中草药抗氧化活性研究—— 忍冬藤抗氧化活性 毕业论文.doc

毕业设计（论文） 题 目：中草药抗氧化活性研究 忍冬藤抗氧化活性 学 院： 专 业： 班 级： 姓 名 学 号： 指导教师 目录中英文摘要1绪论21忍冬藤提取工艺2 1.1 所需仪器2 1.2 提取方法2 2忍冬藤抗氧化活性研究方法3 2.1dpph法3 2.1.1 dpph法实验原理3 2.1.2 dpph法实验过程3 2.1.3 dpph法实验分析与结果3 2.2福林酚法5 2.2.1 福林酚法实验原理5 2.2.2 福林酚实验过程5 2.2.3 福林酚实验分析与结果6 2.3 abts法7 2.3.1 abtss实验原理7 2.3.2 abts实验过程7 2.3.3 abts实验分析与结果8 2.4铁离子螯合能力法9 2.4.1 铁离子螯合实验原理9 2.4.2 铁离子螯合实验过程9 2.4.3 铁离子螯合实验分析与结果10 2.5还原力测定法10 2.5.1 还原力实验原理10 2.5.2 还原力实验过程11 2.5.3 还原力实验分析与结果123 总结13 致谢14 参考文献15 中草药抗氧化活性研究 忍冬藤抗氧化活性 摘要 中草药是天然的抗氧化活性物质的重要来源，因其种类繁多，如菊花，甘草，忍冬藤，金银花，决明子，等中草药抗氧化成分复杂，因此活性差异较大。用于开发体内自由基清除药物，保健品，和食品的抗氧化剂。中草药中的抗氧化活性物质有黄酮，多酚，生物碱，多糖，皂苷等等，都是非常好的天然抗氧化活性成分。本文以忍冬藤为例。其成分有皂苷，绿原酸，黄酮，多糖，都具有清除自由基能力和抗菌能力。 忍冬藤能采用多种方法分析其抗氧化活性。dpph方法是目前最常用的检测清除自由基能力被广泛应用于实验室中。福林酚法用于检测样品中的总酚含量，是研究抗氧化活性的因素之一。abts法原理与dpph相似，都是应用到了抗氧化活性物质具有自由基清除的能力。铁离子螯合法，通过测定样品的铁离子螯合能力从而得出样品的抗氧化能力大小。样品的螯合能力越强，则抗氧化活性也越强。还原力测定法也是最常用的方法之一。关键词 忍冬藤;dpph ;福林酚法;abts,;还原力测定the study of the antioxidant activity of chinese herbal medicine the antioxidant activity of honeysuckle cane abstract chinese herbal medicine is a great resource of antioxidant activity substance .the kind of the chinese herbal medicine is various .such as chrysanthemum, licorice ,honeysuckle and etc. and it s composition is very complex .so the antioxidant activity of which vary from one to another . chinese herbal medicine act removing free redicals which contain such as ketone，phenol, alkaloid，sugar，saponins and so on which are excellent antioxidant activity substance. honeysuckle cane is a example of t.he chinese herbal medicine which contain , saponihens chlorogenic acid,ketone.which can abolish radical and act as antioxidant activity substance .the ability of antioxidant activity of honeysuckle cane can be admeasurement by many ways .the dpph is the method that people use it most in the lab to analyse antioxidant activity. folin is used to analyse the phenol of the sample .but it is only one of the fact to balance the antioxidant activity .there are also other method to analyse the ability of antioxidant activity of the sample which are abts,fe chelating ability .the abts and dpph are very resemble .both of them are based on the ability to abolish free redicals .fe chelating is to determine the ability of the sample of the fe chelating ability. the more the power of the fe chelating .the higher ability of the sample of the antioxidant activity .reducing power is also another method to setting out the power of antioxidant activity .key word honeysuckle cane ;dpph ;foline-phenol ;abts ;fe chelating 绪论 中草药种类繁多，且抗氧化能力各不相同。含有的抗氧化活性成分也是种类较多。但是中草药活性成分的提取和研究抗氧化活性的方法是大致相同。因此本文以忍冬藤为例子。详细阐述其抗氧化活性研究方案。得出适合中草药抗氧化研究的一般方法。 忍冬藤又叫，大薜荔，千金藤，是金银花的干燥茎枝。其主要含有，皂甘，黄酮，绿原酸等具有抗氧化活性。现代医学证明其含有较强的抗菌和抗氧化功效，能抑制自由基的生成，从而保护机体。延缓机体的衰老。 中草药提取物的抗氧化活性研究主要可以利用福林酚法，abts法，还原力测定法，dpph法，铁离子螯合等一些方法来测定其抗氧化活性的大小。通常实验室较常用的抗氧化检测方法为dpph法。dpph法利用抗氧化活性物质具有清除自由基的能力，从而得出dpph的清除曲线。福林酚法通常检测抗氧化活性物质所含的总酚量。其抗氧化能力的大小通常用没食子酸的量表示。abts法和dpph的原理大致相同，都是利用抗氧化活性物质具有自由基清除能力，通过自由基清除的强弱来表示抗氧化能力的强弱。铁离子螯合能力也是反应样品抗氧化能力的一个因素，即螯合率越高，样品的抗氧化能力也越高。还原力测定是利用铁氰化钾还原为亚铁氰化钾后，亚铁氰化钾能与三价铁离子反应生成普鲁斯蓝来测定样品的抗氧化能力大小。通常结果用样品vc所含vc的当量表示。1 忍冬藤的提取方法1.1 所需仪器: 旋转蒸发仪:型号 re-5003 上海申顺生物科技有限公司。 离心机:型号gl-10mc。北京四环仪器厂。 恒温水浴锅:型号：hh2型 北京普析通用仪器有限公司 。循环水式真空泵:型号sh-3 上海亚荣生化仪器厂。1.2 提取方案a 材料粉碎： 称取忍冬藤20克，粉碎，并且50目过筛b 热回流提取：将破碎后的忍冬藤放置于磨口的圆底烧瓶中，加入适量的乙醇或甲醇，用恒温水浴锅加热至微沸的状态。并且回流2次，第一次1小时，第二次0.5小时。c 抽滤 ：用布氏漏斗减压抽滤浸提液，滤液放入圆底烧瓶中。d 浓缩 ：合并浸提液，用旋转蒸发仪，温度控制在40度左右慢慢蒸发掉乙醇，至没有乙醇的味道。e 离心 ：浓缩液必须4度存放24小时后，并且10000转离心30分钟，取上清液，加乙醇定容至1g/ml,（即浓缩液的质量与定容的刻度相同）。2 忍冬藤抗氧化活性研究方法2.1 dpph法2.1.1 实验原理： dpph清除率的检测是一种快速，简单，高效的实验室抗氧化检测方法，在天然植物提取物体外抗氧化测定中应用广泛。其原理是用到二笨代苦味酰基（有毒），dpph. 它是种在有机溶剂中比较稳定的氮自由基，其分子结构有三个苯环，一个氮上有孤对电子，在517纳米处有最强吸收峰。若有抗氧化物质存在时，dpph上的孤对电子被配对从而使其颜色发生变化，成为浅红紫色，用分光光度计分析dpph含量的变化。2.1.2 实验过程：a 忍冬藤样品曲线的绘制 以甲醇为溶剂，配制不同浓度的样品溶液，取0.1ml的样液，并且加入3.9ml的浓度为25mg/ml dpph标准液，以甲醇代替样液做空白试验，在515纳米处测吸光值。b vc参照曲线的绘制 配制不同浓度的vc溶液，取0.1ml的样液，并且加入3.9毫升的质量浓度为25mg/ml dpph标准液，以甲醇代替样液做空白试验，混合液摇匀，在515纳米处测吸光值。c bht参照曲线的绘制，配制不同浓度的bht溶液，取0.1ml的样液，并且加入3.9毫升的质量浓度为25mg/ml dpph标准液，以甲醇代替样液做空白试验，混合液摇匀，在515纳米处测吸光值。d 根据样品忍冬藤，vc溶液，bht溶液的溶度曲线算出清除率 见如下公式 其中a1表示甲醇与dpph溶液的吸光值，a0表示样品的吸光值。并且绘制出吸光曲线。根据吸光曲线计算出半数清除量ic50的值。（ic50即清除率为50%所对应的样品浓度）。ic50值越小，则抗氧化能力越强。从而衡量样品，和参照品抗氧化能力之间的关系 清除率=(1-a0/a1)*100% 2.1.3 结果与分析2.1.3.1忍冬藤吸光曲线表1说明了当忍冬藤的浓度在025mg/ml时候具有较为合适的吸光度范围，并且随着浓度的增大，吸光度值减小，在图一的吸光度曲线中得出忍冬藤在该浓度区间内，线性良好，回归方程为y=-0.0172x+0.6117。且方差为0.9906.误差较小。表1 忍冬藤吸光度表 忍冬藤浓度（mg/ml) 0 5 10 15 10 25吸光度值 0.635 0.510 0.429 0.342 0.273 0.1942.2.3.2 bht吸光度曲线分析 表2说明当bht的浓度在0到2.5mg/ml时具有较好的吸光度值范围，并且当浓度在2和2.5mg/ml时吸光度值差异较小，反应在曲线上为指数函数的曲线。说明当bht浓度达到2mh/ml时。dpph的清除量变化很小。bht的吸光曲线回归方程为y=0.5990e(-0.6970)。 表2 bht吸光度表 bht浓度（mg/ml) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 吸光度值 0.636 0.416 0.305 0.1956 0.128 0.125 2.2.3.3 vc吸光度表分析 表3可以看出vc的浓度在00.5时具有较好的吸光度范围，并且清除率较忍冬藤和bht都要来的大和彻底，但是vc的清除率不能达到100%。图3可以看出vc的线性较好。回归方程为y=-1.2466x+0.6051。方差为0.9886。表3 vc吸光度表 vc浓度（mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5吸光度值 0.636 0.471 0.330 0.220 0.090 0.014 2,234 结论分析 如表四所示 三种样品对dpph都有清除作用。 从实验分析来看忍冬藤在吸光度范围内是直线。vc在标准吸光度范围内也是直线，但是bht是曲线，所以不难得出如果继续加大忍冬藤和vc的浓度，则吸光度的改变会很小。也有可能得到相同的吸光度曲线。从图可知清除率越大，看氧化活性液越大。其中vc最强，清除率达到97。7%。bht次之，忍冬藤最弱。抗氧化活性为vcbht忍冬藤，并且vc的半数清除量是忍冬藤的85.5倍。bht的半数清除量是忍冬藤的17.5倍。通过对比说明了忍冬藤具有清除自由基的能力。表4 根据三者吸光度曲线的比较可以计算得出ic50值 忍冬藤浓度 清除率 ic50 vc浓度 清除率 ic50 bht浓度 清除率 ic50mg/ml % mg/ml % mg/ml %0 0 0 0 0 05 19.6 0.1 26.0 0.5 34.510 32.4 0.2 48.1 1 52.015 46.1 17.1 0.3 65.4 0.2 1.5 73.8 0.9820 57.0 0.4 85.8 2 80.025 70.1 0.5 97,7 2.5 80.3 2.2福林酚法2.2.1实验原理： 多酚类物质是植物抗氧化的主要成分之一，忍冬藤中就含有丰富的多酚类物质，其能与福林试剂，在碳酸钠溶液下生成蓝色，多酚类物质含量越高，其在770纳米处的吸光度越高，抗氧化活性越强。通过标准没食子酸标准曲线的绘制，从而确定样品的含酚量。2.2.2 实验过程 a 标准曲线的绘制：称取0.025g没食子酸，定容至500ml,配成浓度为50mg/l的标准液，精密移取0，0.5，1,1.5,2,2.5ml没食子酸标准液于6个比色管中（避光）,加5ml水，2ml福林试剂，4ml碳酸钠。定容至25ml。30度90分钟，在770纳米处测吸光度，绘制标曲线。b 样品的的测定，取忍冬藤1ml的浓度分别为0.2,0.4,0.6,0.8,1mg/ml忍冬藤样品于比色管中，加5ml水，2ml福林试剂，4ml 10%碳酸钠，30度90分钟后，770纳米处测定吸光度。c 实验结果表示：根据样品不同浓度得出的吸光度查的对应吸光度的没食子酸标准曲线，从而计算出样品所含相当的没食子酸含量。算出样品的总酚量用没食子酸表示总酚量，见如下公式 g表示样品吸光度相当的没食子酸量，w表示样品质量 总酚量%=g*100/w2.2.3 结果与分析2.2.3.1 没食子酸吸光度曲线分析： 从表5可知没食子酸的浓度在05mg/l具有较好的吸收范围，得到的曲线具有较好的线性，回归方程为y=0.1026x+0.0032,方差为0.9982表5 没食子酸吸光度值 没食子酸浓度mg/l 0 1 2 3 4 5吸光度值 0 0.106 0.219 0.299 0.421 0.513 2.2.3.2 忍冬藤吸光度曲线分析 表六表明忍冬藤的量在01mg/ml时具有良好的吸收范围并且线性较好，随着忍冬藤的浓度增加，吸光度值也增加，得到的回归方程线性较好为 y=0.5071x+0.0121。方差为0,9968 表6 忍冬藤吸光度值 忍冬藤浓度(mg/ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1吸光度值 0 0.118 0.219 0.329 0.423 0.505 2.2.3.3 结论分析 根据实验结果如表7忍冬藤的总酚含量不是很高，根据各浓度换算得到的1mg忍冬藤所含的酚量为0.512%。所以忍冬藤具有抗氧化能力。但是其抗氧化能力较弱。平均含酚量是衡量抗氧化能力的一个因素，但是除了酚以外还有其他非酚类物质也有抗氧化活性，因此福林酚法不能完全衡量样品表7 忍冬藤含酚量表 忍冬藤浓度（mg/ml) 含酚量% （ 1mg样品所含酚量） 平均含酚量%0.2 0.5380.4 0.5100.6 0.519 0.5120.8 0.5001 0.505 2.3 abts法2.3.1 实验原理： abts法用于测定样品的抗氧化能力，abts即2,2联氮双（3乙基苯基）并噻唑啉6磺酸，它是种水溶性自由基显色剂，abts被活性氧化后可以生成蓝色阳离子自由基abts+.若在其中加入被测抗氧化活性样品，则样品能使abts发生反应，使其褪色，然后可以通过分光光度计在734纳米处检测。颜色越浅，则说明样品的抗氧化能力越强。通过用ve作标准曲线来换算出被测样品抗氧化能力大小。2.3.2 实验方法 a asts标准液的配制，配制7nmol/l的abts 10ml,2.45nmol/l的过硫酸钾10ml，两者溶液混合，加入乙醇缓冲液，在分光光度计上调节吸光度在0.70b 标准曲线，取0,0038g的水溶性维e定容至100ml,配成浓度为150umol/l,配制浓度为0,30,60,90,120,150umol/l，取2.5ml以上浓度的液体，加入abts工作液定容至25毫升，734纳米处测吸光度值，并且绘制标准曲线。c 忍冬藤样品的测定：配制忍藤的溶度为0,2,4,6,8,10mg/ml，各取2.5毫升，加入abts工作液定容至25毫升，在734纳米处测样品的吸光度值，绘制曲线d 结果表示：实验结果用每mg忍冬藤所含的ve当量来表示其抗氧化活性2.3.3 结果与分析3.3.3.1 ve标准曲线分析 表8说明了ve在0150umol/l具有良好的吸光性范围，并且随着ve的浓度越大，吸光度越小，清除率也越大，抗氧化能力越高，图九ve的标准曲线具有较好的线性，回归方程为y=-0.0030x+0.6363,方差为0.9992.。表8 ve吸光度值表 ve浓度（u mol/l) 0 30 60 90 120 150吸光度值 0.629 0.552 0.462 0.368 0.279 0.185 2.3.3.2 忍冬藤吸光度曲线分析 表9表明忍冬藤在010mg/ml时具有较好的吸光度范围，并且随着样品浓度升高，清除率增加。图十说明样品吸光度曲线线性较好，回归方程为y=-0.0603x+0.5855,且方差为0.9840。可能的误差原因为abts工作液时间光分解，所以这点也是实验必须注意的，abts尽量在光线较弱的情况下加入。各浓度样品还有测定吸光度时尽可能保持相同的反应时间。所以在反应结束后测定必须快速。否则就会出现吸光度值的误差。表9 忍冬藤吸光度曲线 忍冬藤浓度（mg/ml) 0 2 4 6 8 10 吸光度值 0.628 0.440 0.320 0.205 0.102 0.01 2.3.3.3 结论分析 表10通过计算不同浓度所对应的相同每毫克忍冬藤所含的ve的当量来得出平均值，为每毫克样品忍冬藤所含的ve当量为0.024umo/mg。远比ve的抗氧化能力弱。本实验也可通过计算清除率来的出忍冬藤的抗氧化活性。所以其原理和实验过程与dpph非常相似。 表10 忍冬藤所含ve的当量 忍冬藤浓度（mg/ml) 1mg忍冬藤所相当ve的量（u mol/vemg) 平均值umolve/mg 2 0.027 4 0.025 6 0.024 0.024 8 0.023 10 0.023 2.4 铁离子螯合能力测定2.4.1 实验原理：抗氧化剂通常可以作为活性氧的淬灭剂，或金属离子螯合剂，自由基受体等方式来阻止自由基链式反应，还可以用来消除脂质过氧化等其他物质的氧化对生物体的伤害。因此测定金属离子如亚铁离子螯合能力的大小也是评价氧化剂抗氧化性能常用的方法。，螫合fe2+能力与抗氧化活性关系非常密切，2价铁能与菲洛嗪“结合形成复合物。在波长562 纳米处具有强的吸收。如果抗氧化样品具有螯合二价fe“作用，则形成的紫色复合物就会减少，吸光度就会减少，因此反应物的吸光度较低，表明抗氧化样品的螯合铁离子的能力较强。2.4.2 实验过程：a 药液的配制：取0.0247g菲洛嗪，定容到25ml。0.035g fecl2,定容到10ml,称取4.2mgedta定容到25毫升。b edta对照曲线的绘制：取不同浓度的edta溶液1ml,加入6.7ml的水，0.2ml的菲洛嗪和0.1ml的氯化亚铁，混合均匀在562纳米处测定吸光度值，用蒸馏水代替样液做空白实验。c 样品的测定：取样品200ml定容至一毫升，加入6.7ml的水，0.2ml菲洛嗪，0.1ml氯化亚铁。混合均匀562纳米处测定吸光值。蒸馏水代替样做吸光度值d 实验分析：实验结果用螯合率来表示样品抗氧化程度的大小，公式见如下 a0表示空白实验的吸光度，a1表示样品的吸光度。参照edta的螯合率来评价样品螯合率的大小，从而得出样品抗氧化能力的大小。 螯合率=(1-a1/a0)*100% 2.4.3 结果与分析： 2.4.3.1 edta参照曲线分析 表11和图12说明了阳性参照物具有非常强的熬和能力。因edta的量非常少即引非常强的螯合效应。在edta的量在0.00340.017范围内，吸光度具有较好的线性。故样品所取的量对应的吸光度应该在此范围内表11 edta吸光度和螯合率表 edta浓度（mg/ml) 0 0.0034 0.0068 0.0102 0.0136 0.017吸光度值 0.603 0.149 0.112 0.069 0.041 0.001螯合率% 100 75.2 81.4 88.5 93.2 98.3 2.4.3.2忍冬藤螯合率结果分析 ： 结合表12 样品与edta螯合率的比较发现，edta浓度越高，螯合率液越高，抗氧化能力也是越高，但是由于edta是很强的螯合剂，所以需要的量很少。而样品忍冬藤的螯合能力远不如edta的螯合能力 当忍冬藤的样品浓度达到200mg/ml时与0.0034mg/ml的edta螯合率相同，故edta螯合能力是忍冬藤样品的58823倍。100mg忍冬藤所相当edta的量为0.0017mg。螯合铁离力较弱 。表12 忍冬藤螯合率表 忍冬藤浓度(mg/ml) 吸光度值 螯合率% 100mg忍冬藤所相当edta( mg/100mg) 200 0.148 75.1 0.00172.5 还原力测定方法2.5.1 实验原理： 本实验主要利用抗氧化样品的还原作用能使铁氰化钾还原为亚铁氰化钾后，亚铁氰化钾能与三价铁离子反应生成普鲁斯蓝，在700纳米处有最强吸收峰，测定其其吸光度值，吸光度越高，则样品的还原能力越强，用vc来做参照曲线，来衡量样品忍冬藤的抗氧化能力大小。2.5.2 实验方法：a pbs缓冲液的配制，配磷酸氢二钠溶液0.2mol/l和磷酸二氢钠0.2mol/l溶液100ml,混合后在ph计上调节ph至6.6 现配现用。b 标准曲线绘制：配制浓度为20,40,60,80,100ug/ml的标准vc溶液，取该溶液1ml加入2.5mlpbs标准液，加入2.5ml1%铁氰化钾，加热20分钟，然后迅速冷却，加入2.5ml的10%tca溶液，3000转离心十分钟，取上清液2.5毫升，加入蒸馏水2.5毫升，加入0.5ml0.1%的三氯化铁，充分反映10分钟，700纳米处侧吸光值，绘制标准曲线。c 样品的测定取1ml忍冬藤样品提取物，取该溶液1ml加入2.5mlpbs标准液，加2.5ml1%铁氰化钾，50加热20分钟，然后迅速冷却，加入2.5ml的10%tca溶液，3000转离心十分钟，取上清液2.5毫升，加入蒸馏水2.5毫升，加入0.5ml0.1%的三氯化铁，充分反映10分钟，700纳米侧吸光值d 结果处理 根据样品的吸光度值可以在标准的vc曲线上找到对应的vc浓度，结果用每毫克品中含有的vc的量来确定其抗氧化活性的大小。2.5.3 结果与分析2.5.3.1 vc标准曲线分析 表13表明vc的浓度在0100ug/ml时具有较好的吸光度值范围，并且随着vc浓度的增大，吸光度值变大。图14的vc吸光度曲线线性较好，回归方程为y=0.0060x0.0204。方差为0.995表13 vc吸光度表 vc浓度（u g/ml) 0 20 40 60 80 100 吸光度值700um 0 0.080 0.205 0.350 0.473 0.580 2.5.3.2 仍冬藤吸光度曲线分析： 表14样品浓度在020mg/ml时具有较好的吸收范围，并且随着样品的浓度增大，吸光度增大。图15表明样品忍冬藤在此浓度区间下具有较好线性的回归方程。方程为y=0.0342x0.0234。且方差为0.9962。 表14 忍冬藤吸光度表 忍冬藤浓度（mg/ml) 0 4 8 12 16 20吸光度值700um 0 0.1 0.23 0.384 0.529 0.67 2.5.3.3 结论分析 从表15分析来看，忍冬藤的总还原能力还是比较强。但是从数据分析看来维生素c的抗氧化活性远远大于忍冬藤。1mg忍冬藤所相当的维生素含量为5.42ug.。并且此方法比较直观和彻底的把忍冬藤所含的所有抗氧化活性成分换成vc当量。直观的反映出忍冬藤的抗氧化能力的大小。因此在实验室中广泛应用。表15 忍冬藤所含vc当量表 仍冬藤浓度(mg/ml) 1mg忍冬藤相当vc的量ug/ml 平均值ug/ml 4 5.181 8 5.21 12 5.46 5.42 16 5.72 20 5.73 总结 中草药的抗氧化活性研究方法最常用的即dpph,福林酚法，abts,铁离子螯合，还原力测定。通过具体忍冬藤的实验表明其具有明显的清除自由基的能力。通过dpph法测定出忍冬藤的抗氧化能力比vc和bht弱，但是其抗氧化能力随着浓度的变化线性较好。忍冬藤ic50的值为17.1。vc的ic50值为0.2 ，bht的ic50值为0.98。由此实验初步得出了忍冬藤具有清除自由基能