件。影响遗传转化体系的因素有以下几个方面：1.3.1 农杆菌菌株与质粒载体目前用于水稻转化的农杆菌主要菌株有 lba4404、 eha101 及eha105、agl0 和agl1。不同农杆菌菌株对水稻愈伤组织的转化能力也是不同的，hiei等发现 lba4404 效果优于 eha10133；刘巧泉等，易自力等发现eha105转化效果优于lba4404和agl1 菌株44，45。王歆等认为eha105转化效果优于agl046。在粳稻遗传转化中，hiei等人研究发现，应用超双元载体比用双元载体有更大的优越性33。ramesh等研究发现，应用农杆菌超双元ti质粒载体能转化难以转化的籼稻品种47。因此，采用超毒力的农杆菌菌株和超双元载体，能够增强农杆菌的侵染能力和t-dna的整合能力，较好地克服了包括水稻在内的单子叶植物对农杆菌敏感性差的问题。1.3.2 农杆菌vir区基因活性的诱导目前，在水稻遗传转化过程中，对农杆菌 vir 区基因活性的诱导应用较多的是乙酰丁香酮。stachel 等1985年首次从烟草叶片的伤口诱出液中分离出乙酰丁香酮（as）和羟基乙酰丁香酮 （ho-as），并证明这些酚类物质能激活ti质粒上vir区基因的表达48。单子叶植物之所以比双子叶植物难以转化，可能是由于单子叶植物不能产生酚类物质或者产生量不足以形成信号，因此对农杆菌的侵染不敏感 49。hiei等证明100m的乙酰丁香酮是粳稻转化的最佳浓度的关键34。而hoque 等研究孟加拉稻转化时却发现200m 乙酰丁香酮转化效率最高50。据此可以判断，不同水稻品种使用的最佳 as 浓度存在差异。此外，侵染过程中加入肌醇、较高浓度的糖类、较低浓度的 ph 值和较低的共培养温度等也有利于vir基因的诱导51。1.3.3 培养基成分培养基中各种成分含量的不同对愈伤组织的生长至关重要，因此，选择恰当的培养基是良好愈伤组织的获得，农杆菌介导遗传转化的成功与转基因植株再生的基础条件。目前在水稻组织培养使用的基本培养基有nb、ms、n6、b5等52。其中籼稻以ms53、粳稻以nb54作为主要的基本培养基。马炳田等以 n6大量元素、ms微量元素、b5有机成分组合成 nmb培养基，对几个杂交籼稻亲本品种的成熟胚进行愈伤组织的诱导，获得了较高的诱导率55。可见，不同的培养材料对培养基中各种成分的需求不同，在实验过程中可以根据各种不同培养基成分的特点进行搭配以组合成新的培养基来获得较为理想的培养效果。1.3.4 愈伤组织的预处理stanton认为当愈伤组织细胞中处于细胞周期间期 s和 g2 期的胚性愈伤组织比例最高时转化效率最高56。因为细胞分裂间期染色体解螺旋，以染色质形式存在，且s期是细胞dna复制期，此时转化有利于 t-dna插入水稻基因组中，增加遗传稳定性。郑杰认为继代培养 6-7d的愈伤组织用于转化时转化率最高57。因此对愈伤组织进行适当的继代和预培养，可增加胚性愈伤组织比例，提高转化率。1.3.5 农杆菌悬浮侵染环境不同的悬浮侵染环境对转化率的影响是比较大的，在大多数的转化方法中农杆菌悬浮于 aam 培养基中用于侵染愈伤组织。不过，向殿军等认为将 ms培养基 和 yeb培养基按3：1比例混合，用于悬浮菌体来侵染愈伤组织，不但能较好地控制农杆菌生长，而且愈伤转化率也要高于单独使用其它培养基58。王志成等认为在悬浮浸染时加入cacl2或0.1% tween20也可以提高愈伤组织的转化频率59。1.3.6 共培养环境和时间王彩芬等认为在26共培养2d的抗性愈伤组织频率最高，若时间太长，农杆菌难以抑制，脱菌困难 60。孙建昌等认为在22共培养 3d 后，获得的抗性愈伤组织最多，效果最好61。王志成等认为在共培养的培养基上覆盖1张干燥无菌滤纸,将愈伤组织放置在滤纸上以后再在愈伤组织周围滴加1-2滴aam培养基的共培养方式为最佳56。1.3.7 共培养后农杆菌的抑制农杆菌与愈伤组织共培养后农杆菌的去除与抑制对转化效率有着极大地影响。目前常用的方法是用灭菌蒸馏水洗脱并在最后几次洗脱时加入抗生素抑制，同时在筛选培养基中加入抗生素抑制。共培养后农杆菌用小剂量的抗生素难以除去，加大剂量虽然能有效地除去农杆菌，却严重损害了愈伤组织导致愈伤组织的褐化死亡，影响转化率。