DB 37T 3405—2018动物微生物饲料添加剂中植物乳杆菌的检测

ICS 65.120B 04DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/T 34052018动物微生物饲料添加剂中植物乳杆菌的检测Method for determination of Lactobacillus plantarum in animal microbial feed additives2018 - 08 - 17 发布 2018 - 09 - 17 实施山 东 省 质 量 技 术 监 督 局    发 布DB37/T 34052018I前  言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准由主要起草单位：山东农业大学、山东戴尔塔生物工程有限公司、济宁滨阳生物科技股份有限公司、泰安市高新区同心共筑生物科技有限公司、济宁市任城区畜牧兽医局、泰安市新众发生物技术有限公司、泰安市圣达富生物技术推广中心、南京福海生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司。本标准主要起草人：王雪鹏、闫硕、常维山、戴培强、孙杰、张洪喜、王焕高、李福昌、刘建柱、马洪超。DB37/T 340520181动物微生物饲料添加剂中植物乳杆菌的检测1 范围本标准规定了饲用微生物添加剂中植物乳杆菌的检验方法。 本标准适用于饲用微生物添加剂和饲料中植物乳杆菌的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 14699.1 饲料 采样GB/T 20195 动物饲料 试样的制备GB/T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定3 术语和定义下列术语及定义适用于本标准。3.1 植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸菌的一种，厌氧或兼性厌氧。菌体为直或弯的杆状，革兰氏阳性菌。单个、有时成对或成链状排列，最适生长pH 6.2，属于同型发酵乳酸菌。4 试剂及仪器4.1 试剂4.1.1 MRS 碳酸钙培养基：见附录中 A.1。4.1.2 厌氧包：商品化厌氧包，根据培养罐容积和厌氧包说明确定用量。4.1.3 山梨醇发酵管：见附录中 A.2。4.1.4 棉子糖发酵管：见附录中 A.2。4.1.5 甘露醇发酵管：见附录中 A.2。4.1.6 蔗糖发酵管：见附录中 A.2。4.1.7 水杨苷发酵管：见附录中 A.2。4.1.8 纤维二糖发酵管：见附录中 A.2。4.1.9 七叶苷发酵管：见附录中 A.3。4.1.10 革兰氏染色液：见附录中 A.4。4.1.11 硝酸盐培养基、硝酸盐试剂: 见附录中 A.5。DB37/T 3405201824.1.12 明胶培养基：见附录中 A.6。4.1.13 过氧化氢酶检验：见附录中 A.7。4.2 仪器4.2.1 恒温培养箱：36 1 。4.2.2 普通冰箱：0 4 。4.2.3 恒温水浴锅：46 l 。4.2.4 电炉：温度为可调式。4.2.5 吸量管：容量分别为 1 mL、10 mL、25 mL。4.2.6 广口瓶或三角瓶：容量为 500 mL。4.2.7 培养皿：直径为 90 mm。4.2.8 试管：18 mm180 mm。4.2.9 光学显微镜：10100 倍。4.2.10 高压灭菌锅：使用温度为 121 。4.2.11 烘干箱：使用温度为 160 。4.2.12 厌氧培养罐：2 L10 L。4.2.13 玻璃珠：直径为 4 mm5 mm。4.2.14 振荡箱：可调式，振荡频率为 0 rpm200 rpm 。5 样品准备5.1 样品的采集所采样品真实、具有代表性。采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，灭菌后使用。采样数量和方法按照 GB/T 14699.1 执行。5.2 试样的制备按照 GB/T 20195 进行试样的制备。6 操作步骤6.1 样品稀释准确称取样品 25.0 g ，加入含有 50 个玻璃珠和 225 mL 生理盐水的 500 mL 灭菌三角瓶中。200 rpm 振荡箱振荡处理 0.5 h1 h ，即得 1:10 初始稀释液。吸取初始稀释液 1 mL 于含 9 mL 无菌生理盐水试管中，即得 1:100 稀释液。根据样品含菌量，做进一步的十倍系列递增稀释。6.2 样品接种选取 3 个适宜的稀释度，吸取 1 mL 6.1 所述稀释液于灭菌培养皿内。每个稀释度移种2个培养皿。注入已预冷至 50 的MRS碳酸钙培养基 15 mL 左右，混匀。6.3 培养DB37/T 340520183植物乳杆菌计数培养基凝固后，翻转培养皿，置于厌氧培养罐中，放入厌氧包，密封后放入 36 1 恒温培养箱内，36 培养 48 h72 h。6.4 菌落计数观察菌落形态，选择菌落数30300的培养皿，计数带有溶钙环的典型菌落。 7 确证试验7.1 菌落特征将典型单个菌落在MRS碳酸钙培养基上划线分离，厌氧培养24 h72 h，观察菌落形态。7.2 菌体形态每个培养皿挑取至少 1 个典型的菌落进行革兰氏染色、镜检。革兰氏染色方法见附录A.4。7.3 生理生化确证试验挑取典型菌落分别接种麦芽糖、甘露醇、山梨醇、棉子糖、蔗糖、七叶苷、水杨苷、纤维二糖的生化反应管，并进行过氧化氢酶、硝酸盐还原、液化明胶试验。7.4 确证结果7.4.1 菌落形态菌落为乳白色，圆形，不透明，菌落直径 1 mm3 mm 。菌落周围培养基有透明环，透明环直径 1 mm3 mm 。7.4.2 菌体形态植物乳杆菌应为革兰氏阳性、单个存在的丝状杆菌，无芽孢。7.4.3 糖发酵试验植物乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果见表1 。表 1 植物乳杆菌的碳水化合物发酵试验结果麦芽糖 甘露醇 山梨醇 棉子糖 蔗糖 七叶苷 水杨苷 纤维二糖+ + + + + + + +注：+ 表示90%以上菌株为阳性。7.4.4 其他生理生化试验结果过氧化氢酶阴性、硝酸盐还原阴性、液化明胶阴性。8 结果计算及表述DB37/T 340520184菌落计数后，随机挑取5个菌落进行鉴定（见第7章），计数证实为植物乳杆菌的菌落数，计算出该皿内的植物乳杆菌的活菌数，然后乘以稀释倍数即得每克或每毫升样品中植物乳杆菌的活菌数，按式（1）计算：(1)5CABf式中：A测定的植物乳杆菌菌落数，单位为菌落形成单位每克（CFUg）或菌落形成单位每毫升（CFUmL）；B植物乳杆菌菌落总数 ；C5个鉴定的菌落中确认为植物乳杆菌的菌落数；f稀释倍数 。注 1：按照 GB/T 8170-2008 数值修约规则计算出的结果保留至两位有效数字，也可以将样品中植物乳杆菌的菌落数记录为 1.09.9 乘以 10 的指数幂表示。注 2：报告每克或每毫升样品的植物乳杆菌估计数，单位为 CFU/g 或 CFU/mL 。DB37/T 340520185A A附 录 A（资料性附录）试剂A.1 MRS碳酸钙培养基A.1.1 成分见表A.1。表 A.1 MRS 碳酸钙培养基成分成分 规格蛋白胨 10.0 g牛肉粉 5.0 g酵母粉 4.0 g葡萄糖 20.0 g吐温80 1.0 mLK2HPO47H2O 2.0 gCH2COONa3H2O 5.0 g柠檬酸三铵 2.0 gMgSO47H2O 0.2 gMnSO44H2O 0.05 g琼脂粉 20.0 g碳酸钙 20.0 gpH 6.2A.1.2 制法将上述成分加入到 1000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节pH，分装后 121 高压灭菌 15 min20 min 。A.2 植物乳杆菌糖发酵管A.2.1 基础成分见表A.2。表 A.2 植物乳杆菌糖发酵管基础成分成分 规格牛肉膏 5.0 g蛋白胨 5.0 g酵母浸膏 5.0 g吐温80 0.5 mLDB37/T 340520186表A.2 （续）成分 规格琼脂 1.5 g1.6 % 溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL蒸馏水 1000 mLA.2.2 制法按 0.5 % 加入所需糖类，并分装小试管，121 高压灭菌 15 min20 min 。A.3 七叶苷发酵管A.3.1 成分见表A.3。表 A.3 七叶苷发酵管成分成分 规格蛋白胨 5.0 g磷酸氢二钾 1.0 g七叶苷 3.0 g柠檬酸铁 0.5 g1.6 %溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL蒸馏水 100 mLA.3.2 制法将上述成分加入蒸馏水中，加热溶解，121 高压灭菌 15 min20 min 。A.4 革兰氏染色液A.4.1 结晶紫染色液A.4.1.1 成分见表 A.4。表 A.4 结晶紫染色液成分成分 规格结晶紫 1.0 g95 乙醇 20 mL1 草酸铵水溶液 80 mLA.4.1.2 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。DB37/T 340520187A.4.2 革兰氏碘液A.4.2.1 成分见表 A.5。表 A.5 革兰氏碘液成分成分 规格碘 1.0 g碘化钾 2.0 g蒸馏水 300 mLA.4.2.2 制法将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 300 mL 。A.4.3 沙黄复染液A.4.3.1 成分见表A.6。表 A.6 沙黄复染液成分成分 规格沙黄 0.25 g95 %乙醇 10 mL蒸馏水 90 mLA.4.3.2 制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.4.4 染色法A.4.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 1 min ，水洗。A.4.4.2 滴加革兰氏碘液，作用 1 min ，水洗。A.4.4.3 滴加 95 % 乙醇脱色，约 15 s30 s ，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.4.4.4 滴加复染液，复染1 min。水洗、待干、镜检。A.5 硝酸盐还原A.5.1 培养基A.5.1.1 成分见表A.7 。DB37/T 340520188表 A.7 培养基成分成分 规格蛋白胨 20.0 g牛肉膏 3.0 g氯化钠 5.0 g氯化钾 1.0 g蒸馏水 1000 mLA.5.1.2 制法 溶解各成分于水中，必要时加热。调整PH值，使培养基pH值在 25 时为 7.40.2 。分装试管，121 高压灭菌 20 min30 min 。A.5.2 试剂见表A.8 。表 A.8 试剂成分成分 规格对氨基苯磺酸 0.5 g甲液10%乙酸溶液 150 mL甲萘胺 0.1 g蒸馏水 20 mL乙液10%乙酸溶液 150 mL二苯胺 0.5 g蒸馏水 20 mL二苯胺试剂浓硫酸 100 mLA.5.3 试验方法接种菌于上述培养基中，36 1 培养 2 d4 d。加入甲液和乙液各1滴，观察结果。如溶液变为红色、橙色、棕色为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，可加 1滴2滴二苯胺试剂，如不呈蓝色，也为硝酸盐还原阳性，呈蓝色则为阴性。A.6 明胶培养基A.6.1 基础成分（PH 7.0）见表A.9。DB37/T 340520189表 A.9 明胶培养基基础成分成分 规格蛋白胨 1.0 g酵母提取物 1.0 g葡萄糖 0.1 g盐溶液 4.0 mL蒸馏水 100 mLA.6.2 盐溶液成分见表 A.10 。表 A.10 盐溶液成分成分 规格（g）无水 CaCl2 0.2MgSO47H2O 0.48K2HPO4 1.0NaHCO3 10.0KH2PO4 1.0NaCl 2.0注：将无水CaCl 2与MgSO 47H2O混合溶解于300 mL蒸馏水中，再加50