HBVHCV高精度核酸检测技术的临床意义ppt课件

肝炎病毒 PCR检测技术国内现状及最新进展 暨 HBV/HCV高精度核酸检测技术的临床意义 1 主要内容 Part 荧光定量 PCR技术简介 Part HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 Part 临床对 HBV/HCV检测技术的需求 Part HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 2 Part PCR技术简介 3 病原学检测常用的实验室技术 细胞培养与鉴定（ “金标准 ”）、动物实验 血清学、免疫学诊断技术 电镜技术 分子生物学诊断技术 PCR PCR技术简介 4 多聚酶链式反应多聚酶链式反应 （ PCR： Polymerase Chain Reaction) Polymerase: DNA聚合酶聚合酶 PCR技术简介 5 核裂变链式反应 “链式反应 ”改变世界 PCR技术简介 6 PCR技术的诞生技术的诞生 Kary B. Mullis（穆利斯（美） 1971： Khorana等提出在体外经 DNA变性、引物 杂交 ,再用 DNA聚合酶延伸 DNA的设想。 1983： Mullis发明了 PCR技术 ,使 Khorana的设想得到实 现。 1988：耐热 DNA聚合酶（ Taq）引入了 PCR技术 1993： Mullis荣获 1993年度诺贝尔化学奖。 PCR技术简介 7 Kary B. Mullis（ 1944） The New York Times as “highly original and significant, virtually dividing biology into the two epochs of before P.C.R. and after P.C.R.“ PCR技术简介 8 PCR技术简介 PCR原理： 实质就是体外基因复制技术 9 PCR技术简介 30次循环后靶序列扩增的数量 10亿 10 PCR技术分类 常规 PCR 在 PCR结束后对终点产物进行分析。 巢式 PCR 多重 PCR PCR结合限制性长度多态性分析（ PCR-RFLP） PCR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（ PCR-ASO） PCR结合变性梯度凝胶（ PCR-DGGE） PCR结合的单链构象多态性（ PCR-SSCP）等分析技术 荧光定量 PCR（ real-time PCR) 通 过荧光染料或荧光标记的特异性的探针 ,对 PCR产物进行标 记跟踪 ,实时在线监控反应过程 ,结合相应的软件可以对结果进行 分析 ,计算待测样品的初始模板 量。 实时检测 PCR扩增，在扩增的 指数期 对起始模板进行定量。 PCR技术简介 11 荧光定量实时荧光定量实时 PCR与普通与普通 PCR的比较的比较 实时在线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控对样品扩增的整个过程进行实时监控 ,能够实时地观察到产物能够实时地观察到产物 的增加的增加 ,直观地看到反应的对数期直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合 ,提高了提高了 PCR反应反应 的的 特异性特异性 增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控全程监控 ,准确的算法进行定量准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便结果分析更加快捷方便 ,无需跑胶无需跑胶 PCR技术简介 12 1、 目的基因的克隆： PCR技术为在重组 DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。 2、 基因的体外突变 ： 可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 PCR的应用 3、 DNA和 RNA的微量分析 ： PCR技术高度敏感，对模板的含量要求很低，是 DNA和 NA微量分析 的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足 PCR的 检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。 4、 基因转录水平检测 RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平 5、 基因突变分析： 利用 PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。 PCR技术简介 13 Part HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 14 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 乙型肝炎检测标志物 HBsAg, 抗 -HBs, HBeAG,抗 -HBe, 抗 -HBc（ IgG,IgM） , HBV-DNA 15 DNA 4-12周 1-2周 2周 3月 3 6月 潜伏 期 急性 早期 潜伏 后期 急性期 康复期 痊愈 标 志 物 相 对 浓 度 有传染性 可能有传染性 有免疫力 血清学 转换期 HBsAg HBeAg Anti-HBc Anti-HBc IgM Anti-HBe Anti-HBs 急性乙型肝炎各项生理指标 周 周 周 月 月 潜伏 期 急性 早期 潜伏 后期 急性期 康复期 痊愈 标 志 物 相 对 浓 度 有传染性 可能有传染性 有免疫力 血清学 转换期 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 16 免疫学检测 生物化学检测 组织学检测 分子生物学检测 基因芯片 乙肝病毒的检测方法 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 17 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 HBV分子生物学检测 HBV-DNA 基因耐药突变检测 基因分型 HBVcccDNA HBV前 C及核心启动子变异 18 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 检测种类 检测方法 临床意义 HBV-DNA检测 实时荧光定量 PCR 确诊 HBV感染 bDNA 病始治疗方案确定 竞争 PCR 治疗过程动态监测 杂交捕获 抗病毒治疗选择及监测 预后评估 基因耐药突变检 测 PCR产物直接测序 可提高初始治疗效果 焦磷酸测序 克隆测序 可预防或延缓核苷类似物耐药变异 反向线性杂交 PCR-RFLP 耐药变异出现后联合治疗可预防多重耐药变异出现 基因芯片 HBV分子生物学检测方法及临床意义 19 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 检测种类 检测方法 临床意义 基因分型检测 同上 鉴别 HBV病毒 A-H8个基因型 各型与临床转归及抗病毒治疗反应不同 前 C区及核心区启 动子（ BCP） 突变检测 同上 与疾病预后有关，肝硬化及原发肝癌中均高 发生核苷酸类似物耐药突变的危险因素 cccDNA检测 序列特异引物 -跨 reDNA双 缺口 PCR 病毒复制中，双螺旋切口补齐，行程 cccDNA，它是 HBV前基因组 RNA的转录模板，对 HBV复制及感染 有重要意义 Southern印迹杂交 HBV分子生物学检测方法及临床意义 20 HCV的感染模型 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 21 丙肝病毒的检测方法 血清生化学检测 HCV抗体检测 HCV核心抗原检测 HCV RNA 检测 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 22 检测种类 检测方法 临床意义 HCV-RNA检测 RNA-cDNA-PCR 定性检测 确诊 HCV感染（特别是移植、血透、 HIV合并） 血筛（输血、生物制品） 直接 RNA扩增（ NASBA） 定量检测 初始治疗依据 治疗检测、疗效评估、方案调整 实时荧光定量 PCR 预后评估（基线水平、 RNA变化） 基因分型检测 PCR产物直接测序 焦磷酸测序 鉴别 HBV病毒 A-H8个基因型 克隆测序 liPA(可分 5-10%混合型 ) 各型与临床转归及抗病毒治疗反应不同 PCR-RFLP 基因芯片 耐药检测 同上 可提高初始治疗效果 可预防或延缓核苷类似物耐药变异 耐药变异出现后联合治疗可预防多重耐药变异出现 HCV分子生物学检测方法及临床意义 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 23 目前国内外乙肝主流基因诊断技术比较 除个别公司产品外，国内的检测技术在方法学、灵敏度以及准确性方面一般都远远落后于发达国家 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 24 常用 DNA类标本处理方法 煮沸法 柱提取 磁珠法 一 二 裂解方法 煮沸 煮沸 化学裂解 化学裂解 分离方法 离心 离心 亲和吸附 吸附或杂交 步骤 1. 煮沸裂解 2. 离心，去除 大分子的抑 制物 3. 取上清扩增 1. 加入沉淀剂 2. 离心弃上清，浓 缩标本并去除小 分子抑制物 3. 煮沸裂解 4. 离心，取上清扩 增，去除大分子 抑制物。 1. 化学裂解 2. 过柱吸附 3. 洗涤 4. 洗脱 5. 取洗脱液扩增 1. 化学裂解 2. 加磁珠吸附 3. 洗涤 4. 洗脱 5. 取洗脱液扩增 抗干扰能力 差 较差 好 最好 提取物组分 较小分子量的混 合物 与核酸相似分子量的 混合物 全核酸 特定病原的核酸 自动化程度 手工 手工 手工或自动 半自动或全自动 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 25 常用 RNA类标本处理方法酚 -氯仿提取 柱提取 原 理 液相萃取 硅胶吸附 步 骤 1、标本加裂解液加 氯仿混匀，静置数分 钟 2、高速低温离心 10- 15分钟 3、取上清加异丙醇 4、高速低温离心 10- 15分钟 5、弃上清，酒精洗 涤 6、高速低温离心 5- 10分钟 7、弃上清，晾干 8、加水，水浴，取 样上机检测 1、标本加裂解液加去抑 制剂等混匀，热裂解 10分 钟。 2、加入无水乙醇沉淀核 酸 3、整体移入柱，离心甩 干或负压抽干 4、加入洗涤液 1，离心甩 干或负压抽干 5、加入洗涤液 2，离心甩 干或负压抽干 6、加入洗脱液，高速离 心 1分钟 7、取洗脱下来液体上机 检测 优 点 最经典提取方法 核酸纯度高，无需高速离 心 不 足 操作繁琐，设备和人 员操作要求高。低病 毒载量标本检出率低 。 需频繁更换离心管，核酸 丢失率高，特异性差。 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 26 高灵敏度的磁珠核酸纯化方法的比较 比较项 目 圣湘磁珠法 常规磁珠法 备注 更换 EP 管 无需更换 更换 2-3次 操作简 化 裂 解 1管裂解液、 室温 多管裂解液（ 加热） 操作简 化 洗 涤 1次完成 洗涤 3-4次 操作简 化 核酸洗 脱 无需洗脱 加热 洗脱 操作简 化 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 27 （圣湘）磁珠法 HBV产品与国内外主流产品的比较 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 28 圣湘磁珠法 HCV产品与国内外主流产品的比较 25 IU/ml HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 29 不同方法的 HBV DNA检测下限以及不同标准要求 比较项目 检测下限 线性范围 备注 卫生部要求 1000IU/ml 1000IU/ml-1E8IU/ml 常规煮沸法 500IU/ml 500IU/ml-1E8IU/ml 手工操作 圣湘磁珠法 10IU/ml 20IU/ml-2E9IU/ml 手工操作 罗氏磁珠法 12IU/ml 30IU/ml-1.1E8IU/ml 需要罗氏全自动 核酸提取工作站 美国肝病协会建议 10IU/ml 推荐罗氏 HBV试 剂 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 30 国内大部分检测试剂灵敏度 1000Copies/ml ，特异性、准确性等方 也存在着严重缺陷，远 远不能满足临床检测和用药监控的需求，这也是 国内 HCV研究进展缓慢的重要原因之一。 HBV/HCV核酸检测技术现状及进展 31 Part 临床对 HBV/HCV检测技术的需求 32 l “ 2008年美国肝病协会 CHB防治指南 ” ：持久消除 HBV是乙肝 的治疗终点， HBV DNA病毒载量尽可能小于或等于 10 IU/ ml。 临床对 HBV/HCV检测技术的需求 33 “ 欧洲肝病研究学会 EASL2010年指南 ” 指出：采用荧光实时 PCR 方法检测 HBV DNA时，其灵敏度要小于或等于 10-15 IU/ ml。 临床对 HBV/HCV检测技术的需求 34 “ 欧洲肝病研究学会 EASL2011指南 ” 还指出：丙肝患者治疗的 终点是 HCV RNA病毒载量低于 50 IU/ ml。 临床对 HBV/HCV检测技术的需求 35 研究表明国产 PCR试剂的灵敏度很难达到上述要求 五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较 ,中华传染病杂志， 2009年 第 3期 吴星 ,黄维金 , 周诚 ,庄辉 等 (中国药品生物制品检定所 ,北京大学医学部 ) 临床对 HBV/HCV检测技术的需求 36 国内行业指导原则国内行业指导原则 国家 SFDA技术审评中心 HBV DNA定量试剂技术审 评指导原则 中指出： HBV DNA最低检测限应 30IU/ml 临床对 HBV/HCV检测技术的需求 37 国产很多乙肝 PCR试剂的灵敏度为 500IU/ml至 1000IU/ml之 间，丙肝试剂的灵敏度为在 1000IU/ml以上。 从病毒性肝炎的早期诊断及适时确定治疗终点的临床需求 看，现有的国产 PCR试剂需要提高检测灵敏度。 国内现状国内现状 临床对 HBV/HCV检测技术的需求 38 Part HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 39 100,00010,000- 99,999 病 人 (%) 13年随 访 累 积 肝癌的 发 生率 1 (N = 3653) 50 40 30 20 10 0 1.3 1.4 3.6 12.2 14.9 13年随访累积肝硬化 的发生率 2 (N = 3582) 4.5 5.9 9.8 23.5 36.2 300 300- 999 1000- 9999 300 300- 9999 10,000- 99,999 100,000- 999,999 1 million HBV DNA基线水平（ copies/ml） HBV DNA基线水平较高增加肝硬化和肝癌的风险 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 40 持续高 HBV DNA水平和肝癌发病增加相关 baseline HBV DNA 104 105 105 105 随 访 HBV DNA - 104 104 to 105 105 调 整参照 (95% CI) 1.0 (参照 ) 3.6 (1.7-7.6) 6.9 (3.4-13.8) 9.1 (5.8-14.1) P 值 - .001 .001 .001 包括 104 copies/mL (n = 1376) 0 2.0 x 103 4.0 x 103 6.0 x 103 8.0 x 103 1.0 x 104 1.2 x 104 1473 5882 8730 10108 肝癌 发 生率 每 100,000 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 41 P 0.001 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0.8 0.85 0.9 0.95 1.0 随 访 年限 106 cpm 105-106 cpm 104-105 cpm 存活 300 cpm 300-104 cpm 高 HBV DNA水平预示长期肝相关死亡率风险 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 42 乙肝的治疗 u慢性乙肝的诊断 1. HBsAg持续阳性 6个月以上 2. HBV-DNA高于 105拷贝 /毫升 3. ALT持续升高或反复升高 u慢性乙肝的分类 1. HBeAg阳性乙肝： HBsAg、 HBeAg阳性； HBV-DNA高于 105拷贝 /毫升； ALT持续升高或反复 升高 2. HBeAg阴性乙肝： HBsAg、 anti-HBe阳性； HBV-DNA高于 104拷贝 /毫升； ALT持续升高或 反复升高 u慢性乙肝治疗的目标 病毒抑制：表现为 HBeAg血清转换和 HBV-DNA阴转 肝损伤程度降低：表现为转氨酶恢复正常 完全清除病毒：表现为 HBsAg消失， HBsAb出现，血清和肝细胞中检测不到 HBV-DNA，从目 前水平来看，不可能完全清除病毒 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 43 临床检测 HBV DNA启动抗病毒治疗，连续定量 HBV DNA是病人 治疗前评估的关键！ HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 44 ALT：谷丙氨酸转氨酶 ULN：正常值的上限 LT：肝移植 慢性乙型肝炎 HBeAg阳性病人治疗指南（ 亚太肝病研究会 2008年） HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 45 慢性 乙型肝炎 HBeAg阴性病人治疗指南 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 46 慢性乙型肝炎肝硬化病人治疗指南 ETV：恩替卡韦 LAM：拉米夫定 Ldt：替比夫定 ADV：阿德福韦 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 47 上图为采用罗氏公司 Cobas Taqman Amplicor HBV DNA定量 PCR试剂时治疗路线图 替比夫定治疗慢性乙型肝炎中国路线图 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 48 部分 HBV DNA定量试剂检测性能比较 性能 COBAS AmpliPrep/ COBASTaqMan HBV 检测性能 圣湘磁珠法 HBV 核酸定量试剂 检测性能 国产 A试剂 HBV 核酸定量试剂 检测性能 临床意义 灵敏度 12 IU /ml( 70 copies/ml) 10 IU /ml( 60copies/ml) 500 IU /ml( 2800copies/ml) EASL建议的治疗终点为 10 15 IU/ml,高灵敏度 ,帮助医生科学 判断治疗结束时机 动态范围 54-1.110 8IU/ml 20-2.010 9IU/ml 500-1.010 8IU/ml 在宽泛的线性范围下，才能够在治疗 的开始和治疗过程中，正确的评估疾 病的状态和严重性，正确指导临床医 生制定有效的治疗方案，及时发现耐 药以及调整治疗方案，预测疾病发展 风险 精密度 0.20 log 10 0.30 log 10 无具体实验数据 选用精密度高的试剂，能够减少 检测次数，从而减轻患者的总体 治疗费用 内标监测 有 有 无 选用带内标的试剂，能够有效监测假阴性，从而减少漏报结果 HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义 49 注： 检 出限 为 100Copies/ml 治疗应当名称 描述 快速病毒学应答（ RVR） 4周时未检测到 HCV RNA 早期病毒学应答（ EVR） HCV RNA拷贝数下降 2log10（与基线水平比较），或者 12周时未检 测到 HCV RNA 完全早期病毒学应答（ cEVR） 没有 RVR，但 12周时未检测到 HCV RNA 部分早期病毒学应答（ pEVR） 没有 RVR， 12周时 HCV RNA拷贝数下降 2log10（与基线水平比较）， 但仍检测到 HCV RNA 没有应答 12周时 HCV RNA拷贝数下降 2lo