植物多糖的研究进展

植物多糖的研究进展植物多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以 -或 - 糖苷键所组成的化合物。植物源的多糖类化合物拥有免疫调节、抗肿瘤活性以及降血糖、降血脂活性和抗氧化等的独特功能，而且大多数毒性较小，在预防疾病上优于其他化合物，因此其应用具有广阔的前景；此外，由于多糖本身在质量标准、表征鉴定等方面有自身研究难度和特殊性，有待于深入研究。现对植物多糖的提取、分离、鉴定、结构分析及生物活性研究发展进行综述。多糖(polysaccharides)又称多聚糖，是一类具有广泛生物活性的由单糖组成的天然高分子化合物，广泛存在于植物、动物和微生物中，是维持生命活动正常运转基本物质之一。其中植物多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以 -或 - 糖苷键所组成的化合物，大部分植物多糖不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动四大基本物质之一，与维持生命功能密切相关1。近年来，大量研究表明，多糖除有免疫调节、抗肿瘤生物学效应外，还有抗衰老、降血糖、抗凝血等作用，且对机体毒副作用小，因此，对多糖研究已成为食品行业热门领域。我国对多糖研究起步较晚，但近年来，由于生物学、化学等学科飞速发展，我国对多糖及其复合物化学结构和药理活性研究越来越深入。目前可以肯定的是多糖生物活性与其结构、分子量溶解度、粘度等因素有关，其高级结构比一级结构在活性决定方面起更大作用。由于上述因素差异性，决定多糖具有丰富多彩生物活性。 1 植物中多糖的测定1.1 多糖的提取与分离纯化多糖的分离纯化是指多糖研究中获取研究对象的过程。一般这一过程包括分离、纯化和纯度鉴定 3 步。其中分离纯化是多糖研究的关键，其成功与否、效果的好坏都会直接影响后续研究的可行性与可信度。所谓分离就是将存在于生物体中的多糖解离出来的过程。从植物中提取多糖，一般先用石油醚、乙醚等有机溶剂提取除去脂溶性杂质，然后根据不同的溶解度选择一种溶剂进行萃取2。大多数多糖可采用一定温度的水或稀碱溶液提取，要尽量避免酸性条件，这会引起多糖中糖苷键断裂。而有些生物材料，在分离多糖前，还需进行脱脂或脱色处理。分离沉淀后获得的多糖提取物中，常会有无机盐、醇不溶的低分子有机物，大分子蛋白质等杂质。而多糖的纯化就是指将粗多糖中的杂质去除而获得的单一的多糖组分。一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级；而脱除非多糖组分则一般是先脱除蛋白质后再去除小分子杂质。 多糖脱蛋白常用的方法有 Sevag 法、三氯乙酸法；而除去小分子物质最常用 DEAE 纤维素层析、,Sephadex 凝胶过滤、季铵盐沉淀、盐析、亲和层析、超滤和电泳等方法。1.2 多糖的鉴定在获得单一多糖组分后，必须对其纯度进行鉴定。近年来发现，多糖的糖链在分子生物学中具有决定性的作用，但要测定完整的结构很困难。同时也发现，多糖的活性与分子量、溶解度、粘度有关。所以多糖的鉴定一般包括纯度、分子量以及组成多糖的各个单糖的鉴定。需要说明的是：多糖的纯度不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即便是多糖纯品，其微观也并不均一，仅代表相似链长的多糖分子的平均分布，通常所谓的多糖纯品实际上也只是一定相对分子质量范围的多糖的均一组分。科研工作者曾采用经水或甲醇等有机溶剂水溶液浸泡，低温减压浓缩、流水透析、乙醇沉淀、再经凝胶柱层析、冷冻干燥等途径得到较单一多糖成分，再经高效液相色谱或凝胶层析测定其纯度、分子量，酸水解气-液相层析或纸层析测定其单糖组成3。目前常用于多糖纯度鉴定的方法有凝胶过滤法、高压电泳法、超离心法、旋光测定法、毛细管电泳法等。其中应用最多的是凝胶层析法，该法的准确度高。多糖的生物大分子结构比蛋白质更为复杂，这不仅因为组成多糖的单糖品种繁多，而且只有一种单糖组成的多糖，其连接方式的不同以及可能存在支链也可造成多糖的结构测定非常困难。多糖的结构有 4 级的概念：一级包括糖基的组成、排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头物构型及糖链有无分支，分支位置与长短；二级包括多糖骨架链间以氢键结合所形成的各种聚合体；三级包括多糖一级结构的重复顺序，由于糖单元的羟基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作用，导致有序的二级结构在空间形成规则而粗大的构象；四级包括多聚链问非共价链结合形成的聚集体。例如，木聚糖是植物体中最常见的一种半纤维素，最近 Mazeau 等对木聚糖的构象进行研究，发现其中的羟基被月桂酸酯化后，酯基对两边的糖苷键的构象有很大的影响。简单地说，多糖的结构分析包括糖基的组成以及这些糖基的连接方式。糖基的成分测定首先要了解它是由哪些单糖组成、各种单糖的比例如何，通常采用将苷键用酸、酶、甲醇水解或选择性降解，由此将大分子裂解成各种小片段，各自分析小片段的结构后，拼凑成整个化合物的结构4。主要结构分析手段见表 1。表 1 测定糖链结构的常用方法 糖链结构 常用方法单糖组成和分子比例 部分酸水解，完全酸水解，纸色谱，气相色谱吡喃环或呋喃环 红外光谱连接次序 选择性酸水解，糖苷酶顺序水解，核磁-或 - 异头异构体 糖苷酶水解，核磁共振，红外光谱羟基被取代情况 甲基化反应，过碘酸化反应，核磁共振，质谱糖链-肽链联结方式 单糖与氨基酸组成，稀碱水解法，肼解反应1.3 多糖含量的测定多糖含量的测定常采用比色或滴定法。比色法使用历史悠久且已被广泛使用，该法须用从植物中提取、纯化后的多糖进行显色、比色测定，方法中采用葡萄糖代替标准品，测定样品多糖的相对含量。滴定法主要是采用 Fehling 还原滴定法，此法是多糖水解成还原性的单糖后，以次甲基兰作指示剂，用标定过的碱性酒石酸酮溶液直接进行还原滴定，根据样液消耗的体积计算其含量。本法快速简便，不需精密仪器，对所有多糖均适用近年来，高效液相色谱法越来越多地用于测量植物中的多糖。它分析速度快，可以直接进样，不必制备成衍生物，而且有较高的分辨率5。此外还有气相色谱法 (GC)、薄层扫描法(TLCS)、高效毛细管电泳法(HPCE)等，可根据药材所含多糖及其化学成分的性质进行选择。用高效液相色谱法(HPIC)分析芦荟多糖方法简单，一般在常温下操作，经色谱柱分离的组分可收集，进一步与质谱、红外光谱、核磁共振等仪器联用进行分析鉴定。为了提高灵敏度，也可采用衍生化的方法将样品组分制备成具有紫外吸收或能发出荧光的衍生物，用紫外检测器、二极管阵列检测器或荧光检测器进行检测，虽然样品制备操作复杂，但分析灵敏度可大大提高。用高效液相色谱法测定芦荟凝胶样品，可得到一个“E”峰(排序第五而得名)，已鉴别为 L 一苹果酸，是芦荟中的一种有机酸。孙达远等人用高效液相色谱法对芦荟冷冻粉中多糖和甙进行测定，并应用高速逆流色谱对 100:1 全叶芦荟冷冻干燥粉进行分离，一次分离出芦荟多糖和纯度为 w=97.93%的芦荟甙，再应用液相制备柱将芦荟多糖进行高效分离，从而达到定量测定芦荟多糖的目的。除此之外，还可用高效凝胶渗透色谱法测定多糖分子量大小。用反相色谱法分离肽聚糖及某些寡糖，并用寡糖的部分降解法测定寡糖分子结构中单糖的排列顺序。用氨旅烷柱液相色谱法分离硫酸软骨素、硫酸皮肤索、硫酸肝素的酶水解产物中还原性不饱和二糖物质。用高效离子效换色潜法分离寡糖的硫酸、唾液酸和糟醛酸衍生物等。李静等还报道用水溶性凝胶渗透色谱测定芸芝多糖各组分的分子量及相对含量。HPLC 对多糖的分离纯化、组成分析( 单糖和寡糖)、定量分析、分广量的测定等作出很大贡献，大大推动了多糖研究的进展。2 植物多糖生理活性2.1 免疫调节与抗肿瘤活性由于现代医学、细胞生物学及分子生物学快速发展，人们对免疫系统认识越来越深入，免疫系统紊乱，不仅会产生多种疾病，且与人体衰老及老年人多发病有关。植物多糖最重要和最主要的生物活性是免疫调节，对其免疫增强作用机理的研究以深入到分子、受体水平6。多糖对机体的免疫调节主要通过以下几个途径和方式： 激活巨噬细胞， 激活网状内皮系统， 激活 T 和 B 细胞， 激活补体， 激活干扰素生成， 激活白细胞介素生成， 诱导肿瘤坏死因子7。多糖作为免疫增强剂，不但能激活 T 细胞、B 细胞、M及 NK 细胞、CTL 细胞、LAK 细胞等免疫活性，激活网状内皮系统吞噬、清除老化细胞和异物及病原体，还能促进 IL-1，IL-2，TNF-，INF-，NO 等生成，调节机体抗体和补体形成，提高机体抗肿瘤免疫力。同时也影响细胞生化代谢、抑制肿瘤细胞周期和抑制肿瘤组织中 SOD 活性8。牛膝多糖在体外可以提高老年小鼠 T 淋巴细胞的增殖能力和 IL-2 的分泌；体内能显著提高老年大鼠 T 淋巴细胞和血清中 TNF- 或 TNF- 及 NO 的产生，降低其 sIL-2R 的产生，纠正老年鼠免疫低下的状态；人参多糖大多数以中性糖为主，对正常动物单核巨噬细胞系统的吞噬功能有刺激作用，能增强机体（尤其是免疫功能低下的机体）的体液免疫反应，对特异性免疫和非特异性免疫皆有影响9。枸杞多糖具有明显的抗肿瘤活性，还可显著提高荷瘤鼠胸腺指数、巨噬细胞吞噬功能、脾细胞抗体形成、淋巴细胞转化反应、细胞毒性 T 淋巴细胞杀伤功能及降低脂质过氧化值，以提高免疫功能的方式抑制荷瘤鼠的肿瘤效应10。灵芝多糖对小鼠正常组织 SOD 活力有促进作用，而对肿瘤组织中 SOD 活力产生抑制，促进肿瘤细胞脂质过氧化，加速肿瘤细胞死亡，而对正常组织起到保护作用。香菇多糖能增加小鼠脾脏重量，增加抗体生成，起到增强体液免疫作用。另据报道，人参多糖、地黄多糖、竹叶多糖也具有抗肿瘤作用11。2.2 降血糖和血脂活性降血糖、降血脂功能也是植物多糖的重要功能之一，近些年有许多这方面的研究和报道。甘蔗多糖、海带多糖、麻黄多糖、山药多糖等都具有降血糖或血脂的活性。化学结构与肝素类似的植物多糖能促进脂蛋白脂肪酸释放，使血液中大分子的脂质分解成小分子，因而对血脂过多引起的血清浑浊有澄清作用，也能明显降低血胆固醇含量。枸杞多糖(LBP)和茶叶多糖(TPS)混合物对型糖尿病模型动物的降血糖作用及对糖尿病并发症相关指标的影响12。结果发现 LBP 与 TPS 混合物具有增强 型糖尿病模型动物胰岛素敏感性、增加肝糖原储备、降低血糖水平，同时还可以抑制肾脏醛糖还原酶(AR)活性，降低血清糖基化终产物-肽(AGEP)水平，提高血清过氧化酶歧化酶(SOD) 水平，从而预防糖尿病并发症。百合多糖具有修复 -胰岛细胞、增强胰岛素的分泌、降低肾上腺皮质激素分泌以及促进肝脏中血糖转化为糖元的联合作用，从而达到降低血糖的效果13。血清胆固醇、甘油三酯含量是高脂血症重要指标，高密度脂蛋白(HDL)能转运胆固醇，其中载脂蛋白又能激活卵磷脂胆固醇转脂酰基酶，催化卵磷脂分子中 B 位脂肪酰基与胆固醇作用生成胆固醇脂，使胆固醇和甘油三酯含量降低，所以高密度脂蛋白是高脂血症辅助标志14。众所周知，血清中 TG、TcH、LDL 均是形成动脉粥样硬化促进因子，LDL 升高是心肌梗塞危险因子，而 HDL 能将外周血中多余胆固醇带回肝脏代谢生成胆汁酸，因此HDL 升高是抗心肌梗塞安全因子。南瓜多糖(PP) 水溶液 200 mg、500 mgkg 经腹腔注入正常及糖尿病模型小鼠后，两者总 TG、LDL 下降，HDL 升高，所以 PP 可改善脂质代谢，降低血脂15。2.3 抗病毒活性大量研究表明， 许多多糖对种病毒有抑制作用，如艾滋病毒 (HIV 一 1)、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒、乌肉瘤病毒等。目前，多糖衍生物尤其是硫酸酯化多糖是当今多糖研究中一个热点，研究发现它具有显著抗病毒作用，尤其是对艾滋病病毒 HIV-1 抑制作用。据报道甘草多糖 GPS 对牛艾滋病病毒 BIV、腺病毒、柯萨奇病毒均有较明显抑制作用，对BIV 抑制率为 36.2%。GPS 还可影响腺病毒和柯萨奇病毒吸附和进入细胞功能，对它们也有明显抑制和直接灭活作用，达到保护细胞目的16。另据报道，从红藻中分离硫酸半乳聚糖能在体外抑制 HI-1 和 HIV-2 引起细胞病变， 同时也抑制合胞体形成；另外还可抑制如疱疹病毒、砂粒病毒、弹状病毒、粘病毒等其它病毒。此外，板兰根多糖、硫酸葡聚糖、硫酸香菇多糖、硫酸戊聚糖、卡拉胶等也具有抗病毒作用。2.4 抗氧化衰老活性对于衰老这一自然现象发生机理众说纷纭，如免疫学说、自由基学说、交联学说、遗传学说等。免疫学说认为随年龄增大，机体免疫功能下降或紊乱，结果胸腺萎缩、T 细胞损耗，从而导致机体衰老，寿命缩短。某些多糖能从整体上增强机体免疫力，在一定程度上延缓衰老，防治老年病。通常情况下，多糖具有抗衰老作用与提高免疫功能、清除体内氧自由基及抗脂质过氧化密切相关。一般来说，丙二醛(MDA)是反映机体脂质过氧化损伤的重要指标，因为 MDA 具有很强的生物毒性，极易与磷脂蛋白发生反应改变细胞膜的通透性，而造成组织细胞的氧化损伤。研究发现，枸杞、人参、银杏叶、天麻水提液均可降低小白鼠体内 MDA 的含量。人参对脑和心肌中 MDA 含量的抑制率最高，分别为 20.6%和 23.1% ；天麻对肝和肾组织中MDA 含量的抑制率最高，分别为 14.55 和 13.6%17。从婺源粗老绿茶叶中提取纯化出了茶叶多糖，研究了它对超氧自由基、DPPH 自由基的清除作用，以及对 B-胡萝卜素- 亚油酸氧化体系的抑制作用，以此证明了茶叶多糖具有抗氧化活性。对云芝多糖的实验中发现：实验组小鼠的血红细胞 SOD 活性、皮肤和尾腱的羟脯氨含量、胸腺系数均比对照组有所增加；实验组的血清免疫球蛋白也较对照组增多，而心肌脂褐素(1ipofuscin) 含量和大脑脂质过氧化物(1ipid hydroperoxide)含量明显降低，证明云芝多糖有提高机体免疫应答和增强机体清除脂质过氧化物的抗衰老作用18。2.5 其他活性螺旋藻多糖具有抗辐射能力，除能增强骨髓细胞的增殖活性外，还能显著减轻小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖细胞的辐射遗传损伤，大大降低辐射引起的突变频率，而且具有维持藻体本身超强辐射抗性的重要作用，现已开发成抗辐射医药保健品19。Yoon 等研究了从 Porana volubilis 中提取的多糖，发现它们通过肝素辅因子的调节能产生很高的抗血凝活性并能抑制由胶原蛋白引起的血小板聚合作用。从可食用灰树花中提取的 5 组多糖中，相对分子质量为 47 万的多糖可以增强生物合成胶原蛋白的活性，其活性