微生物脂肪酶的应用

微生物脂肪酶及其相关研究进展 摘要：微生物脂肪酶是一种重要的工业酶类，也是当前国内外研究 的热点。就微生物脂肪酶在食品加工、手性化合物合成、脂肪水解、 脂肪酸提纯、三甘酯结构测定和环境治理等方面的应用及研究近况 进行综述。 关键词：微生物脂肪酶；催化；手性；应用 微生物脂肪酶具有种类多、比动物脂肪酶具有更广的作用pH 和作用温度范围、便于进行工业生产和获取高纯度制剂等优点而得 到广泛应用，特别是在油脂化工和有机合成工业中，酶催化的反应 具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点。尤其是1,3 专一脂肪酶，可用于特殊脂肪酸、单甘酯的合成及立体选择性化学 合成和拆分，具有巨大应用潜力。经近20 年来的深入研究，能应用 于工业生产的微生物脂肪酶种类不断增加，目前已遍及细菌、酵母 及霉菌各大类中，最近公布的36 种不同来源的商业化脂肪酶中有19 种来源于真菌，8 种来源于细菌。同时，随着生物技术的日新月异， 酶固定化技术、界面酶学和非水解酶学研究的突破性进展，使得人 们对微生物脂肪酶产生了极大的兴趣。当前脂肪酶在国内外均有生 产，微生物脂肪酶的多功能性不仅对传统的工业领域具有重要的影 响，而且在许多新的工业领域也得到了广泛的应用1-4。 1 脂肪酶的来源及结构 1. 1 脂肪酶的来源 脂肪酶的来源非常广泛,在许多动植物及微生物中存在5 。 植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子,动物体内含脂肪酶较多的 是高等动物的胰脏和脂肪组织等,微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重 要来源,它包括细菌、酵母和霉菌产生的脂肪酶。 1. 2 脂肪酶的分子结构 脂肪酶是一种糖蛋白。其糖基部分约占分子量的2 %15 % ,以 甘露糖为主,整个分子由亲水部分和疏水部分组成, 活性中心靠近分 子的疏水端。Brockerhoff 提出了脂肪酶在油水界面定向的假设 在研究了10 种脂肪酶的三维结构并比较了21种脂肪酶的区域选择性 后如下结论。 1) 脂肪酶都包括同源区段:His XYG1y -Z Ser WG1y 或YG1y His Ser WG1y(X,Y,W,Z 是可变的氨基酸残基) 。 2) 活性中心是丝氨酸残基,在正常情况下该残基受一个螺旋盖 的保护,当脂肪酶与界面相接触时,此盖打开,通过亲电子域的创造导 致脂肪酶的构象改变,此亲电子域在丝氨酸残基周围,由疏水残的暴 露和亲水残基的包埋来完成。从而增加了脂类底物复合物的亲和性, 并稳定了催化过程中的过渡态中间产物68 ,而酶分子的周围通 常存留一定量的水分,从而保证在油水界面和有机相中的自体激活 10 。脂肪酶在油水界面上被激活的比率很高,可达10 倍以上 (水解活力) 。Winkler 研究了猪胰脂肪酶和人胰脂肪酶的一级结构 11 ,发现其一级结构极其相似,从而显示了它们催化特性上的一 致性和相似性。 有些脂肪酶的界面吸附作用主要取决于界面的理化特性。而这 些理化特性受磷脂或胆酸盐等的极大影响。当这类两亲物质存在时, 甘油三酯一水界面的疏水/ 亲水平衡被打破,辅因子结合于脂肪酶特 定位点并通过其疏水端吸附于界面,使活性中心周围的“flap lid” 打开,显示出界面激活作用。 1. 3 微生物脂肪酶的产生菌及筛选方法 Fagery 规定优良产酶菌株的标准应是短时、营养基质低廉、菌 株易分离、胞外酶、非致病菌、不产生毒素、遗传性状稳定及对噬 菌体不敏感等。目前,产脂肪酶菌株主要集中在根霉、曲霉、假丝酵 母、青霉、毛霉、须霉及假单胞菌等。脂肪酶的筛选方法着眼于快 速、简捷、准确、选择性强及易于自动化上。谢舜珍采用油脂同化 平板,以油为唯一碳源进行同化试验并测定摇瓶发酵培养后的发酵液 酶活力。沈永祥等12 筛选到一株脂肪酶菌阿氏假囊酵母。施巧 琴13 利用脂肪酶作用脂肪后产生脂肪酸与维多利亚蓝反应呈蓝绿 色的透明圈平板法经摇瓶发酵复筛得到产碱性脂肪酶的扩展青霉。 Rollof ,J 等14从患频发性疖病人身上分离到产脂肪酶的金黄色 葡萄球菌。近年来随着细胞工程、基因工程、固定化技术的兴起,脂 肪酶的研究特别是对产脂肪酶的菌株诱变育种及基因克隆等方面取 得长足进展。1979 年, 我国研究开发了解脂假丝酵母AS211405。它 是紫外线及亚硝基胍处理选育出的脂肪酶高产变株,施巧琴15 对 产碱脂肪酶596 用亚硝基胍,紫外线,盐酸羟胺,秋水仙碱等诱变因子 进行作用得酶活力为原始菌16. 6 倍的突变株Un 503 ,每毫升发 酵液活力达400 U 以上。Ibrahim ,C. 0 对由绵毛状腐质霉产生的 脂肪酶用Amberlile xAD 7 和戊二醛交联法制得一种固定化酶。 Motoyasu ,O 等报道了脱氮产碱杆菌TK7 和绿脓假单胞菌OLI 脂肪 酶生产基因用RP4 :Mu 质粒转移到大肠杆菌JA2211上,重组克隆分子 拥有原菌体的80 %115 %的脂肪酶活力。 2 脂肪酶的应用 2.1 食品加工方面的应用 脂肪酶现已用于奶制品，如奶酪、奶油和人造黄油的增香。因 为奶制品中的香味是牛奶中的脂肪、蛋白质和乳糖代谢的产物，因 此，脂肪酶和蛋白酶被广泛地用于加快奶酪的熟化和香味的产生。 用脂肪酶处理过的奶制品比未处理的具有更好的香味和可接受性。 除奶制品外，脂肪酶也用于改善稻米和酒精饮料的香味，如在酒精 饮料的发酵过程中加入一定量的脂肪酶，产品具有类似奶酪的香味。 脂肪酶还用于无脂肪肉的生产，如在鱼加工过程中脂肪的去除是用 脂肪酶来完成的。另外，在生面团中加入脂肪酶使三甘酯部分水解 而增加单甘酯的含量可延缓腐败，单甘酯和双甘酯的形成也使蛋白 的起泡性质得到改善。 22 手性化合物合成中的应用 脂肪酶催化具有高底物专一性、区域选择性或对映选择性等优 点，使其成为有机合成中重要的生物催化剂。脂肪酶催化合成手性 化合物的基本类型有两个：(1)前手性底物的反应；(2)外消旋化合 物的拆分。催化的底物已由传统的前手性或手性醇和羧酸酯扩展到 二醇、二酯、内酯、胺、二胺、胺基醇、 或 羟基酸，因此， 大多数重要的功能有机化合物原则上都可被脂肪酶催化立体选择性 地制备。典型的生物催化剂包括细菌脂肪酶， 如 P.aeruginosa、P.fluorescens、Pseudomonas、B.cepacia、C.visc osum、Bacillus subtilis、Achromobacter sp.、Alcaligenes 和 Serratia marcescens 以及来自真菌的C. antarctica B 和 C.rugosa。然而，尽管在这方面有大量的报道，脂肪酶的工业对映 选择性过程却受到限制。一般存在以下问题：（1）不充分的对映选 择性；（2）有限的酶活性；（3）脂肪酶回收困难；（4）固有的最 大的动力学拆分效率只能达到50 %。不过这些问题正在被解决，除 了优化反应条件如溶剂、温度、酰化基团外，当前最重要的研究包 括：(1)脂肪酶分子的体外改造，作为增加对某一选定底物的对映选 择性的一种方法；（2）新的固定化技术使酶在有机介质中的活性和 稳定性提高；（3）循环技术使脂肪酶多次重复使用成为可能； （4）生物催化剂的动力学拆分与化学反应的巧妙结合可使产率提高 到80 %以上。在不久的将来，利用脂肪酶工业化合成手性化合物是 完全可能的18。 2.3 脂肪水解方面的应用 水解反应是指脂肪酶催化脂肪或酯，将其水解为脂肪酸和甘油 或醇。脂肪酶作为生物催化剂可催化由不同底物出发的水解反应， 利用脂肪酶水解油脂的能力可获得重要的轻化工原料脂肪酸和甘油。 用于这种目的脂肪酶包括来自Candida rugosa，Pseudomonashuorescen 和蓖麻种子(castorbean)等的脂肪 酶19。水解的底物包括各种植物油，如大豆油、蓖麻油、橄榄油 等；动物油如牛脂、羊脂和鱼油及各种油的酯类。酶催化反应通常 在环境温度、压力下进行，反应条件温和，能耗低，且不需高温、 高压、强防腐设备，产品具有良好的颜色和气味。由于没有或很少 有副反应，产品往往具有较高的纯度，使下游工艺简化。通过脂肪 酶催化可从含有多不饱和脂肪酸(PUFA)的不稳定油脂中获得脂肪酸， 而用传统的高温、高压的化学法生产这类脂肪酸则很困难，因为高 温将导致不饱和脂肪酸的氧化。还有如用蓖麻油(castor oil)水解 生产蓖麻酸，由于脱水、内酯化等副反应，不能用传统的蒸气裂解 方法生产，但用来自蓖麻种子的脂肪酶水解蓖麻油，则可避免这些 弊端，该工艺已实现商业化生产20。 24 在生物柴油合成中的应用 生物柴油作为一种替代能源在能源战略上具有极其重要的作用， 而且是目前能源发展的一个重要方向，可作为可再生能源和清洁能 源的典范。李俊奎等21以提取的毛油和甲醇为原料，用固定化 的假丝酵母(Candida sp. )99-125 脂肪酶进行脂肪酸甲酯(FAMEs) 的合成试验，结果表明，用固定化的脂肪酶催化石油醚得到的大豆 和小桐子毛油制备FAMEs，其产率均保持在70%以上，具有良好的工 业化前景。刘伟东等22采用Candida sp. 99-125 菌株研究了其 在丁二酸二酯磺酸钠(AOT)反胶束体系中催化大豆色拉油合成生物柴 油的新方法。考察了溶剂极性、AOT 浓度、W0(水与表面活性剂质量 比)、缓冲溶液pH 值、温度等因素对生物柴油合成的影响，结果表 明，在优化条件下单批最高酯转化率可达到90%。刘志强等23研 究了脂肪酶催化菜籽油醇解反应的几个因素，并获得了最佳条件， 在该条件下，一次加乙醇时转酯率可达86%，采用3 步加醇，转酯率 高达93%。李元元等24利用固定化脂肪酶催化棉籽油合成生物柴 油工艺，结果表明，固定化酶后，酶稳定性有所改善，同时还研究 了最佳转酯化条件，在最佳条件下，转化率可达65%。周丽亚等 25以预处理的废餐饮油和乙酸甲酯为原料，在Novozym 435 的 催化下研究了制备生物柴油的工艺条件，在最佳条件下，生物柴油 得率为86. 43%，产物符合美国生物柴油质量标准和我国 50#轻柴 油的标准，具有较好的柴油机燃烧性能。 3 前景与展望 近年来随着细胞工程、基因工程、固定化技术的兴起，脂肪酶 的研究特别是对产脂肪酶的菌株诱变育种及基因克隆等方面也取得 长足进展。目前，脂肪酶主要用于高价值的产品和具有热敏性的底 物或产品，随着人们生活水平的提高，在食品、牛奶、香水、化妆 品和医药中添加天然成分的产品越来越受消费者青睐。由天然底物 生物合成的化合物被认定为天然产物，而同样的原料用化学法生产 的产物则不受欢迎。因此，天然成分在今后将会具有很大的需求， 这使生物催化剂极具吸引力，所以说，脂肪酶在油脂、食品、医药、 化妆品等领域具有光明的应用前景。 参考文献： 1 谈重芳，王雁萍，陈林海, 等. 微生物脂肪酶在工业中的应用 及研究进展J. 食品工业科技，2006,27(7):193-195 2JAEGER K E，REETZ M T. 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