微生物基因组研究进展及意义

微生物基因组研究进展及其意义 近年来，病原微生物的基因组研究取得了飞速的进展。所谓基因组 研究是指对微生物的全基因进行核苷酸测序，在了解全基因的结构基础 上，研究各个基因单独或数个基因间相互作用的功能。由于过去人们大 多从表型分析入手，寻找已知功能的编码基因，实际只了解微生物中极 少数的基因，如链球菌的链激酶基因、结核杆菌编码的热休克蛋白基因 等。还有大量未知基因未被发现。通过基因组研究，则从根本上揭示了 微生物的全部基因，不仅可发现新的基因，还可发现新的基因间相互作 用、新的调控因子等。这一研究将使人类从更高层次上掌握病原微生物 的致病机制及其规律，从而得以发展新的诊断、预防及治疗微生物感染 的制剂、疫苗及药品。此外，新发现的微生物酶及蛋白还可能有在工农 业生产上的应用价值。因此，全球除已完成了 70 余株覆盖重要病毒科 的病毒代表株全基因组研究外，据美国基因组研究所（The Institute for Genomic Research, TIGR）报道，目前已完成了 19 种微生物基因 组测序，其中 11 种与人类及疾病相关（嗜血流感杆菌，生殖道支原体， 肺炎支原体，幽门螺杆菌，枯草杆菌，伯氏疏螺旋体，结核杆菌，梅毒 螺旋体，沙眼衣原体，普氏立克次体）。另外，还有 40 余种微生物已 被登记正在进行测序，预计在 19992000 年完成 1 。 病毒基因组研究进展 病毒因其基因组小，是进行基因组研究最早的生物体。早在 1977 年已完成了噬菌体 DNA 的全基因测序。存在于脊髓灰质炎疫苗中的 SV40，是最早完成全基因测序的与疾病相关的病毒；此后，许多病毒均 已完成了全基因测序，并根据序列的开放阅读框架（ORF）对编码蛋白 进行了推导。已对相当一些病毒蛋白进行了重组表达，还对一些病毒基 因编码的调控序列进行了研究。除一般大小的病毒已完成了基因组测序， 对大基因组病毒，疱疹病毒科，如水痘病毒基因组为 0.125Mb(Mega- basepair,兆碱基对) 2 。巨细胞病毒，基因组为 0.229Mb3 。我国已 对痘苗病毒天坛株（约 0.2Mb）进行了全基因测序，发现与国外的痘苗 毒株序列有明显的差异 4 。我国还对甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎 病毒进行了国内毒株的全基因测序。近来还对国内 2 株发现的虫媒病毒 毒株完成了全基因测序。我国从不同来源的标本中发现了不少乙肝病毒 变异株，有的具有特殊的生物学特性 5 。对病毒基因中调控因子的分 析，发现了与乙肝病毒增强子作用的新细胞核因子 6 。 因此，目前对病毒的基因组研究已进入了后基因组阶段，即从全基 因水平研究病毒的生物学功能，同时发现新的基因功能。对于医学病毒 学当前主要方向是研究病毒基因组中与致病及诱生免疫应答相关的基因， 从而揭示和解决迄今尚未解决的问题，以达到控制或消灭一些重要病毒 感染的目的。 建议目前可进行后基因组研究的领域为： 1 病毒持续性感染：基因组中与持续性感染相关的基因，基因变 异或调控因子研究。已报道的乙肝病毒的前核心基因出现终止密码突变， 可逃逸机体对 E 抗原的免疫应答，有利于病毒持续感染 7 。 2 病毒与肿瘤的关系：已知 EB 病毒、人乳头状瘤病毒、乙肝病 毒等均与肿瘤相关。对这些病毒的基因组或基因变异研究，有可能揭示 部分致瘤的机理，如最近报道 EB 病毒 LMP-1 基因羧基端缺失 30 个碱基 对，可能具有更高的致癌性 8 。 3 病毒变异株或新出现毒株的致病性改变：如近来发现肺出血性 汉坦病毒 9 ，对人致病的 H5 禽流感病毒以及复制性特别强的乙肝毒株 10 等，对嗜性改变的巨细胞病毒 11 从基因水平进行了研究。 4 病毒编码复制酶基因及其调控的研究：有些病毒具有独特的复 制酶，如对人免疫缺陷病毒酶的研究导致开发出有效的抗病毒制剂。还 有一些病毒（如丙型肝炎病毒）复制酶的编码基因虽已明确，但未能大 量在体外表达，而且对这些酶在细胞内病毒复制中所起的作用也不清楚， 延误了抗病毒制剂的开发，应抓紧进行研究。 5 病毒受体的研究：已知病毒受体多数是复合型，近来发现人免 疫缺陷型病毒的受体除 CD4 外还有副受体 12 。受体是病毒入侵细胞的 第一关，通过全基因组研究将更有利于发现复合的病毒受体。 综上所述，本世纪后期已从基因组水平研究病毒的功能 13 ，因此， 我们应注意将病毒基因的研究重点转移到研究病毒基因与细胞的相互作 用中来，以开辟对病毒致病机理研究的广阔天地。 细菌基因组研究进展 广义的细菌包括细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体及放线 菌，因此细菌的基因组研究也包括这些微生物。除放线菌外，细菌基因 组大小为 1 至数个 Mb。目前正在研究测序的细菌已超过 40 余种。与致 病相关的主要细菌、真菌及寄生虫，参见表 1。 表 1 正在进行全基因组测序的主要细菌、真菌与寄生虫 1，14 细 菌 真 菌 寄 生 虫 百日咳鲍氏杆菌 变异链球菌 白色念珠菌 利什曼原虫 空肠弯曲菌 肺炎链球菌 (2 株) 恶性疟原虫 鼠伤寒沙门杆菌 化脓链球菌 酿酒酵母菌 曼氏血吸虫 结核分枝杆菌 溶脲脲原体 布氏及克氏锥虫 肺炎衣原体 霍乱弧菌 卡氏肺孢子虫 沙眼衣原体 单细胞李氏菌 马来布鲁丝虫 艰难梭杆菌 麻风分枝杆菌 土拉弗氏菌 鸟分枝杆菌 嗜酸乳杆菌 淋病奈氏菌 嗜肺军团菌 脑膜炎奈氏菌 伤寒沙门菌 绿脓假单胞菌 金黄葡萄球菌 构巢曲菌 1细菌全基因组测序的基本方法 由于细菌基因组一般在数百个 kb 至数个 Mb，快速测序的策略用经 典鸟枪法（shot gun）建立基因文库，然后随机克隆测序。第一个完成 全基因测序的嗜血流感杆菌就是用此法完成的。鸟枪法的基本步骤为先 将细菌的染色 DNA 机械地随机切割成一定相对分子质量范围的片段，分 别构建大小两套文库。小片段（12kb）经末端修补处理后克隆入如 pUC18 质粒载体内；大片段（1520kb）克隆入 噬菌体载体中，然后 进行大规模测序。以后则需进行序列的缺口填补。缺口填补是关键步骤， 一般需用几种方法相互组合才能完成，花费的时间及精力很多。能否完 成缺口填补有时会成为完成全基因组测序的关键。获得全基因组的资料 后，还要利用计算机软件进行数据分析，推测 ORF 是否为真实的蛋白编 码序列，检查功能位点，分析共有序列或特征序列（启动子，信号肽， 保守基序 conserved motifs）等。如不是私人公司支持的研究，全基因 组的研究资料将在杂志或互联网络上发表，供科学界参考和使用 15 。 2 细菌基因组研究所提供的机遇和挑战 目前，微生物界正面临在下一世纪中如何发展的严峻问题。在 20 世纪微生物学科为生命科学及人类的健康作出了卓越的贡献。全世界唯 一被消灭的天花，痘苗的发展及应用起了关键作用。由于微生物基因组 较小，将会超过其它生物更快地完成基因组的结构与功能分析，获得的 信息将会首先被应用于药物、疫苗产品的开发和疾病的防治。例如最近 对 2 株不同的幽门螺杆菌基因组分析和对比，发现 1994 年自美国分离 的菌株 199 与 1987 年自英国分离的菌株 26695，仅有（67）的基因 结构差异。这些不同基因的半数集中在一个高变区中。曾有学者认为， 幽门螺杆菌可引起不同临床疾病但也可对人有利，其机理可能与菌的基 因结构相关。目前的结果揭示应重点研究这些菌株特异区基因，同时应 研究与定居基因表达相关的序列，此外还应考虑过去被忽视的机体因素 在幽门螺杆菌致病中的地位 16 。通过对比幽门螺杆菌和最近完成全基 因测序的空肠弯曲菌，发现两种菌仅有 17不同的基因序列。其中，幽 门螺杆菌有独特的基因使之能在胃酸存在的条件下生存并分解尿素。弯 曲菌则比螺杆菌有 2 倍多的起调控作用的基因。这些基因可能使弯曲菌 能适应多种环境，如人肠腔、鸟肠道、牛奶中。因弯曲菌能在外环境中 生存，在美国去年引起的腹泻患者达 30 万人 17 。又如至今未能在体 外培养的梅毒螺旋体基因组为 1 138 006bp，其毒力因子由一个 12 个潜 在的膜蛋白家族和数个可能的溶血素组成。对比梅毒与引起 Lyme 病的 螺旋体基因组，也发现了致病性的诸多基因 18 。结核杆菌基因组的分 析也已完成，含 4 411 529 bp，编码约 4 000 个基因。发现该菌有大量 基因是编码脂类合成与分解酶，发现 2 个富含甘氨酸的新家族，可能是 引起该抗原变异的来源 19 。即使尚未完成全基因组分析，国外已对肺 炎链球菌、肠球菌和乳球菌的关键基因序列进行了开发研究 20 。最值 得我们重视的是，这是个新领域，是可以进行创新研究的高起点。 3 如何迎接挑战 过去我国微生物界的老一代专家曾在学术上作出过卓越贡献。建国 以来老中青学者们在反细菌战、发展疫苗、建立诊断试剂等方面，为控 制传染性疾病获得了大量成果。因此开展微生物基因组研究具有较强的 实力。建议采取以下路线： （1） 选择我国特有的或对发展中国家影响大的微生物，进行基因 组测序。由于我国经济实力有限，只宜选择少数微生物进行。尽量选择 国外尚未进行过的微生物为对象。通过这项研究，可使我国微生物界有 少数骨干掌握细菌基因组研究的策略和技术全过程，有利于今后基因组 功能研究的开展。 （2） 对于已公布的基因组要及时掌握，根据我国的需要进行序列 分析，选择好有限目标对几种细菌作基因功能研究。应注意在基因功能 研究中，学习与借鉴病毒基因功能研究的已有经验。微生物学家不仅要 将分子水平研究与细菌的生物学特性互相联系，还要联系临床及流行病 学科、药物学科、生化学科和免疫学科。此外还需要建立适用的细胞及 动物模型，以保证基因研究有后劲。 （3） 加强微生物界学者在细胞生物学、生物信息学以及生物大分 子学方面的知识更新，以适应微生物学科将面临的革命性变化。估计今 后的微生物诊断、治疗和预防都会有所改变，及早作好准备方可立于不 败之地。 编者评述：科学家们预言 21 世纪在自然科学领域中，生命科学仍 占主要地位。重点将是研究人类基因组，深入研究基因功能。微生物的 基因组研究较之人类基因组研究要简单一些，但由于微生物种群繁多，