安徽乌菜游离小孢子培养及植株再生体系建立

-精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 1 安徽乌菜游离小孢子培养及植株再 生体系建立 摘 要：以 6 份安徽乌菜为试材， 研究基因型、6-BA、AG 对乌菜小孢子 胚状体发生的影响及 6-BA 对植株再生 的影响。试验结果表明，不同基因型乌 菜的小孢子胚诱导率具有明显差异，6 份乌菜材料中有 3 份诱导出胚状体，H- 4 出胚率最高，平均每花蕾诱导 8.76 个 胚；NLN-13 培养基中添加 0.2 mg/L 6- BA 和 AG 10 mg/L 均能促进胚状体发生， 后者促进作用更明显；MS 培养基中添 加 1 mg/L 6-BA 可提高乌菜胚状体成苗 率。 中国论文网 /2/view-12911903.htm 关键词：乌菜；小孢子培养；诱 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 2 导率；胚状体；植株再生 中图分类号：S634.4 文献标识 码：A 文章编号：1001-3547（2017） 06-0029-04 安徽乌菜是安徽省名优特产，是 十字花科芸薹属白菜亚种的一个变种， 杂种优势明显，常规杂交法育种年限较 长，结合现代生物技术进行乌菜育种对 提高育种水平和效率至关重要。 游离小孢子培养是育种中最有效 的生物技术之一，在大白菜、不结球白 菜、菜薹等十字花科蔬菜作物上多有报 道1 4，而对于乌菜的小孢子培养研 究较少，存在胚状体诱导率低的问题。 本试验选用 6 份不同基因型的安徽乌菜 为试材，进行游离小孢子培养，探讨 6- BA（6-苄氨基嘌呤）和 AG（阿拉伯半 乳聚糖）对乌菜游离小孢子培养胚状体 诱导率的影响及 6-BA 对胚状体植株再 生的影响，为建立优化乌菜游离小孢子 培养技术体系提供参考。 1 材料与方法 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 3 1.1 验材料 选用安徽地方乌菜材料 6 份，材 料编号 1403、1404、1408、1416、1418、H- 4。 试验材料于 2015 年 9 月 6 日播 种，10 月 4 日定植，露地栽培，常规管 理。2015 年 12 月，每份材料选取 10 株 移植到塑料大棚。2016 年 34 月初花 期至盛花期选取适宜大小的花蕾进行游 离小孢子培养。 1.2 试验方法 胚诱导培养 小孢子培养基本 操作流程参照申书兴等5大白菜游离小 孢子培养方法。在初花期至盛花期，于 晴天 8：0010：00，选取健壮、大小 适宜的花蕾（花瓣与花药长度比例 1234，多数小孢子处于单核靠边 期） ，以主枝和一级侧枝上的花蕾为宜。 放入 25 mL 无菌小烧杯中，首先用 70% 酒精消毒 30 s，其次用 2.5% NaClO 溶 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 4 液消毒 5 min，然后用无菌水冲洗 3 次； 加入 B5 无菌液体培养基，用玻璃棒轻 轻挤压使小孢子游离出来，经 350 目滤 网过滤，收集滤液于 15 mL 旋盖离心管 中，于 1 000 r/min 离心 3 min，弃上清， 重复 2 次，得游离纯化的小 孢子。 将分离纯化后的小孢子分别附加 0、0.2、 0.4 mg/L 6-苄氨基嘌呤（ 6-BA） 或 0、5、10、20 mg/L 阿拉伯半乳聚糖 （AG）的 NLN-13 培养基制成悬浮液， 添加活性炭 0.1 mg/mL，调整小孢子密 度约 1105 个/L，分装于直径 60 mm 的 无菌培养皿中，以 Parafilm 膜封口，每 份材料取花蕾 25 个，分装于 4 皿培养， 重复 3 次。33黑暗热激培养 24 h 后， 转入 25黑暗条件下培养，有肉眼可见 的胚出现时，转移到转速 60 r/min 的摇 床上继续暗培养至形成子叶型胚状体， 3 周后统计胚状体数目。胚状体植株 再生 利用附加浓度为 0、1 mg/L 6- -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 5 BA，10 g/L 琼脂，30 g/L 蔗糖的 MS 固 体无菌培养基作为胚状体成苗培养基， 将获得的乌菜成熟胚状体转接入成苗培 养基中，3 周后统计成苗率。 2 结果与分析 2.1 供体基因型的影响 在 6 份乌菜材料游离小孢子培养 中，有 3 份诱导出胚状体（H- 4、1404、1408） ，占参试材料的 50%。 其中 H-4 产胚能力较强，在添加 10 mg/L AG 的 NLN-13 培养基中，平 均每花蕾可诱导 8.76 个胚；1408 次之， 平均每花蕾可诱导 2.91 个胚；1404 平 均每花蕾可诱导 1.16 个胚。而 1403、1416、1418 则没有胚状体产生。 可见，不同基因型乌菜材料的小孢子培 养胚状体诱导率存在差异。 2.2 6-BA 对乌菜小孢子胚状体诱 导的影响 在 NLN-13 诱导培养基中加入不 同浓度的 6-BA，胚状体诱导率统计结 果见图 1。对于能诱导出胚的 3 份材料， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 6 6-BA 浓度对胚状体诱导率的影响均呈 单峰变化，低浓度的 6-BA 对乌菜小孢 子胚诱导有一定的促进作用。当 6-BA 浓度为 0.2 mg/L 时，胚诱导率达到最高， 乌菜 1404、1408、H-4 平均每花蕾诱导 胚状体数目依次为 3.64、1.16、0.68 个。 2.3 AG 对胚状体诱导的影响 在 NLN-13 诱导培养基中加入不 同浓度 AG，25暗培养 20 d，统计结 果表明（图 2） ，低浓度的 AG 对乌菜小 孢子胚诱导有一定的促进作用，高浓度 的 AG 则有抑制作用。当 AG 浓度为 10 mg/L 时，胚诱导率达到最高，3 份供试 乌菜的胚状体诱导率随浓度变化趋势表 现一致。 2.4 6-BA 对胚状体成苗的影响 选择成熟的乌菜胚状体转接入成 苗培养基（图 3） ，表 1 中结果表明，在 MS 培养基中加入 1 mg/L 6-BA 可提高 乌菜试材 1408 和 H-4 的胚状体成苗率， 且促进作用显著，但 1404 的胚状体并 -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 7 未形成双单倍体植株，说明在培养基中 添加 6-BA 并不是对所有基因型的乌菜 胚状体成苗具有促进作用。 3 结论与讨论 小孢子胚胎发生能力受基因调控。 在白菜小孢子培养研究中发现，不同基 因型间小孢子胚状体诱导率差异很大 1，6， 7。本试验中 6 份供试乌菜有 3 份可诱导出胚状体，成功率为 50%，不 同基因型乌菜出胚率差异较大，与前人 在其他作物上相关研究结果一致。 适量的 6-BA 可显著提高白菜小 孢子胚状体或愈伤组织诱导率24； 蒋武生等8则认为加入 6-BA 和 NAA 抑制大白菜小孢子胚发生。AG 对小麦、 大白菜和普通白菜小孢子培养胚发生和 直接成苗有促进作用9，10。本试验结 果表明，在 NLN-13 培养基中分别添加 6-BA 和 AG 可大大提高乌菜小孢子胚 状体诱导率，促进小孢子细胞发育由配 子体途径向孢子体途径转变。在一定程 度上解决乌菜胚状体诱导率低的问题， -精选财经经济类资料- -最新财经经济资料-感谢阅读- 8 但是本试验中 6 份供试材料仅 3 份诱导 出胚，并不能解决所有乌菜难诱导出胚 的问题，所以针对其他乌菜材料胚诱导 条件以及胚胎发生机理还需要进一步试 验摸索，以优化乌菜小孢子培养技术体 系。 本验乌菜小孢子培养过 程中，在 MS