单基因病的致病基因克隆与致病基因功能研究策略

单基因病的致病基因克隆与 基因功能的研究策略,2014级 王芳芳,目录,基因与基因突变 基因定位克隆策略 基因功能研究策略,基因与基因突变,基因：编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位。包括编码基因（结构基因和调控基因）和非编码基因（包括rRNA基因、tRNA基因以及小RNA基因） 基因突变：发生在基因内部可遗传的结构的改变。包括点突变、插入/缺失突变、动态突变等 单核苷酸多态性：基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中一种在群体中的频率不小于1%的现象,特殊类型的基因,变通性断裂基因：人类基因组中一大半的基因有剪接后不同的异构体可变剪接，它们的产物都有独特的功能和序列，目前无完善的命名系统 假基因：与结构基因序列类似但不能翻译为功能蛋白质的基因（不能转录/不能拼接、不能翻译），与功能基因同源，为功能基因的缺陷型拷贝。,基因的结构,5非翻译区：转录的调控元件如启动子、增强子、上游激活序列 转录起始位点（SP） 开放阅读框（ORF）：基因的编码框架，起始密码子至终止密码子 终止子 3非翻译区：转录和翻译的调控元件如poly（A）元件、稳定子、IRES定位信号,断裂基因,真核生物的基因编码序列在DNA分子上是不连续的，被不编码的序列隔开，称为断裂基因，由外显子和内含子组成,外显子,基因编码区编码蛋白质的序列，出现在成熟mRNA分子上的序列 序列具有很强的保守性； 应用：根据已知某个或多个物种中具有特定功能的某一基因序列，利用外显子的保守性，通过同源比对的方法可以在待测物种中找到候选基因，它们很可能具有与已知基因同样的功能。,内含子,基因编码区内不编码蛋白质的序列 无序列特异性，基因总长度主要由内含子决定 内含子的相对性一个基因的内含子可能是另一个基因的外显子，同一初始转录本产生不同mRNA（可变剪接），因而一些DNA序列可编码一种以上蛋白质,少数内含子突变影响蛋白质的合成,外显子-内含子剪接区：影响hnRNA的剪接和mRNA的成熟，导致外显子丢失和内含子保留或在其他位置发生剪接，最常产生一个终止密码子，导致蛋白质产物缩短 部分内含子对拼接有反式调控作用，突变导致该作用丧失而引起异常拼接，形成不成熟的mRNA,基因突变对多肽链结构 及基因表达的影响,编码区： 1.沉默突变或同义突变：一般为中性，有时会影响表型（密码子偏好；破坏内在的调控元件；产生或删除了一个隐秘剪切位点） 2.错义突变：保守的一般为中性；非保守 的影响表型 3.无义突变：蛋白质合成提前终止，产生不完整的蛋白质，严重性取决于位置（53） 4.通读突变：可影响多肽链的性质和mRNA稳定性 5.移码突变：影响取决于位置（53），产生不完整的多肽链 6.非移码插入/缺失：往往可容忍，关键残基缺失会影响基因功能,非编码区 1.内含子：一般为中性，有时会影响表型（破坏原有剪切位点或形成隐秘的剪切位点） 2.非翻译区：多是中性，有时可通过影响蛋白质合成、RNA稳定性等影响转录后调节 侧翼序列大部分为中性，但影响转录调控元件如启动子或增强子的突变可能影响或破坏转录过程,单基因遗传病,由单个基因突变所引起的遗传病，其发生基本上受一对等位基因控制，传递方式符合孟德尔遗传定律，故又称孟德尔遗传病 单基因病致病基因的研究有助于明确基因功能，阐明疾病发生发展的机制，并且可能找到一些治疗靶位点，造福子孙后代,单基因病的致病基因克隆策略,功能克隆 候选克隆 定位候选克隆 消减杂交克隆 微阵列技术 全基因组测序（WGS）与全外显子组测序（WES）,功能克隆,根据疾病已知的致病蛋白或氨基酸序列克隆致病基因 在特殊表型的有机体，分离一定生理生化特征的蛋白质或多肽，对部分肽段进行氨基酸序列分析，反推可能的核苷酸序列，设计简并探针或引物,候选克隆,分析与疾病可能相关的生理生化特征以及基因的表达模式，确定候选基因，再在这些候选基因上寻找与疾病突变表型共分离的突变，从而确定致病基因 从 已知 的人类或动物（鼠或果蝇等）的疾病基因出发寻找新的疾病基因 ：寻找已知基因序列相似的DNA片段（如EST），拼接出全长基因序列，验证；通过物种间同源比对寻找保守序列，合成探针或简并引物进行文库筛选或PCR分离,定位（候选）克隆,定位：常用连锁分析，在家系中寻找与疾病表型（致病基因）共遗传（连锁）的多态性DNA标记，将致病基因定位在染色体上的特定区域 确定候选基因：在数据库中查找定位区域所有的已知基因 、ORF 、 EST 或 cDNA 序列等信息 ，通过生物信息学方法预测可能的候选基因 测序及验证：患者中候选基因测序，寻找病理性突变，在家系及对照组进行验证 基因功能分析,消减杂交克隆,将不同个体或不同细胞来源，即通常所指的样本方 和参照方的 DNA 或 mRNA 进行杂交，两者之间的差异，如缺失或特异表达部分，因不能形成杂交体而被筛选出来，对差异显示的片段进行序列分析即得到致病基因,微阵列技术,检测拷贝数变异 分析总结所有患者共有CNV变异区 数据库检索该共有区域内包含的基因，确定候选基因 候选基因功能验证,WGS/WES,对患者的全基因组或全外显子组进行测序 筛选罕见的序列或结构变异（SNP, InDels） 获得潜在影响基因功能的变异：非同义突变、剪接位点突变、插入缺失突变 验证候选变异位点，确定致病基因,基因功能研究,计算机分析即生物信息学分析 实验研究,生物信息学分析,获得有关新基因功能的提示信息 1.编码产物预测分析查找ORF，推导氨基酸序列；信号肽序列分析，判定亚细胞定位；蛋白质理化性质分析，蛋白质高级结构预测,2.序列同源性分析核苷酸序列同源性分析、氨基酸序列同源性分析，根据已知基因和蛋白质的功能推测新基因的功能 局限性：数据库中描述的基因功能可能不正确；同源基因间可能具有非常不同的生物学功能,3.蛋白质结构域和模序分析 蛋白质的结构是蛋白质执行生物学功能的基础 保守模序：与特定生物学活性相关,实验研究,基因的体内表达规律分析 功能获得策略 功能失活策略 其他策略：寻找相互作用蛋白；寻找上下游信号分子,基因的体内表达规律分析,1.mRNA水平的表达谱分析确定基因在哪些组织细胞被转录及在特定组织细胞中的转录情况 常用技术：基因芯片，实时定量RT-PCR（mRNA定量），Northern-Blot（mRNA定量，检测基因转录本的大小及种类），原位杂交技术（定位mRNA在特定组织细胞内的分布）,2.蛋白质水平的表达分析 制备相应的抗体检测其蛋白质终产物的表达情况如蛋白质表达的亚细胞定位、分子量。 常用技术：Western Blot（定量分析，检测蛋白质分子量大小），免疫组化（确定蛋白质在特定组织中的哪些细胞及在特定细胞的哪个部位中表达）,功能获得策略,将新基因直接导入某一细胞或个体中，通过增加基因的拷贝数或采用强启动子促使基因过量表达，然后观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化 包括分子水平上的基因过表达技术（将多拷贝目的基因的克隆载体转入某一细胞内）和个体水平上的转基因技术（构建转基因动物模型） 结果：特异性的表型变化，非特异性的表型变化,功能失活策略,通过观察某一细胞或个体在新基因的功能被部分或全部失活后的细胞生物学行为或个体遗传性状变化来鉴定基因功能 基于核酸的基因沉默技术，基因敲除技术,基因沉默技术,反义寡核苷酸技术（ASON）、核酶、RNA干扰技术（RNAi） 降解或灭活靶mRNA，抑制靶基因的翻译 缺点：诱导干扰素和其他细胞因子表达的非特异性效应；脱靶效应（与靶分子相近的分子发生相互作用）,基因敲除技术,建立在胚胎干细胞和同源重组技术基础上的一种方法。在细胞水平上构建新的细胞系，在整体水平上建立基因敲除动物，观察个体表型变化 缺点：技术条件、费用高；胚胎期消除目的基因的功能，可能只反映一部分基因功能，其他被别的基因代偿；或重要基因剔除后致胚胎期死亡，无法检测其在各发育阶段的影响,其他策略,1.寻找新基因编码产物的相互作用蛋白 酵母双杂交系统 蛋白质免疫共沉淀技术 2.寻找新基因编码产物的下游信号分子或靶基因 常用思路：将功能获得或功能失活技术和基因表达差异