乙型脑炎病毒侵染细胞机制研究

乙型脑炎病毒侵染细胞机制研究 -生命科学学院 刘洋 SA14008045 0 前言 乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)作为黄病毒科黄病毒属有包膜的单 正链 RNA病毒，是流行性乙型脑炎的病原体，主要以蚊虫为媒介进行传播，感染后引发严 重的急性神经系统症状，病死率较高,且存活者易留有神经系统后遗症，对人类健康存在巨 大威胁。 病毒感染宿主细胞需要经过一个完整的复制周期，包括病毒的吸附、穿入细胞内、脱壳、 生物合成、病毒颗粒的装配、释放等过程，为了有效感染宿主细胞，病毒必须先要侵入宿 主细胞内，大多数包膜病毒与靶细胞结合以后利用细胞内吞方式作为侵入宿主细胞的途径， 这些内吞途径包括：网格蛋白介导的内吞、膜穴样凹陷介导的内吞、巨胞饮作用和网格蛋 白、膜穴样凹陷非依赖型内吞等。黄病毒属病毒入胞途径多样，内吞机制纷繁复杂。因此， 乙型脑炎病毒如何利用自身相应元件与宿主细胞相互作用完成病毒内吞及其调控是现今值 得我们注意的问题。 1 结构特性 乙型脑炎病毒的核酸在宿主细胞内被翻译为一个多聚蛋白后，在宿主细胞和病毒蛋白酶 的作用下裂解为衣壳蛋白，包膜糖蛋白，内膜蛋白以及 7个非结构蛋白。其中，E 蛋白被 普遍认为是病毒侵染过程中的关键因子。这是由于 E蛋白能识别细胞表面受体，介导病毒 的吸附与入侵，并参与病毒与质膜的融合。 蛋白的胞外域是一个首尾相连的二聚体，每个单体由三个结构域组成。结构域由九 个 折叠组成，位于蛋白单体中央，结构域 II 是二聚体化功能域，由 DI 突出的两个延 伸环构成，在其末端含有保守的融合肽。结构域 DIII 位于蛋白的 C端，由六个反平行的 折叠构成，与 DI 通过短肽连接。 DIII 的侧面存在细胞表面受体结合位点，参与病毒的吸 附入侵过程。蛋白的茎干区位于 DIII 的 C端，由两个亲水性的 螺旋组成，连接蛋白 的胞外区和其 C端的跨膜锚定区域。 当乙型脑炎病毒吸附于细胞表面后，蛋白与 HSP90,HSP70，波形蛋白，CD4 等细胞表面受体相结合，介导乙脑病毒进入宿主细胞；同时， 粘多糖（GAGS）加剧病毒与宿主细胞间的吸附效率。 2 侵染途径 目前，研究普遍认为乙脑病毒是通过受体介导的网格蛋白依赖型内吞作用进入宿主细 胞的。首先，病毒与定位在网格蛋白结合区的受体结合，或者是病毒与受体结合形成复合 物后，转移到已存在的网格蛋白被膜小窝中，而后被膜小窝进一步内陷，在发动蛋白的作 用下，被膜小窝与细胞膜分离，形成网格蛋白被膜小泡，小泡包裹着病毒离开质膜，向包 质内部运输。接着网格蛋白被膜释放，小泡最终被运送到早期核内体中。在蛋白被送入 核内体后，低 环境使蛋白构象发生改变，暴露出融合肽，进而介导病毒与核内体的 膜融合，最后将遗传物质释放入胞内。并且有研究表明，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸可能 也与融合过程有关。其中认为组氨酸是膜融合过程中的 pH感受器。蛋白中有 5个组氨酸 在所有的黄病毒中都是保守的。将所有位点分别突变后发现，仅 H323的突变导致了膜融合 早期阶段融合肽暴露的异常，此外蛋白的热稳定性也因为 H323的突变而降低，由此推测， 位于 DI 和 DIII 交界面上的323 是参与膜融合过程的重要位点。 然而，徐庆强等研究表明乙脑病毒侵染细胞的机制可能与宿主细胞的种类有关。乙脑病 毒入侵神经元细胞时并不依赖于网格蛋白，研究首先建立了 JEV感染的神经细胞模型，并 通过病毒动力学实验，及选用针对不同细胞内吞途径的化学抑制剂分别阻断各条内吞途径， 包括网格蛋白依赖的途径、膜穴样凹陷依赖的途径、发动蛋白依赖的途径、胆固醇依赖的 途径、以及低 pH依赖的途径等，观察上述处理对 JEV和单周期 JEV假病毒入侵神经细胞的 影响。继而，通过外源转染特异性的显性抑制突变体或小干扰 RNA，破坏各内吞途径的关 键分子，进一步分析和确认 JEV入侵所依赖的内吞途径。在此研究基础上，采用化学抑制 剂阻断法比较分析 JEV入侵神经细胞和非神经细胞的内吞途径的异同。研究发现，JEV 入 侵大鼠神经母细胞瘤细胞不依赖网格蛋白介导的内吞途径，而是依赖发动蛋白及内体酸性 pH环境，通过膜穴样凹陷介导的内吞途径入侵神经细胞，并且不依赖细胞巨胞饮作用。同 时，实验中 JEV入侵非神经类细胞不同于入侵大鼠神经母细胞瘤细胞所依赖的内吞途径分 别将针对不同内吞途径的化学抑制剂作用于 B104、Vero、CHO 和 Huh7细胞分析对 JEV入侵 的影响。结果显示，JEV 通过网格蛋白介导的内吞途径入侵 Vero，CHO 和 Huh7细胞；而入 侵 B104细胞则通过 Caveola介导的内吞途径，表明 JEV入侵神经类细胞所依赖的内吞途径 不同于其它非神经细胞。这种内吞途径有别于 JEV感染非神经细胞的入侵方式，也与其它 黄病毒属成员的内吞机制不同，可能与 JEV的神经嗜性和致病性相关。 3 展望 随着研究的不断深入，人们对于乙脑病毒入侵机制的认识也在不断拓宽，对不同细胞及 其表面特异性受体的相关研究，为乙脑病毒的入侵机制的解析提供了大量依据。尤其是 蛋白晶体结构的不断深入研究及多种细胞表面特异性受体的发现，进一步阐明了乙脑病毒 与受体结合的位点及其作用机制。因此，阐明 JEV入侵神经细胞过程中所利用的固有元件， 以及精确的调控机制，有助于我们更好地理解、认识病毒的致病机理，为寻找新的药物治 疗靶点提供理论依据。 此外，相关研究表明黄病毒属病毒是直接穿过细胞膜进入宿主细胞，期间并发生受体介 导的内吞和低 pH 环境下的膜融合。这一新理论的提出为乙脑病毒入侵机制的研究提供了 更多的可能。乙脑病毒侵染机制的研究不仅有助于乙脑病毒和黄病毒属病毒的基础研究， 而且还能为疫苗和特异性药物的开发提供更为精确的新靶点，从而使预防和治疗效果更为 有效。 这将为乙型脑炎的治疗提供新思路和新方法，同时也为其他黄病毒入侵机制的研究提供新 的切入点。 4 参考文献 1周雅娴,张建琼.乙型脑炎病毒侵染细胞机制的研究进展.J病毒学报,2014, 30( 2): 188-192. 2李焱时莹丁天兵. Vero 细胞膜上与日本脑炎病毒结合分子的初步筛选.J细胞与分子生物学,2010,26(5) 431-433. 3Zheng Y, Li M , Wang H. Japanese encephalitis and Japanese encephalitis virus in mainland china.JRev Med Virol. 2012.22(5).301-322. 4徐庆强, 乙型脑炎病毒入侵神经细胞的内吞机制