端粒端粒酶的研究进展

端粒、 端粒酶的研究进展 早在 30年代，两名遗传学家 Muller和 Mcclintock 分别在不同的实验室用不同的生物做实验发现染色 体末端结构对保持染色体的稳定十分重要， Muller 将这一结构命名为 端粒（ telomere） 。 直到 1985年 Greider等从四膜虫中真正证实了端粒的结构为极简 单的 6个核苷酸 TTAGGG序列的多次重复后发现了 端粒酶 (telomerase TRAP-eze) 。 在端粒被发现以前，人们就推测生殖细胞之 所以能世代相传，其中可能存在一种维持端粒长 度的特殊机制，体细胞可能正是由于缺乏这种机 制，它的染色体末端才面临着致死性缺失（ deletion） 的危险。因此在正常人体细胞间永生化 细胞（ immortalized cells） 及肿瘤细胞的转化过 程中可能也存在着与生殖细胞类似的机制，但这 一直末予证实。十多年来对端粒和端粒酶的结构 与功能有了较深入的认识。 一、人类染色体端粒及端粒酶： 1972年 James Watson 提出了 “复制末端问题 ” ， 复制 DNA的 DNA多聚酶并不能将线性染色体末端的 DNA完全复制。也就是说在线性 DNA复制时， DNA 多聚酶留下染色体末端一段 DNA（ 一段端粒）不复 制。端粒 DNA复制的特点是在每次 DNA 复制中，每 条染色体的 3端均有一段 DNA无法得到复制，随着 细胞每次分裂， 染色体 3一末端将持续丧失 50- 200bp的 DNA， 因而细胞分裂具有一定的限度，即 分裂寿命。 所以 端粒的长度可作为细胞的 “分裂时 钟 ”，反映细胞分裂能力 。真核细胞染色体末端会随 着细胞分裂而缩短，这个缩短的端粒再传给子细胞 后，随细胞的再次分裂进一步缩短 。 随着每次细胞分裂，染色体末端逐渐缩短，细 胞进入不可逆的抑制状态，直至细胞衰老，此过程 即称为复制性衰老。 人类体细胞遵循这个规则从细 胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂后定 有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细胞亦 如此，这些细胞怎样保持细胞具有继续分裂或长期 分裂的能力呢？科学家们发现端粒确实随着每次分 裂而缩短，但也会被新合成的端粒片断再延长。科 学家们怀疑，可能尚有末被发现的酶，该酶具有标 准的 DNA多聚酶所不具备的功能，能使已缩短的端 粒延长，使科学家们兴奋的是到 1985年首先在四膜 虫中证实了这种能使 端粒延长的酶 端粒酶 的存在 。 端粒（ telomere） 是真核细胞线性染色体未端的 一种特殊结构，由简单重复富含 G碱基的 DNA序列及 端粒结合蛋白共同构成。人类染色体端粒序列已分离 克隆，主要由 5-15个 kb的 5TTAGGG3上千次的重复 序列构成，它就像二顶帽子盖在染色体两端，能保持 遗传信息的完整性，保护染色体免受重组和未端降解 酶的作用，并提供一种可消耗的非编码序列以暂时缓 解或取消复制问题所带来的染色体 DNA的进行性缩 短。大多数体细胞的端粒随周期性复制而逐渐缩短， 最终达到一个临界点，细胞增殖停止、死亡，这可能 是生命有限的重要原因之一。 体细胞的端粒有限长度（ telomere restriction fragments TRFS） 大多数明显短于生殖细胞，青年 人的 TRFs又显著长于年长者，提示 TRFs随着细胞 分裂或衰老，在不断变短，主要是由于 DNA聚合酶 不能完成复制成线性 DNA末端所致。 缺少端粒的染 色体不能稳定存在，这是因为端粒 DNA与结构蛋白 形成的复合物如同染色体的一顶 “帽子 ”，它既可保 护染色体不被降解，又避免了端粒对端融合（ end- end fusion） 以及染色体的丧失，同时端粒能帮助细 胞识别完整染色体和受损染色体。在生理情况下， 端粒作为细胞 “分裂时钟 ”能缩短，最终导致细胞脱 离细胞周期。 端粒酶（ telomerase） 催化端粒合成，是一种逆转 录酶，能以自身的 RNA为模板，反向合成 TTAGGG ， 不断地加在 DNA未端，肿瘤细胞能够不断地分裂 增生， “端粒酶 RNA”结构的存在是先决条件。 现认为，人的端粒酶 RNA可分为两个区与引物作用 ： 一个是模板区， 含有与引物互补的 11个核苷酸 模板区 序列为 11nt(5CUAACCCUAAC-3 ） ； 另一个锚定区 ，与引物的 5 端相配，为 DNA链向 3 端正核酶外延 伸提供路径，而端粒酶中的蛋白质则起催化反应合成的 作用。 人类端粒酶 RNA（ human telomenese RNA hTR ） 是细胞端粒合成不可缺少的模板，若模板区突变， 缺失或反义 RNA可导致端粒的相应改变或丢失。经转 染的细胞端粒序列发生改变，细胞即出现凋亡或分化 。 hTR非模板区序列或空间构象的变化也可使端粒酶 失去活性。在胃癌及神经肿瘤的研究中已发现， hTR 表达与细胞增殖密切相关。端粒酶是在染色体末端不 断合成端粒序列的酶，它可以维持端粒的长度，维持 细胞增殖潜能。 端粒酶由 RNA和 蛋白质 两部分组成。以自身 RNA为模板合成端粒酶重复序列，具有逆转录酶活 性，它的活性不依赖于 DNA聚合酶，对 RNA酶、蛋 白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒的 长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干细胞中可 检测到高水平的端粒酶活性。 二、死亡期细胞假说与细胞永生化 细胞获得永生必须克服两个危机期， M1（ mortality stage 1） 和 M2（ mortality stage 2） 在 M1期细胞对生长因 子等失去反应，产生 DNA合成蛋白抑制因子，细胞周 期检查点（ cell cycle checkpoints） 发送细胞周期停止信 号， DNA合成即告停止。细胞端粒开始缩短，并启动 终止细胞分裂信号，正常人的双倍体细胞不能进一步分 裂，开始衰老、死亡。一些癌基因 SV40T抗原、抑癌基 因 P53， 和 Rb突变均能使 M1期的机制被抑制 ,使细胞逃 逸 M1期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶 仍为阴性，端粒继续缩短，经过 20-30次分裂后，最终 到达 M2期。此时因端粒太短而致染色体极不稳定，于 是大多数细胞退化死亡，极少数细胞由于激活了端粒酶 ，端粒功能得以恢复，染色体形态稳定，可以超越 M2 期使细胞永生化。 端粒酶被抑制 正常人体细胞 端粒丢失 M1期阻滞 SV40T抗原 细胞分裂停止 Rb、 P53与病毒蛋白结合、突变 M1 M2期间隔 永生化 双着丝粒形成 M2期退化 染色体失稳 端粒酶被激活 细胞凋亡 附图：端粒酶在人体细胞永生性转化中 三、端粒酶与肿瘤发生 端粒酶是最近肿瘤研究的热门话题。端粒酶具 有使肿瘤细胞系继续复制生存的特点，成为近期生 命科学界关心与研究的一个热点。端粒缺陷的染色 体不稳定性通过促进半合子化（ hemizygosing）、 转位（ tranlocation）、 扩增及重组装而加速肿瘤进 程。端粒磨耗（ attrition） 的最终结果是端粒酶的 活化，以弥补端粒的丢失而使细胞无限增殖，成为 永生细胞。 因此端粒酶活化是肿瘤进入晚期，而且 是细胞永生的关键一步。 为什么在绝大多数永生细胞系可以表达端粒 酶活性，而在非永生细胞则不能？ 为什么人类大多数体细胞中不能检测到端粒 酶，而在一些肿瘤细胞中则能检测到端粒酶？ 近年来围绕这一问题展开了大量的研究，积累了丰 富的资料，至今仍是一个值得探讨的领域。自从 1994年 Kim等创立 TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文 献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤 衍生细胞系中可被检测到，如前列腺癌、乳癌、口腔癌 、肺癌、肝癌、胃肠基质瘤、膀胱上皮细胞癌及 AML急 性髓性白血病。 Shay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的 检测结果，总结了正常组织（ 196例），原位癌（ 410 例），恶性肿瘤（ 2031例）和癌旁组织（ 690例）的 端粒酶的阳性率，它们分别是 0.5%、 30%、 85%和 11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中 端粒酶的阳性率为 85.0%95.0%，而对应的癌旁或良 性病变组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱 。因此，尽管有研究认为，端粒长度维持还可以借助 于非端粒酶依赖模式，即 ALT（ altematire Lengthening of telomere） 机制， 但其存在上并不能 否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。 美国学者在 400多例来源于 12 种不同组织的原发 肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达 84.8， 而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为 4.4，说 明 端粒酶活性与肿瘤生物学行为密切相关。 端粒酶 阳性的肿瘤比阴性的肿瘤有更大的恶性倾向 。通过 PCR技术形成的端粒重复扩增技术检测前列腺癌， 31例中有 27例（ 87% ）有高表达的酶活性，国内刘 洪坤总结有 84% 前列腺癌中检测到端粒酶活性。端 粒酶可能是保持前列腺癌细胞持续生长必须的酶， 在细胞恶变过程中端粒酶激活是个非常重要的步骤 。 有学者用鼠皮肤做模型，进行化学诱导致癌，分 析处于乳腺癌不同阶段的端粒酶活性，结果发现早期 乳腺癌细胞是二倍体细胞，分化较好，而晚期乳腺癌 则是非整倍体细胞且分化较差，同时端粒酶活性进行 性增加，并伴随着基因水平的不稳定性。在随后的研 究中也得出了相同的结论， 表明人乳腺癌的进程与端 粒酶的活化密切相关，提示端粒酶可以作为诊断乳腺 癌的指标。 美国学者在慢性髓性白血病（ CML） 和急性髓性 白血病（ AML） 的端粒动力学研究中，用 southern印 迹法测量端粒长度，用 stretch-PCR法测出端粒酶活性 ，在 CML白细胞中，端粒酶活性非常低与正常组织相 似。但若 CML急性发作时，白细胞中端粒酶活性就表 现为显著升高。表明 CML由慢性到急性发作时，高度 激活了端粒酶。通过对 CML和 AML病情进展研究，发 现所有病例中 肿瘤细胞的端粒与相应正常细胞相比都 是缩短的，这可能是由于肿瘤细胞分裂次数远远大于 正常细胞之故。 端粒缩短和端粒酶激活的情况，人们称之为端 粒危机 ，这是肿瘤细胞克隆繁衍的强大驱动力， 促进肿瘤的发展。有些实体肿瘤细胞中端粒并末 缩短而是延长出现了矛盾的现象。 端粒危机的的假说有两种解释： 1、 由于大量正常细胞混迹于实体肿瘤样品中，因 而用印迹转移分析法来检验端粒长度是不可信的 。 2、 白血病与实体肿瘤细胞克隆繁衍机制不同。 许多血液学的恶性肿瘤都不会在局部形成肿瘤， 细胞的增殖和循环都是单细胞的，因此每一个白血病 细胞都将竞争更有效的增殖，端粒酶在单个白血病细 胞中的表达是强烈的，瘤细胞分裂快速，端粒缩短， 使突变细胞在短期内形成群落。与此相反实体肿瘤位 于一点而不移动，因此子代对于不同突变的竞争被其 紧邻所限制。实体肿瘤中大多数成功的克隆将比白血 病细胞有更稳定的遗传特性。因为位于特殊环境中的 特殊表型必须保持相当长的时间才能克隆形成群落， 所以 实体肿瘤只有具备较长的端粒，才能有较稳定的 遗传特性，具备 “最好 ”的表型从而被选择，进而生长 繁殖 。 附表 人体组织中端粒酶活性 肿 瘤部位 /类 型 与 肿 瘤 邻 近正常 组织 /良性病 变 肿 瘤 组织 （ %） 肺 3/68（ 4.4%） 109/136（ 80.1%） 乳腺 2/28（ 7.1%） 19/24（ 79.6%） 前列腺 1/18（ 5.6%） 23/27（ 85.1%） 结肠 0/45（ 0） 22/23（ 95.6%） 肝 1/1（ 100%） 卵巢 0/8（ 0） 7/7（ 100%） 肾 0/55（ 0） 40/55（ 72.7%） 神 经 母 细 胞瘤 0/17（ 0） 94/100（ 94%） 血液（淋巴瘤， CLL ALL ） 21/23（ 91.3%） 脑 6/8（ 75%） 其它（ 头顶 部， Wilms瘤 ） 8/93（ 8.6%） 24/26 (92.3) 合 计 14/332 （ 4.2%） 365/430 (84.8) 端粒长度是维持细胞永生所必须，从正常 慢性肝炎 肝硬化 肝癌，端粒的长度进行性 缩短， Tahara 检测 33例原发性肝癌，其中 28例 （ 84.4%）有端粒酶活性，而在肝炎和肝硬化中 均有低活性的酶存在，提示 端粒酶活化可能在 原发性肝细胞癌癌变过程中起重要作用。 更令人感兴趣的是乳腺细针穿刺标本，尿标本 ，膀胱和肠腔冲洗液脱落细胞的端粒酶活性检测中 恶性肿瘤也有较高的阳性表达，这可能有助于肿瘤 的早期诊断。 Hiyama等 对胃癌患者进行端粒酶研 究发现， 端粒酶阳性患者其病灶较阴性者大，淋巴 结转移率也高，预后差 。 然而，端粒酶与恶性肿瘤之间是否平行还有着很 大的分歧 。 Hiyama等研究发现端粒酶活性的高低与神 经母细胞瘤预后相关，高者预后差，低者预后好，在 肺癌中，端粒酶活性高低与恶性度有相关性，胃癌、 乳癌亦有类似的结果报告，但胃癌的端粒酶活性与肿 瘤病理分级、 DNA倍体、分期和预后间未发现有相关 性。胡震研究认为端粒酶活性与肾细胞癌的病理分级 、临床分期有正相关系，而贾瑞鹏等报道认为端粒酶 活性与临床分期、病理分级无明显相关性，由此看来 ，各种恶性肿瘤的端粒酶表达阳性率不同，与肿瘤的 恶性度相关性也不同。 有研究者在转基因小鼠的模型中发现，端粒酶活 性仅在较晚期肿瘤中表达，而鼠端粒酶 RNA（ MTR） 水平在癌前期即上调，且 hTR水平与端粒酶活性并不平 行 36， Aviciion等对人肿瘤细胞株和恶性肿瘤标本的研 究中也观察到类似结果，即 hTR含量高的部分细胞株不 表达端粒酶活性，而后随端粒酶增高， hTR水并不相应 增加，这些结果提示 端粒酶是在肿瘤进展的晚期被激 活，而端粒酶 RNA活性的上调是一早期事件 。 基于这现象，在肿瘤治疗方面，是否可以设计一 些药物来抑制端粒酶 hTR表达的上调，减少端粒酶的 活化有可能达到防治肿瘤和预防复发的目的，也有人 利用反义核酸封闭 hTR模板区，锤头状切割 hTR特异 序列或使 hTR模板区定点突变、或改变 hTR的空间构 象等，消除 hTR作为模板的功能，限制其合成端粒酶 的作用。 四 .端粒酶与肿瘤细胞凋亡 众所周知，细胞凋亡对肿瘤有负调控作用，在恶 性肿瘤的发生及演变过程中，一系列调控细胞生长与 死亡的机制都发生了紊乱，包括：细胞周期的调控、 信号传导途径、细胞凋亡、癌基因与抑制因的表达等 ，启动凋亡的某些基因位于端粒酶结构附近，完整的 端粒结构可以抑制这些基因的表达伴随着细胞的分裂 ，正常体细胞染色体未端的端粒进行性变短，最后凋 亡基因被启动，细胞进入死亡阶段。 Fu等发现，端粒酶具有抑制细胞凋亡的功能，且在 端粒酶活性抑制的情况下， Bcl-2和 Caspases抑制因子具 有保护细胞免受凋亡的作用。因此，具有端粒酶活性和 稳定的端粒长度的细胞，可以阻止细胞凋亡的发生。故 表达端粒酶活性的恶性肿瘤细胞具有抗凋亡的能力 ，在 肿瘤细胞内，端粒酶的激活就是细胞凋亡机制受抑的原 因之一。 五 . 端粒酶与细胞周期 尽管目前有关端粒酶与细胞周期细的关系尚不清 楚，但体外培养细胞同步化研究发现，细胞周期的不 同阶段，端粒酶的活性也不同，端粒酶活性在 G1/S期 进行性增加并于 S期达到最大，在 G2/M期活性几乎测 不到，提示端粒酶维持端粒稳定的作用，可能 S期处于 活化状态，在非复制期处于静止状态。对细胞周期有 抑制作用的药物也能影响到端粒酶的活性。 Aldous等用抗雌激素药物 tamoxifen处理 MCF-7gc癌 细胞时，发现伴随着 MCF-7细胞周期受抑于 G0/G1期， 端粒酶活性也随之下凋，但 temoxifen并无直接抑制端粒 酶活性的作用， Akjycma等发现用 IFN-2处理 Daudi淋巴 瘤细胞，可使细胞周期停滞于 G1期，端粒酶活性也明显 下降， Sharma等用 DMSO诱导人 BurKitt淋巴瘤细胞 Raji ， 可使之进入可逆的 G0/G1期停滞状态，且不伴有可检 测的分化表型改变；在此过程中，端粒酶活性呈动态改 变，说明 端粒酶活性的调节是细胞周期依赖性的 。 有研究表明，转染反义端粒 RNA在封闭细胞的酶端 粒活性表达的同时，伴发 P21与 P16表达水平的升高。 P16 和 P21均在细胞周期的调控中起重要作用，均属于细胞 周期蛋白激酶抑制蛋白，对 G1/S期转换起负调节作用， 它们通过影响 CDK的活性阻止细胞进入 S期， P21在转录 水平还受 P53的调控，即参与细胞调亡的调控。以上提 示，由于在 S期细胞端粒酶的活性受到抑制，并继发引 起细胞周期蛋白激酶抑制因子 P16和 P21表达水平的显著 增高， 从而使细胞在 G1/S期转换受阻而影响细胞从 G1 期过渡到 S期，并有可能延长细胞周期 。 六、端粒酶与肿瘤抑制基因 抑癌基因 Rb， P53 ， P16可以抑制细胞周期蛋 白激酶，阻滞细胞分裂 ，但这些基因单独失活并 不能诱发细胞永生。一些 DNA肿瘤病毒可以使 P53 ， Rb基因失活，增强细胞增殖能力。在一种与突 变 P53基因遗传有关的家族性癌症综合征 Li- Fraumeni综合征病人中，对其成纤维细胞自发性永 生过程进行观察，发现单纯 P53突变或缺失可使细 胞暂时脱离衰老，但不能避免退化。 在永生化细胞 IV-CF中既有 P53失活，又有 P16 表达缺失，还有端粒延长，但缺乏端粒酶活性，提 示 在体内细胞永生中还存在一种延长端粒的机制 。 有些病毒蛋白具有多效性（ pleiotropic effects） ， 它不仅能与 Rb， P53等抑癌基因结合，而且还可 能与其它未辩明的因子结合。 说明 端粒酶仅是引起 细胞永生的一种机制，除此以外，还有使细胞永生 的其它机制，还有保持端粒长度的其它机制 ，有待 于进一步的研究。 七、端粒酶与衰老 衰老即为老化，有生理性和病理性，生理性衰老 (aging)是生物体自成熟期开始，随年龄增长发生的， 并受遗传因素的影响，表现为全身复杂的形态结构和 生理功能不可逆的退行性变化，而疾病或异常因素可 引起病理性衰老（ senility）， 是衰老现象的提早出现 。 Faragher指出衰老细胞逐渐积累会导致人体衰老的 进程（但不排除其它因素），正如美国科学家戴维、 施莱辛格在 2002年国际人类基因组大会所说的， 人的 干细胞有着旺盛的活力，但是细胞有新陈代谢，随着 年龄的增长，很多功能细胞因为老化或磨损而丧失了 原有的功能，然而他们却无法被排出体外，这些 “失灵 ”的细胞越积越多，以致最终防碍了其它细胞的 “正常 工作 ”，这很可能是人类衰老的真正因素。 对于人体衰老的延迟，一直都是人类不断追 求的，端粒与端粒酶的发现为人类抗衰老带来了 曙光。在体外培养中，衰老细胞部分随着增殖会 逐渐增多。既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长 度，那么端粒在细胞复制中就不会丧失，细胞衰 老的进程就可能被阻止，从而延长寿命 这是人 们研究端粒酶与抗衰老关系的热点。 中国科学家董坦君等研究发现 P16基因并非 通过激活端粒酶，而是通过调节 Rb蛋白的活性来 影响端粒的长度，抑制 P16基因的表达，端粒长 度缩短减缓，细胞寿命延长，衰老程度减轻。 Fuxe等报道 P15的过度表达引起的复制性衰老 方向与 P16有相似的能力，同样伴有完整的 Rb蛋 白途径。 端粒酶延长端粒长度以减缓细胞衰老最早的 证据来自 Bodrar等的研究， 1998年在 Science上 刊文报道：将人的端粒酶基因导入端粒阴性的 正常人体细胞中，激活其表达并培养细胞，然 后与未导入该基因的细胞比较，发现前者端粒 显著延长，细胞分裂旺盛，细胞寿命比后者大 大延长，更值得关注的是细胞并无肿瘤样改变 。另外， Targ等发现一些正常啮齿动物的先驱 细胞有一个无限制的增殖能力，但其培养需在 避免分化和阻止细胞循环反应活性的前提下， Kudo等报道端粒酶活性和细胞凋亡可作为宫内 发育延迟的胎盘衰老的指标。 Maffson等认为在神经细胞分化和存活中，端粒 酶与 TERT功能的测定能较好理解神经细胞的功能 ，并可以促进神经细胞在各种各样神经元退化性病 变条件下的恢复。 阿尔茨海默病（ Alzheimer s disease,AD） 是一种常见的神经系统退化性老年病 ，其患者脑血管壁中可分离出致 AD神经元退行性 病变的 淀粉样蛋白， zhu等利用 antisense技术和 端粒酶抑制剂引发胎鼠海马区神经细胞中 TERT的 功能抑制，发现显著增加了由 淀粉样蛋白肽引 起的细胞凋亡，而在脑细胞瘤中 TERT的过量表达 会降低这种细胞凋亡，其原因是 TERT降低的神经 细胞由于暴露于 淀粉样蛋白中而增强了其氧化 性，并使线粒体功能发生障碍， TERT在神经退行 性病变中展现出神经的保护功能，提示在神经细胞 中提高端粒酶活性可以抵止年龄相关的神经退行性 病变，如 AD和脑老化等。 激活端粒酶可以阻止衰老的过程，延长 寿命，可是一旦激活端粒酶，这些细胞将有 可能成为永生化细胞，衍化成癌细胞，为避 免衰老而导致癌症，这显然不是人们的初衷 。但 Shay等认为导入端粒酶的细胞不会成为 癌细胞，这是因为细胞本身并未累积成为癌 细胞所需的改变。不过研究的重点还是应放 在端粒酶的调控机制和细胞繁殖能力上，避 免细胞无限分裂增殖而引发的肿瘤。 八、端粒酶的检测方法 1、 TRAP： Kim等在 1994年建立了能稳定，成批，快速分 析各组织端粒酶活性的 Trap方法。在小块组织甚至 穿刺组织上提取少量组织进行端粒酶活性测定， Kim等利用 PCR为基础的 TRAP（ telomeric repeat amplification protocol） 方法，包括通过改良的去污 溶解手段从少量细胞中获取富含端粒酶的提取物， 然后利用端粒酶催化的引物延伸反应产物作为聚合 酶链反应（ PCR） 的模板，允许产物呈指数扩增， 建立了一种高效、特异的、敏感的端端重复扩增法 （ TRAP）， 其敏感性较传统扩增法提高了一万倍 。 Kim指出端粒酶在肿瘤诊断中敏感性达 85%，特异 性达 91%，标本中少至 10个癌细胞即可测得端粒酶阳性 。腹水、内镜下、细胞刷、细针穿刺、 ERCP均可测定 之，较病理检测阳性率高。此外还可应用多聚酶链反 应 -酶联免疫吸附法（ PCR-ELISA） 方法及分子生物学 原位杂交技术检测端粒酶。 最近， Soriac等对转移性乳腺癌的病人通过外周血 单核细胞俘获的上皮细胞检测出端粒酶阳性，特异性 和敏感性均高，且为非侵入性的方法，这为端粒酶的 检测提出了一新的途径。 TRAP检测方法 ： 制备 S-100提取液，取出 -80 冻存的待检 细胞，加 20ul细胞裂解液 0.5%CHAPS,10mmol/L Tris-HCL (PH 7.5),1mmol/l MgCl2,1mmol/l EGTA,5mmol/l -巯基乙醇， 0.1mmol/l苯甲基磺酰 氟， 10%甘油酊 ，加样器反复吹打 3次混匀，冰 溶 30min ， 12000g 4 离心 20min， 收取上清，用 Folicn-酚法进行蛋白定量。 -80 保存或检测。 端粒酶介导的端粒重复序列延伸： 取 1ul S-100提取液（或取 6ug蛋白质）在 50ulTRAP反应液 20mmol/l Tris-Hcl(PH8.3), 1.5mmol/l MgCl2, 68mmol/l KCl, 0.05%Tween-20, 0.1mmol/l EGTA, 50mmol/l dNTP,含 0.1ug Ts引物 ； 0.5umol/l T4g32蛋白， 2u Taq DNA多聚酶，室 温 30min， 上述反应均需无 RNA酶操作。 PCR扩增端粒重复序列： 室温延伸后加引物 0.1ug,94 2min 变性 94 30S ， 50 30S ， 72 30S 40个循环。 10%聚丙烯凝胶电泳， 17SV 45min ,280V 105min后银染色。 银染色： 聚丙烯凝胶电泳后， 10%冰醋酸固定 20min, 双蒸馏水洗 2min 3次。染色液（ AgNO3lg/l,37% HCOH 1.5ml/l） 中浸泡 30min,双蒸水洗 15S， 在显 色液（ Na2CO3 30g/l,37%HCOH 0.5 ml/l Na2S2O3 5H2O 2mg/l ） 中浸泡 2-5min， 加 10%冰醋酸终止 10min， 观察结果。 2 、 Yashima等提出用存档的石蜡病理标本 以原位杂交的方法测定人类端粒酶 RNA（ human telonerase RNA, hTR） 使得回顾性研究端粒酶活 性与预后的关系成为可能，但是 Avilion等报告的 一组资料发现 hTR在端粒酶阳性的所有病例中都 表达，而在一些端粒酶阴性的病例中也有表达， hTR与端粒酶活性并不完全吻合，所以可能认为 hTR可能不是预测端粒酶活性好的指标。 九、端粒酶与肿瘤治疗 由于端粒酶活性见于绝大多数恶性肿瘤，而人正 常体细胞（生殖细胞、造血干细胞等除外）中未见该 酶活性，使得端粒、端粒酶已成为当今最引人注目的 抗瘤治疗新靶点。 应用端粒酶的拮抗剂，治疗具有端粒酶活性的肿 瘤细胞，限制其细胞寿命，最终导致细胞的特异性凋 亡，这已成为癌症治疗学家关注的焦点 。抑制端粒酶 活性是否会导致肿瘤细胞死亡，而达到治疗肿瘤的目 的呢？ 目前有 2个思路： Greider和 Blackburn提出的利用反义寡核 苷酸取代四膜虫端粒酶模板区（ hTR）， 从而 阻断端粒酶活性。根据端粒酶含有的 RNA是延 长端粒酶模板的特点以阻断 RNA模板，作为抑 制端粒活性的治疗靶点。 使端粒酶 DNA发生突变，突变型的端 粒酶与野生型的端粒酶竞争