【毕业学位论文】（Word原稿）水稻抗褐飞虱基因Bph14的分离和功能分析

分类号 密 级 编 号 10486 武 汉 大 学 博 士 学 位 论 文 水稻抗褐飞虱基因 离 和功能分析 研 究 生 姓 名： 杜 波 指导教师姓名、职称： 何 光 存 教 授 学 科、专 业 名 称： 生物学、遗传学 研 究 方 向 ： 植 物 遗 传 学 二 九 年十一月 F A N 2009 重声明 本人的学位论文是在导师的指导下独立完成并撰写的，学位论文没有剽窃、抄袭、造假等违反学术道德、学术规范和侵权行为，本人愿意承担由此产生的法律后果和法律责任，特此郑重声明。 学位论文作者（签名）： 年 月 日水稻抗褐飞虱基因 分离和功能分析 博士研究生： 杜 波 导 师： 何光存教授 （武汉大学生命科学学院 武汉 430072） 中文摘要 褐飞虱（ 水稻种植地区为害 水稻 最严重的害虫之一。 褐飞虱 为害 水稻 程度较轻时， 导致水稻植株矮小 、 生长活力降低 、 分蘖 减少 和产量下降； 而 褐飞虱 为害 水稻 严重时， 将 导致植株整体死亡。由于目前种植的 水稻 大部分都是感褐飞虱品种 ，农民只能 使用 农药来 防治 褐飞虱。但是农药的使用 增加了农业生产的成本 ，并造成环境 的 污染 。因此 ，最经济 的 、 对环境最友好 的 防治 褐飞虱的方法是 种植抗褐飞虱的水稻品种。 迄今 为止 ， 科学家 已经在栽培稻和野生稻中定位了 21 个抗褐飞虱基因 ，但并没有一个抗褐飞虱基因 被克隆出来， 并且 水稻 抗 褐飞虱的 分子 机制也 不 清楚。 在 早期研究中，我们在 水稻品种 定位了两个抗褐飞虱基因 中， 因 位于水稻第三染色体长臂， 因 位于水稻第四染色体短臂。为了克隆 因，我们从 明恢 63 的重组自交系中选择了抗性 品种 它只 含有 抗褐飞虱 基因 我们 用 感 褐飞虱 水稻品种台中本地 1 号 （ 杂交， 得到的 再自交 ，从而 构建了 图 群体。我们随机选择了 100 株 株进行抗虫鉴定 ，结果显示抗 性 和感性植株的分离比为 3： 1（ 72:28； 2=， 这 表明 在 单个的 因提供了 水稻对褐飞虱的抗性。 为了定位 因 ，我们 用侧翼分子标记 选 了 3700 份株 ，得到了 49 株重组单株。 我们分析了这些重组单株的基因型和表型，将因 定位于分子标记 间 120区段。为了进一步精细定位 因，我们从 株 中选取 域为杂合，而其他区域来源于 单株。 这些单株自交 后 再选择，一直到 群体 。我们用 5000 份的株 来构建高密度的定位图谱，并 最终 将 位 在标记 间 34区段。 该区段测序后， 我们发现有 两个预测的编码抗性蛋白的基因，分别命名为 为了 最终 确定哪个基因是 因，我们将预测的 b 基因 以及 携带 自身启动子 的转化 载体， 分别转入 感 褐飞虱 水稻品种 后，我们对转基因的 做了抗虫鉴定。鉴定结果表明：所有表达因的转基因 植株均为 对 褐飞虱 的抗性 ，而 转基因 植株仍是感虫 的。 另外，我们 利用 术 抑制了 抗虫品种 因的表达， 对基因 植株的 抗虫鉴定 结果 表明 因被抑制的 植株 丧失了对褐飞虱的抗性 。因此，我们认为是 供了 水稻对褐飞虱的 抗性， 它 就 是 因。 因编码一个 1,323 氨基酸的蛋白质，其具有一个螺旋 核结合位点（ 亮氨酸富集重复（ 基序。进化树分析表明 ， 白与水稻中的其他 抗病 蛋白 的关系较近，而与其他 植物已知的 抗病 蛋白亲缘关系 较远 。我们分析了 在21 个水稻品种的 位 基因 的表达 。 这些品种中， 等位基因均有转录，且表达量在大部分品种中都没有差异。但是，通过序列比较，我们发现白的 的 功能 基序在这些水稻品种中是保守的 ，不同水稻品种之间没有差异 ，而 则 存在 54 个独有的氨基酸以及两个氨基酸的缺失。 因 在水稻根、叶鞘和叶片中 组成 型 表达 ，且 表达量随 褐飞虱取食 时间而 增强。 为了检测 因 的表达部位，我们 构建了 因 的启动子驱动 因 的 转化 载体 ，并 转 入 水稻 我发现 因 主要在根、叶鞘和叶片的导管和筛管周围的薄壁细胞 表达 。 我们将 因 与绿色荧光蛋白融合 ，并 在洋葱表皮细胞 瞬时表达 。我们 发现 白 分布在 细胞质中。 为了研究 基因植株 的抗性机制，我们 观察 了 在 抗性的 基因植株以及感性 的野生型植株中 ，褐飞虱的不同 表现 。这些研究包括 褐飞虱对 宿主 的 选择 ，褐飞虱的 取食行为 、 蜜露 量 、 群体生长率 、 存活率以及产卵力。 在宿主选择性实验中， 我们观察到分布在 转基因和野生型植株 上的褐飞虱 没有显著性差异。褐飞虱在不同 的抗、感 植株上的产卵 数目 也没有太大差异。我们用电子刺探仪记录了褐飞虱在水稻上的取食行为。数据 结果表面 ， 当 褐飞虱取食 及 野生型植株 时 ，褐飞虱第一次穿刺到达韧皮部的时间 ， 以及 第一次 在韧皮部的消化时间并没有差异。而 在 取食 基因植株 时 ， 褐飞虱 的非刺探时间以及穿刺时间 有 明显增加， 并且 在 韧皮部 的 消化时间显著减少。 与此相同的是， 褐飞虱取食 基因植株 后， 分泌的 蜜露 也明显降低 。同时， 在 褐飞虱的群体生长率仅 为 在感性品种的 1/5， 并且褐飞虱 在 基因植株 上 的存活率也明显 比 在 野生型植株 上 低。这些结果表明 因 介导的抗性是 抗生性，能降低褐飞虱的取食，生长和存活 率 。 我们观察到， 褐飞虱取食 基因植株 后 ， 基因植株 的 筛板以及维管组织的细胞壁都有大量 胼胝质沉积 的 现象。我们调查了胼胝质相关基因的表达模式 ，结果发现： 在褐飞虱 取食 后的野生型和 基因植株 中 ， 三种胼胝质合成酶基因 （ 的表达量都 有上调。然而， 编码胼胝质水解酶 （ 3的 基因 （ 仅 在 基因植株 的表达量 下调 。因此，我们认为 褐飞虱取食后，主要是 基因植株 中 胼胝质水解酶 基因表达的下调 导致了 转基因植株中 胼胝质的沉积和筛管的堵塞。另外，我们发现 褐飞虱取食 转基因植株 后，转基因植株的 岛素抑制 剂基因 的 表达 量 上调更明显 ，而褐飞虱 体内的 胰岛素基因 则 受到更多的抑制。这些结果表明， 基因植株中胼胝质的沉积以及胰岛素抑制 剂 产物阻止 了 褐飞虱的持续取食和韧皮部汁液的消化。 植物防御昆虫 取食 的 信号途径 包括激活水杨酸 和 茉莉酸 /乙烯信号分子。我们 检测了 褐飞虱取食后， 水杨酸和茉莉酸 /乙烯信号途径基因在 基因 植株和野生型植株的表达量。在转基因植株中，茉莉酸 /乙烯信号途径基因 （ 的表达比野生型明显降低，而水杨酸 信号途径 基因 （ 的表达比野生型有明显上升 。这些 结果表明褐飞虱取食后，因 可能激活了水杨酸依赖的抗性途径。 因被认为在植物中 能有 效抑制病原菌生长 并 阻止其扩散 ， 使 植物 产生 系统获得性抗性 。 在 基因植株中， 因 （ 的表达量明显比野生型低。 因此，褐飞虱取食后， 活的是一个 不依 赖于 因 的抗性 途径 。 因是第一个 成功克隆 的 水稻 抗褐飞虱 基因。 它的 研究 为 水稻抗褐飞虱 的 分子机制 奠定了基础 。在 因 介导的水稻对褐飞虱的抗性机制中，早期宿主 /昆虫识别，胼胝质沉积，胰岛素抑制 剂产生 以及植物激活水杨酸防御信号途径 的机制 与植物 的 抗病机制具有很大的相似性。 克隆能推动水稻抗虫基因的研究，为 培育抗虫 水稻 打下基础 。 克隆 有效控制 褐飞虱， 并 减少了 农药的 使用，降低了生产 成本 和 环境的 污染 。 关键词 ： 褐飞虱， 图位克隆 ， 白，抗生性，信号途径 of a in 30072) he is of in of of As to on to is in of to is to To 21 of of to PH we in 5, on of on of . To we 2 a a 5, ( a in a 3:1 72:28; 2=in 2 a To we M4 to ,700 F2 9 We of in a 1201318. we 2 in 5 5 ,000 on a 34M1 1318. a b V To a b we 2 of 2 a to PH b In we NA to a in we a is a ,323 a is to is of in We of 1 in of in of of we of C B in RR 4 in PH we of US we in of By a in we is in To of we of PH on in of In no in PH on VI in of on We in PH on in PG no in of to of of of on to be on on of on of on a in of on an of PH We on of in PH we of in PH of 3in In of in of to a in PH on on PH in to of A (A (, in A/in of in in PH PH PR to be in or in R in in a PH To is of a in of of to In of of A to of of in or of of SA 录 中文摘要 . I . 一章 前 言 . 1 1. 褐飞虱研究概况 . 1 飞虱的形态特征及其生活史 . 1 飞虱的生物型 . 1 飞虱的取食行为及其对水稻的为害 . 3 稻抗褐飞虱资源的挖掘和抗褐飞虱基因的研究 . 3 2. 植物对昆虫抗性研究进展 . 6 物对昆虫的直接防御 . 7 物中具有抗虫作用的抑制剂 . 8 物中具有抗虫作用的次生化合物 . 9 物对昆虫的间接防御作用 . 10 虫取食诱导的挥发性化合物 . 10 虫的特异性引发子 . 11 物抗虫反应中的信号传导途径 . 11 吸式昆虫引起的信号途径 . 12 嚼式昆虫引起的信号途径 . 13 物抗性的遗传基础 . 14 因对基因假说（ . 15 卫假说（ . 16 物先天免疫系统简介 . 18 经克隆的植物抗性基因编码产物的结构特点 . 19 3. 图位克隆法 . 21 子标记遗传连锁图 . 24 的基因的精细定位 . 24 建包含目的区段的重叠群 . 25 定候选基因 . 26 能互补试验 . 26 4. 研究的目的和意义 . 27 第二章 精细定位 . 29 1. 材料和方法 . 29 料 . 29 传背景的分析 . 30 体验证 步定位结果 . 30 体以及 体精细定位 . 32 段物理图谱的构建 . 33 2. 结果与分析 . 34 传背景的分析 . 34 体验证 步定位结果 . 36 期集团法鉴定结果 . 36 抗褐飞虱 描 . 38 体以及 体精细定位 . 39 段物理图谱的构建 . 40