chap94糖的研究方法

9.4 糖复合物生物功能研究方法第九章 糖链研究方法Glyco-biology 糖链的功能需要进行体内研究v许多缺乏糖基转移酶或糖苷酶的细胞系在体外并未表现出明显的表型，而在体内却能引发病理改变和在某些情况下导致胚胎死亡。v哪些方法可以用来造成糖复合物中糖链的改变进而观察其生物功能改变？糖链缺失 /增加糖链上的糖基改变糖链末端糖基缺失 /增加Glyco-biology 糖复合物中糖链功能的研究方法利用糖基化过程不同利用糖基化过程不同的天然突变细胞株的天然突变细胞株用糖苷酶体外修饰造用糖苷酶体外修饰造成糖链结构差异成糖链结构差异用糖合成抑制剂造成用糖合成抑制剂造成体内糖基化加工的差体内糖基化加工的差异异通过定点突变改变糖通过定点突变改变糖蛋白的糖基化位点，蛋白的糖基化位点，使糖链增加或缺失使糖链增加或缺失关闭或过表达糖链生关闭或过表达糖链生物合成必需的糖基转物合成必需的糖基转移酶或糖苷酶的基因移酶或糖苷酶的基因利用自发突变的人类利用自发突变的人类或动物模型或动物模型 糖复合物中糖链的功能研究Glyco-biologyv1）利用糖基化过程不同的天然突变细胞株n 可将细胞用化学（如烷化剂）、物理（如电离辐射）或生物（如病毒转染）方法进行处理，使细胞发生诱变。n 可使用凝集素（细胞毒性或导致细胞黏附）抗性、辐射自杀、影印铺板等方法筛选突变体。n 常缺失或过表达糖链合成加工中的某一或是某些糖基转移酶或糖苷水解酶。n 但糖链加工的缺陷有时不完全或不专一。n 可以在体外研究细胞粘附，分子识别和蛋白质折叠、分拣等。但对于糖链在胚胎发育和分化中的作用研究有局限性。糖复合物生物功能研究方法（ 1）Glyco-biology 影印铺板法筛选突变体细胞因相关酶缺陷无法进行硫酸化的突变株因 相关酶缺陷导致 HSPG糖链结构改变而无法与bFGF结合Glyco-biologyv糖基供体（糖核苷酸）的合成和转运缺陷v糖基转移酶的动力学性质或细胞定位改变v新的糖基转移酶被活化vGPI锚生物合成的突变体v蛋白聚糖组装中的突变体v糖脂和粘蛋白组装中的突变体 v N-糖基化过程有关的细胞突变株糖核苷酸合成和转运中的细胞突变株Strain Biochemical defect Glycosylation phenotypeLec32 (CHO) CMP-Neu5Ac synthetase sialic acidLec2 (CHO) CMP-Neu5Ac transporter reduced in Neu5Ac; N- and O-glycans terminate in GalLec8 (CHO) UDP-Gal transporter reduced in Gal; N-glycans terminate in GalNAcLec13 (CHO) GDP-Man-2,4-dehydratase reduced in Fuc residuesldlD (CHO) UDP-Gal/UDP-GlcNAc-4-epimeraseN-glycans reduced in Gal and terminate in GlcNAc；O-glycans and chondroitin sulfate not present in the absence of added GalNAc； GAG deficient in the absence of GalD33W25-1 (MDAY-D2) SAP (CHO)activation of CMP-Neu5Ac hydroxylaseterminate in Neu5Gc糖基转移酶的动力学性质或细胞定位改变Strain Biochemical defect Glycosylation phenotypeLec1 (CHO) GlcNAc-TI Man5GlcNAc2AsnClone 15B (CHO)Lec1A (CHO) GlcNAc-TI (Km defect)complex mixture of glycans and Man5GlcNAc2AsnRicR21 (BHK) GlcNAc-TII Man3GlcNAc2AsnLec4A (CHO) GlcNAc-TV located in the incorrect compartmentcomplex N-glycans lack (1,6)GlcNAc branch from Man(1,6)Sil (KB) 2,3sialyl-T reduced Neu5Ac on O-glycans新的糖基转移酶被活化Strain Biochemical defect Glycosylation phenotypeLEC11 (CHO) (1,3)Fuc-T terminal Lewis X, SA-Lewis X, and VIM-2LEC14 (CHO) GlcNAc-TVII additional GlcNAc in coreLEC18 (CHO) GlcNAc-TVIII additional GlcNAc in coreLEC10 (CHO) GlcNAc-TIII complex chains have the bisected GlcNAc residueGlyco-biology 糖复合物生物功能研究方法（ 2）应用内切和外切糖苷酶n 内切糖苷酶n PNG酶（肽 N聚糖酶）： GlcNAc GlcNAc Asnn 内切酶 H、 CII、 D、 F： GlcNAc GlcNAc Asnn POG酶： GalNAcSer/ Thrn 外切糖苷酶：n 神经氨酸酶； 、 半乳糖苷酶； -N-乙酰氨基己糖酶； 、 甘露糖苷酶； 岩藻糖苷酶等。n 有严格的立体专一性和键专一性。但也有一些酶没有严格的键专一性。Glyco-biologyv天然糖蛋白很难被完全酶解；v糖链去除可能导致改变蛋白质空间构象，不一定就是糖链本身的功能。糖苷酶法的问题Glyco-biologyv3） DNA定点突变技术，改变蛋白质糖基化位点：n 以相同电荷或极性的氨基酸取代，如 Asn Gln，Ser Cys， 一般不会引起蛋白质构象的变化。对糖链的缺失有选择性。但不能研究单个糖基的作用。v4）糖基转移酶基因敲除或封闭，或基因过表达：n 利用转基因技术将外源 DNA导入生殖细胞或 ES细胞，进行基因 knock-out, knock-in or knock-down， 研究转基因小鼠的发育和表型变化。n 可研究单个糖基的功能。糖复合物生物功能研究方法（ 3）Glyco-biologyApproaches to altering glycosylation in studies of oligosaccharide functionGlyco-biology 糖复合物生物功能研究方法（ 4）5）利用自发突变的人类和动物模型 动物的缺陷主要影响蛋白聚糖的生物合成，因为这些缺陷引发的不良形态容易识别。 多种溶酶体贮积异常的突变。 多种 CDGS疾病个体糖基化途径自发异常引发的疾病举例Carbohydrate-deficient glycoprotein syndromes (CDGS)several genetic defects in the assembly, transfer, and early processing of N-glycans 人白细胞粘附缺乏综合症 II型 decreased conversion of GDP-Man to GDP-Fuc; 人Galactosemia半乳糖血症 defects in forming UDP-Gal, e.g., Gal-1-phosphate uridyltransferase人斑点状角膜营养不良 I型 defective keratan sulfate biosynthesis 人Ehlers-Danlos 先天性结缔组织发育不良综合症伴早老综合症partial deficiency of xylosylprotein 4 galactosyltransferase (GalT-I) 人骨发育不良 diastrophic dysplasia sulfate transporter; defect in sulfate availability 人矮型病 Brachymorphism (bm) adenosine-phosphosulfate kinase deficiency (SK2); defect in synthesis of sulfate donor (PAPS)鼠软骨基质缺乏 aggrecan proteoglycan gene (frameshift) 鼠Glyco-biology6）应用糖链合成或加工抑制剂衣霉素 （ Tunicamycin） ： 既有尿苷、酰化葡萄糖样结构，又有长链脂肪酸，和 G寡糖合成起始反应的两个底物有结构相似，因此可抑制 G寡糖合成的起始反应，进而也抑制了蛋白质的 N-糖基化。但对糖蛋白和糖基化位点无选择性，也可能影响糖蛋白的空间构象。糖复合物生物功能研究方法（ 5）衣霉素 N-糖链从头合成抑制剂糖合成抑制剂的种类抑制 剂 的种类 靶 标代 谢 抑制 剂 参与共同中 间 体形成的步 骤 ，如PAPS或核苷酸糖衣霉素 抑制 N-糖 链 的从 头 合成；影响 肽 聚糖合成植物碱 抑制 对 G寡糖 进 行修剪的糖苷 酶 而影响 N-糖基化，如苦 马 豆碱，抑制-甘露糖苷 酶 II。底物 类 似物 专 一抑制糖基 转 移 酶 或糖苷 酶糖苷引物 使糖 链组 装从内源接 纳 体 转 向外源引物Glyco-biology 代谢抑制剂v布莱飞尔定 A(Brefeldin A):引起邻近反式高尔基体网内的高尔基体组分逆向运输v氯酸盐作为硫酸盐的类似物竞争性结合硫酸化酶而干扰 GAG的合成vGlyco-biology 植物碱：糖苷酶的天然抑制剂v植物碱通过抑制参与形成 N-糖链的糖苷酶而抑制 N-糖链的后加工过程。通常不干扰蛋白质折叠。苦马豆碱抑甘露糖酶 A导致无法合成复杂型 N糖链，而大量积聚高甘露糖型和杂合型糖链合成的底物结构类似物作为糖基转移酶抑制剂Glyco-biology 糖苷引物vXyl-O-R可以有效穿越质膜，进入糖基转移酶