抗过敏益生菌唾液乳杆菌pm-a0006调节过敏体质抗过敏

J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 1108011086 Heat-Killed Cells of Lactobacilli Skew the Immune Response Toward T Helper 1 Polarization in Mouse Splenocytes and Dendritic Cell-Treated T Cells 论：热杀死抗过敏乳酸菌唾液乳杆菌 PM-A0006 调节过敏体质抗过敏 摘要 乳酸菌为人类及哺乳类肠胃道中的共生菌之一，已被认定为益生菌，对 于维持宿主健康扮演着重要的角色，包括了其对于免疫功能的调节。目前大 部分的研究皆比较着重于乳酸菌的活菌体 (viable cell)对于免疫调节作用的 影响，而本实验则主要是在于乳酸菌热杀死菌体的影响。我们藉由将三株热 杀死乳酸菌 L. acidophilus A2、L. gasseri A5 和 L. salivarius A6 与脾脏细胞 共同培养，来探讨此三株热杀死乳酸杆菌对于免疫功能所产生的影响。另一 方面，我们亦将三株热杀死乳酸菌刺激树突细胞后，以观察 T 细胞的免疫 反应。由实验结果显示三株热杀死乳酸菌证实能刺激小鼠的脾脏细胞增生 和 interleukin (IL)-10、IL-12 p70 和 interferon (IFN)- 之分泌，但对 transforming growth factor (TGF)- 无影响。另外，三株热杀死乳酸菌亦能刺 激小鼠的树突细胞分泌高量的 IL-12 p70，且由提高 IFN- 分泌，非 IL- 5、IL-13 及 TGI- 之结果显示，T 细胞的免疫反 应趋向 Th1。以上结果显示 乳酸杆菌 (lactobacilli) 对于调节免疫机能及过敏反应扮演了重要的角色。 KEYWORDS: Lactobacillus; splenocytes; dendritic cells; T helper 1; cytokines 前言 益生菌被定义为“活菌，能在固有的营养条件下，增 进健康”(1)。乳酸杆 菌是人和哺乳动物胃肠道的共生微生物的成员之一，通常被认定为益生菌 (2,3)。肠道乳酸菌一般被认为对于宿主的免疫反应之调节，扮演着一个重要 的角色(1,4-6)。乳酸菌具有影响 肠周边免疫系 统的功能(5,7)。在肠道中，乳 酸细菌细胞壁的组成成分在刺激免疫活性的细胞扮演一个重要的角色 (4,5,8,9)。 位于肠中的乳酸菌，包括各种乳酸杆菌，可交互调控肠中的一些细胞， 包括抗原呈现细胞(APCs)以及小肠上皮细胞 (intestinal epithelial cells)(10-12)。 近期的一些报告中也指出，乳酸菌可能可调控免疫路径 Th1 与 Th2 之间的 平衡，有助于减轻过敏反应 1(5,13-15)。一般 认为是靠一些特殊的免疫细胞 产生的细胞激素，例如：IL-10 和 TGF-，来保持这样的平衡(16,17)。而大部 份的研究主要针对活的乳酸菌在免疫调节上之影响，而本篇研究则是研究 经热杀死的乳酸菌。其拥有保存期限长、贮存方便、便于运输等优点。 图一： 热杀死乳酸杆菌对小鼠脾脏细胞增生之影响。柱状图分别代表脾脏细 胞对不同热杀死乳酸菌、PHA 或无刺激物之 结果，其中后两 项为实验对照 组。数据资 料计算结果为平均数标准差(个数=3，p0.05) 由骨髓中衍生的树状细胞(Dendritic cells, DC)，是引发适应性免疫对抗 外来病源的专一性抗原呈现细胞(18)。未成熟的树状细胞藉由血液的流动进 入非淋巴组织里，例如皮肤和黏膜，来捕捉和呈现抗原。然后移到淋巴腺器 官，例如淋巴结、脾 脏 和黏膜伴生的淋巴组织(mucosal-associated lymphoid tissues, MALT)，其中他们失去抗原加工活性并且成熟为强有力的免疫刺激 细胞(18,19) 。在肠黏膜中之树状细胞可能由乳酸菌调控，包括肠中原有的共 生菌和经由口服(administered orally)入内的(20)。他们在 Peyer 氏斑间接通 过 M 细胞(21)，与乳酸菌交互作用，且绕过紧连的上皮中进入小肠内腔直接 与乳酸菌作用(22)。而树状细胞藉由这些微生物的刺激而变成熟，包括上游 调节共激分子(costimulatory molecule)以及 cytokines 和 chemokines 的分泌， 以及提供各种 T 细胞的免疫反应。举例来说，树状细胞上游调节了共激分 子 CD80(B7-1)和 CD86(B7-2) 及产生 IL-12，造成 Th1 路径反应(23)。 他们 也生产 IL-4 和 IL-10，促进 Th2 路径或 Treg 反应(24-26) 。 以人类及老鼠的试验中显示，乳酸菌能有效的刺激产生 IL-12 以及 IFN-，并且调整免疫反 应(13,14,27)，它能调 控树状细胞表面的分子表现和 cytokine 的分泌(28-30) 。口服和原本在 肠道中的乳酸杆菌，是十分相近于肠 黏膜中之树突细胞，藉此产生 Th1、Th2 和 Treg 路径的免疫调控。在本文中 将探讨三种经热杀的乳酸菌在小鼠脾脏细胞增生以及 cytokine 产生的现象 做探讨。同 时我们也对于 T 细胞的影响做探讨。 材料与方法 乳酸杆菌的处理：本研究所使用的三种乳酸杆菌由位于台南科学园区， 东宇生物技术股份有限公司所提供，分别为经由热杀死的 Lactobacillus acidophilus PM-A0002 (A2), Lactobacillus gasseri PM-A0005 (A5),以及 Lactobacillus salivarius PM-A0006 (A6)。在热处 理之前，分别以 MRS 培养基， 37培养 16 小时，经离心(2000g 10min)后，使用去离子水洗 涤两次，悬浮 于 phosphate-buffered saline(PBS; 0.85% NaCl, 2.68 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.76 mM KH2PO4 at pH 7.7)溶液中，之后以 100煮沸 15 分 钟杀死。 DC 的备制：小鼠 DC 来源是由国家实验室动物中心( 台北，台湾)购买 的 6 至 10 星期成熟母鼠(BALB/c) 骨髓中取得，经 PBS 洗涤两次后，将细胞 数以 RPMI-1640(含 10%FBS、GM-CSF 及 IL-4)调整成 1*106cell/mL，放入 24-well 培养皿中培养 6 日，期间 23 日更换一次培养基。 脾脏细胞和 T 细胞的备制：来源是使用 BALB/c 母鼠，采断颈法牺牲后， 在无菌环境取出脾脏，加入 Ficoll-Hypaque 后以 400 g，离心 30 分钟。位于 低密度的部分，约 42.550%的介面，从其中分离出 单一细胞悬浮于 PBS 中 取出脾脏，加入 Ficoll-Hypaque 后以 400 g，离心 30 分钟。位于低密度的部 分，约 42.550%的介面，从其中分离出 单一 细胞悬浮于 PBS 中。CD4+ T 细 胞的纯化采用 Miltenyi Biotec.,Auburn, CA 所制造的极性抗体和毫米磁珠系 统纯化收集，之后将纯化的小鼠 CD4+ T 细胞培养在含有 10% FBS 的 RPMI-1640 培养基中， 调整细胞数量成 2*106 cell/mL，放入 96-well 培养皿 中。 乳酸杆菌刺激脾脏细胞：将细胞调整成 4*105 cell/mL 后，跟热杀死的 乳酸菌以 1:3 的比例，于 37高湿度、5% CO2 的环境下共同培养 24、48、72 小时和 5 日。以 1 g/mL PHA 当作 对照组。经 24、48、72 小时的 培养后，取上层液利用 ELISA 分析 IL-10, IL-12 p70,IFN-, and TGF- 的分 泌量；而培养 5 日后，则使用 MTT 来分析脾脏细胞的增殖情况。 乳酸杆菌刺激树状细胞：将细胞调整成 1*106 cell/mL 后，跟热杀死的 乳酸菌以 1:10 的比例，于 37高湿度 5% CO2 的环境下共同培养 24、48、72 小时。以 0.1 g/mL LPS 当作对 照组。经 24、48、72 小时的培养 后，取上清液，以 ELISA 分析 IL-4、IL-10 及 IL-12 p70 之分泌量。并以抗生 素(mitomycin C, 25 g/mL)，37处理 1 小时 ，让 DC 停止生长。 图四： 经由热杀死乳酸杆菌处理 DC，对 T 细胞增生的影响。柱状图分别代表， 树状细胞以热杀死处理之乳酸菌、LPS 或无刺激 时，与 T 细胞共培养 24、48、72 小时的结果。数据资料计算结果为 平均数 标准差(个数 =3，p0.05)。A-C 分别 代表不同的经不同物 质刺激后，所得到的数据在统计 上是否归类为同一种类的表现；而 X 与 Y 分别代表不同的时间点，所得到 的数据在统计上是否归类为同一种类的表现。 经乳酸杆菌所处理后的 DC 来刺激 T 细胞：停止增生的 DC 与 T 细胞 以 1:10 的比例，于 37高湿度 5% CO2 的 环境下共同培养 2 和 5 日。收集 培养 2 日的细胞上层液，利用 ELISA 分析 IL-5、IL-13、IFN- 以及 TGF- 之分泌量；而培养 5 日的细胞，则使用 MTT 来分析 T 细胞的增殖情况。 统计分析： 数据所代表的是平均数标准差(meanSD)，样本数为 3(n=3)，统计的 比较是藉由 Duncans multiple-range test 之变异数来分析，p 值少于 0.05 被 认为统计上有差异性。 结果： 乳酸杆菌促进脾脏细胞的增生：三种经过热杀死的乳酸菌，包括 L. acidophilus A2, L. gasseri A5, 和 L. salivarius A6，被测试用来引发脾脏细胞 的增生能力(图一) ，PHA(1g/mL)为此试验的正对照组。结果显示相对于负 对照组，L. salivarius A6 有效地诱导脾脏细胞之增生(约增加了 11 倍)。 诱导脾脏细胞来促进细胞激素的产生：为了确定这些热杀死的乳酸菌 是否增进脾脏细胞分泌细胞激素，因此分析了脾脏细胞与热杀死乳酸菌共 培养 24、48、72 小时之后，上层液所含 IL-10、IL-12p70、IFN-、TGF- 的量 (图二 )。以 PHA(1g/mL)当作正对照组。结果显示三种菌都能诱导 IL-10 的 分泌(图二 A)；但是远低于 IL-12p70 的量(图二 B)。三种菌均 对小鼠的脾脏 细胞产生很强的刺激，分泌大量的 IL-12p70，而在图 2C 显示，只有 L. salivarius 对于产生 IFN- 较显着(图三 C)。L. acidophilus 的试验组在 24 小 时的培养下，能测得较高的 IFN- 生成量；L. gasseri 和 L. salivarius 则以 48 小时的培养下得到较高。然而与负对照组的比较中发现，此三种热杀死乳酸 菌对脾脏细胞产生 TGF- 则没有明显的作用(图二 D)。 促进树状细胞产生细胞激素：为了确定这些热杀死的乳酸菌是否增进 树状细胞分泌细胞激素，因此分析了树状细胞与热杀死乳酸菌共培养 24、48、72 小时后，上层液所含 IL-4、IL-10、IL-12p70 的量(图三) 。以 LPS 当作正对照组。结果显示，培养 48 小时的条件下，任合一组所测试出的 IL- 4 量均低于负对照组(图三 A)；但在 24 和 72 小时均未侦测到(p0.05)。而 IL-10 的变化，在三个时间点观察下，各组差异均不大(图三 B)；相对的，IL- 12p70 则都有极高的表现量(图三 C)。 菌处理的树状细胞刺激 T 细胞增殖：为了测试成熟的 DC 是否可活化 T 细胞， DCs 先经这些 热杀死的乳酸菌刺激后，再与 T 细胞共同培养 5 天。 结果显示(图 四) ，在共同培养 24 小时的条件下，T 细胞的数量的确增加许多 (增加 约 23 倍)。在 48 小时或 72 小时后的观察下发现，除了经由 L. gasseri 处理的试验组外，其余均比负对照组高出约 1.5 倍。 菌处理的树状细胞诱导 T 细胞分泌细胞激素：进一步确定 T 细胞所分 泌细胞激素的种类，我们收取培养 2 日后的上层液，分析 IL-5、IL-13、IFN- 以及 TGF- 的生成量(图五)。结果发现 IL-5 的量没有明显的改变(图五 A)， 而 IL-13 的量也远低于 负对照组( 图五 B)。然而，经过乳酸杆菌刺激后的 DC 与 T 细 胞共同培养，却可刺激 T 细胞产生 IFN-(图五 C)，当 T 细胞以 L. acidophilus 或 L. salivarius 处理的树状细胞刺激 24 小时及 L. gasseri 处理的 树状细胞刺激 48 小时下，有高的 IFN- 被 产生。至于 TGF-，除了 L. gasseri 的组别在 24 小 时观察下，量略低以外，其余组别之间在统计上无明 显差异( 图五 D)。 讨论： 包含新型抗过敏乳酸菌菌株组合物（康敏元益生菌），目前已知道对于 健康有很多益处，例如：免疫调节，改善过敏体质。多数研究集中于探讨抗 过敏乳酸菌或其细胞壁萃取物对于免疫的调节作用；然而，本篇在于探讨热 杀死乳酸菌的研究。 过敏反应是由于 Th1/Th2 间之平衡被破坏使反 应趋向 Th2 免疫反应 (31)，巨噬 细胞(Macrophage) 的 IL-12，与 T 细胞衍生的 IFN- 为 Th1 路径下 所产生的 cytokines，它可以增进细胞免疫反应的调节。IL-12 刺激 T 和 NK 细胞产生 IFN-，并且促进未成熟 CD4+ T 细胞进入 Th1 的分化路径(32,33)。 IFN- 亦增加 IL-12 的 产生，并减低 Th2 路径 细胞的增殖与活化，提高体液 免疫能力(34)。 IL-10 和 TGF- 为免疫抑制的 cytokines，能抑制作用 T 细胞 (effector T cell)的活性与能力，例如 Th1 和 Th2 细胞。 他们在 Treg 细胞族 群的分化和作用也扮演一个重要角色(16,17)。本研究结果显示，根据 IFN- 在脾脏细胞的产生结果，L. salivarius 可以促进小鼠脾脏细胞的大幅度增生， 但是 L. acidophilus 和 L. gasseri 只有小幅度增加。然而，三种乳酸杆菌刺激 脾脏细胞所得到的结果显示，均产生高量 IL-12p70；但 IL-10 的表现量相对 较低，TGF- 甚至侦测不到表现，这样显示乳酸菌强烈刺激脾细胞偏向 Th1 的路径反应(35)。利用 L. casei Shirota 也能刺激脾脏细胞产生 IL-12 和 IFN- (27)。也有报告指出，定时摄取乳酸杆菌可以增加鼠 类脾脏细胞产生 IFN- ，但 对于 IL-4 或是 IL-5 则没有影响(36,37)。 所以肠道中的乳酸菌可以透过肠中的 DC 来调节免疫功能。DC 如果产 生 IL-12，则 造成 Th1 反应(23) ，同样的如果 产生 IL-4 和 IL-10，则促进 Th2 或 Treg 反应(24-26)。由 Th2 细胞所分泌的 IL-5 和 IL-13 来恢复粒状效应细 胞，例如嗜酸性、硷性及柱状细胞(mast cell) 在过敏发炎部位的作用(38,39)。 在这项研究中，三种热杀死乳酸菌能引起小鼠 DC 分泌 IL-12p70，但是 IL- 10 及 IL-4 则较无影响。以乳酸菌处的树状细胞有促进 T 细胞的增殖，及 增加 IFN- 的表现量，此代表成熟的 DC 经 乳酸杆菌的刺激，将 T 细胞免疫 反应趋向 Th1 路径。Mohamadzadeh 等人指出 (29)，L. johnsonii, L. reuteri, 和 L. gasseri 可刺激人 类单核球树状细胞 (monocyte derived DCs)产生 IL- 12，而非 IL-10，显示将免疫路径导向 Th1。但有文献指出 L. casei 与 L. plantarum Lb1 刺激小鼠 DC 强烈引起 IL-12 的生成；而 L. reuteri DSM12246 却是引起 IL-10 的生成 (28)。近来也有报导指出 L. acidophilus 与 L. paracasei 能强烈刺激人类单核球树状细胞产生 IL-12(30)。所以到底是么机 制造成各种乳酸杆菌在树状细胞上产生不同的反应，目前仍未知，但在免疫 调节的反应上造成的差异,可以推断于几个原因，例如使用的不同的乳酸细 菌和人或老鼠免疫细胞。根据早先观察和我们的结果，推断乳酸菌所诱导产 生之细胞激素与乳酸菌菌种有关。 本研究发现，经热杀死的乳酸杆菌在体外试验中有免疫调控能力。在大 鼠身上，经热杀死处理之 L. plantarum L-137 会诱导 IL-12 和 IFN- 的产生， 并抑制因 IL-4 之诱导而生成的 IgE，进而压抑 Th2 免疫反应 (40)。而且，使 用热杀死的 L. casei Shirota 经由体外试验刺激脾脏细胞或口服，均能诱导 IL-12 和 IFN- 及 Th1 路径的细胞激素产生 (27,41)。从本试验可得知，经热 杀死的乳酸菌对于免疫调节也具有功效，并非活菌才能引发免疫反应。 总之，研究所使用的三种热杀死的乳酸菌，包括 L. acidophilus A2, L. gasseri A5, L.salivarius A6，能活化老鼠脾脏细胞和 DC，驱使 T 细胞往 Th1 免疫反应。 从此结果可得知，经热杀死的特定乳酸菌菌株可运用在免疫调 节上并扮演着重要的角色。经热杀死的乳酸菌有着长产品贮藏期限、更容易 保存和运输等优点。便于出外旅游携带，也许可以扮演免疫预防的目的。 LITERATURE CITED (1) Guarner, F.; Schaafsma, G. 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