华农2016食品发酵工艺原理复习题答案

名词解释：工业发酵的含义对工业微生物 而言，利用微生物在有氧或无氧条件下 的生命活动来获得微生物菌体或代谢产物的过程。如厌 氧培养的生产过程，酒精，乳酸 等。通气（有氧）培养 的生产过程，如抗生素、氨基 、酶制剂等。 发酵可以定义为：通过生物细胞（微生物、动植 物细胞）的生长繁殖和代谢活动，产生和积累人们所需要的产品的生物反应过程统称为发酵。发酵工程的含义给微生物提供适宜的生长条件，利用微生物的某种特定功能，通过现代 化的技术手 生产出人类所需要的产品的工程。 发酵机制 发酵机制 （或微生物发酵的机理）：特定的微生物通过 O 代谢活动，利用基质合成人们所需的产物的内在规律。 巴斯德效应 酵母在厌氧的条件下，能分解葡萄糖产生酒精，并且 消耗葡萄糖的速度很快；而在好氧条件下，酵母的发酵能 力降低，酒精产量大为降低，葡萄糖消耗速度也会减慢， 这种抑制发酵的现象称为巴斯德效应。 次级代谢与初级代谢 按照产物与微生物生长繁殖的关系分：初级代谢产物与次级代谢产物 。为微生物提供生物合成的能量、中间体物质以及从中间体合成细胞物质 （蛋白质、核酸、有机酸、脂 类、多糖等高分子化合物）这类代谢称初级代谢。 例如：EMP 途径、三羧酸循环、氨基酸、ATP等的合成 酒精、乳酸、柠檬酸、氨基酸等 是微生物在一定的生长期里 （通常是生长期的后期或稳定生 长期里） ，合成一些对微生物本身没有明显作用的物质，或 是在外界环境胁迫下合成的一类有利于其生存的代谢活 动，称为次级代谢。 次级代谢产物 次级代谢产物是指由微生物产生的，与微生物生长、繁 殖无关的一类物质。如抗生素、色素、维生素、酶制剂、 甾体、激素等。 自发突变与诱发突变 在自然状况下发生的突变称自然突变或自发突变。微生物在自然条件下发生自发突变，频率为 10 -8 10-5。 自然选育 自然选育：生产中根据菌种自 突变的特点进行菌种筛选 的过程 （定期传代复壮，无人工诱变） ，通过分离、筛 选，排除劣质性状的菌株，选择维持具有原来生产水平 或具有更优良性能的高产菌株。通过自然选育可以达到 纯化与复壮菌种、防止菌种 化的目的。 诱变育种用各种物理、化学的因素人工诱 微生物突变，提高突变频率，从变 异的细胞中筛选出具有所需生产性状的菌株，称为诱变育种。 营养缺陷型 营养缺陷型菌株指某一菌株丧失了合成某种营养物质的能力，是微 生物经诱变剂处理后产生的一种生化突变体。由于基因突变， 它失去了合成某种物质 （氨基酸、维生素或核苷酸碱基 的能 力，在基本培养基上不能生长，在培养基中若不外加这种营养 成分就不能正常生长的变异菌株。 在营养缺陷型突变株中，生物合成途径中的某一步发生了酶的缺陷， 合成反应不能完成，某段产物不能累积，因此末端产物的反馈调 节被解除。 缺陷型表 为“X ” 发酵培养基 人工配制的适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。 C/N 比 生长因子 凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、 嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 产物促进剂 是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入 含 义 后却能提高产量的添加剂。消毒与灭菌 消毒(disinfection)：用物理或化学方法杀死物料、容器器具 内外病原微生物，而对被消毒的物体基本无害的措施。 一般只能杀死营养细胞，例如巴氏消毒法（60，30min ） 。 灭菌(sterilization) ：用物理或化学方法杀死或除去物料、 空气容器等环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽 孢和孢子。 关系：消毒不一定达到灭菌的要求，而灭菌可以达到消毒的目的。 过滤介质除菌 采用适当的过滤介质对热敏性的液体或气体进行过 滤，去除微生物的方法。 致死温度 实消 分批灭菌也叫间歇灭菌或实罐灭菌、实消。培养基的间歇 灭菌就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将 培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，也称为实罐灭菌，或 实消。 空消 发酵附属设备灭菌 ，又称空消种 子的扩大培养 种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管 中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经 过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定 数量和质量的纯种过程，这些纯种培养物称为种子。 种子扩培的目的： 1、接种量的需要 2、菌种的活化、驯化 3、缩短发酵时间、保证生产水平 种子制备的过程大致可分为： 1、实验室种子制备阶段 2、生产车间种子制备阶段 接种量 * 是指移 的种子液体积与接种后培养液总体积的 比例。取决于生产菌种在 酵罐中生长繁殖的速 率和产品生产的工艺要求，通过实验确定。 种龄 是指种子罐中培养的菌体开始移 下一级种子罐或 酵罐时的培养时间。菌体比生长速率 菌体比生长速率 （specific growth rate)，是单 位质量菌体在单位时间内的增量 g/(g h),即菌体 的生长速率除以菌体的浓度，单位为 h-1基质比消耗速率 单位质量菌体在单位时间内消耗基质的量称为基质的消耗 比速率，它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。 产物比生产速率 每克菌体在单位时间（1h）内培养液中产物浓度的变化 量，它表示微生物细胞合成产物的速度或效率 产物 与生长偶联型 生长偶联产物生成 菌体生长、碳源利 用和产物形成几乎在相同时间出现高峰。产物形成直接与碳源利用有关 产物与生长非偶联型 生长与产物生成部分偶联在生长开始后 并无产物生成，在生长继续进行到某一阶段才有 产物生成。产物形成间接与碳源利用有关。 部分偶联型 非生长偶联产物生成在生长停止后才有 产物生成。产物形成与碳源利用无准量关系。 分批发酵 分批 （发酵）培养（batch culture）：指在一个密闭系统内 一次性投入有限数量营养物，接入微生物进行培养只完成一个 生长周期的方法。Fin=Fout=0 （无培养基进出） 如在好氧发酵过程中，需要不断通入无菌空气并加入酸碱以 调节发酵液的 pH 值，除此以外，与外界没有其它的物料交换。 连续发酵 指在一开放系统中，以一定的速度向发酵罐内连 续供给新鲜培养基，同时以相同速度将含有微生物 和产物的培养液从发酵罐内放出，从而使发酵罐内 液体量维持恒定，使培养物在近似恒定状态下生长 和进行代谢活动的方法。 F in=Fout 0 补料分批发酵 指在分批发酵中间歇地或连续地补 （流 ）新鲜培 养基的方法。Fin 0 （Fout 0 ，Fout 0 ） 发酵热发酵热就是发酵过程中所产生的净热量生物热在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将 其分解氧化产生能量，一部分用于合成高能化合物（如 ATP）提供细胞代谢产物合成需的能量，另一部分以热 的形式散发，这散发出来的热就叫生物热。 溶解氧呼吸强度QQ2 mmol O2/g.h，也称氧的比消耗速率氧的消耗速率也称微生物摄氧率r mmol O2/g.h 。 (其中，X=X 0*eut ，X每 ml 发酵XQO2r培养液中的菌体质量浓度 g/L)临界氧浓度临界氧浓度 CCr：各种微生物对发酵液中溶氧浓 度的最低要求。对产物而言，便是不影响产物 合成所允许的最低浓度。 KL a以浓度差为推动力溶解氧的传质总系数染菌时间污染时间是指 无菌检测方法确定的污 染时间，不是杂菌窜入培养 的时间。 染菌率总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总 投料批次数之比的 分率：发酵染菌批 （次）数/总投料批 （次）数 *100% 简答题或问答题：1、简述自然发酵产 特点及其例子2、常见的厌氧和耗氧发酵产物种类厌氧发酵：酒精、乳酸、丙酮与丁醇等 好氧发酵：柠檬酸、谷氨酸、抗生素等3、酵母的酒精发酵机制是什么？巴斯德效应及其机理是什么？ 在酵母体内，葡萄糖经酵解途径 生成丙酮酸，在无氧条件 下，由丙酮酸脱羧酶催化，丙酮酸脱羧生成乙醛。生成的乙醛作为受氢体，被 NADH+H 还原为乙醇 巴斯德效应及其机理：酵母在厌氧的条件下，能分解葡萄糖产生酒精，并且 消耗葡萄糖的速度很快；而在好氧条件下，酵母的发酵能 力降低，酒精产量大为降低，葡萄糖消耗速度也会减慢， 这种抑制发酵的现象称为巴斯德效应。 其机理是因为糖酵解过程(EMP ）的受末端产物 ATP 的反馈控制，即 有氧时，由于酵解产生的 和丙酮酸进入线粒体而产生大量ATP ， 控制酵解途径关键酶 磷酸果糖激酶的活性，葡萄糖进入 途径 减少，葡萄糖消耗速率降低。 4、简述亚硫酸盐和碱法甘油发酵机制在发酵液中加入 3 ，乙醛与其起加成反应，生成难容的结 晶状亚硫酸钠加成物，使乙醛不能作为受氢体。5、了解常见发酵产 的工业微生物菌种类型，如高温淀粉酶采用地衣芽孢杆菌，谷氨酸采用棒杆菌或黄色短杆菌 糖化酶采用黑曲霉菌株，许多抗生素采用放线菌来生产等等 6、简述柠檬酸的发酵机制 1、黑曲霉等微生物具有组成型的丙酮酸羧化酶源源不断 提供草酰乙酸。 2、丙酮酸氧化脱羧生成乙酰 CoA 和丙酮酸固定 CO 2 反应 平衡，及柠檬酸合成酶不被调节抑制，增强了合成柠檬 酸的能力。 3、在控制 Fe+ 含量的情况下，顺乌头酸酶活性低,从而使柠檬酸积累。 4、由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的 NH4+ 浓度升高，促进了 途径的畅通。5、柠檬酸积累增加, 降低，在低 条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自 身的积累。 7、简述谷氨酸发酵过程中改变细胞膜通透性的措施及意义 代谢产物的细胞渗透性是氨基酸发酵的重要因素。 细胞膜的渗透性好，有利于代谢产物分泌出来，避免了 端产物的反馈调节，有利于提高发酵产量。影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质：（1）生物素、油酸、表面活性剂。其作用是引起细胞膜的脂肪 成分的改变，尤其是改变油 酸的含量，从而改变细胞膜 通透性（2） 青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞膜失去细胞壁的保 护，细胞膜受到物理损伤，从而使渗透性增强。 8、简述工 业发酵对菌种的要求1、发酵工业对优良微生物菌种的要求 1） 并能高产和稳产所需的代谢产物；2） 2）能在 价原料制成的培养基上迅速生长；3） 3）副产物尽量少，便于提纯，以保证产品纯度。4） 4）菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。5） 5）生产菌株安全，不是病源菌、不产毒素、对环境无害；用作食品添 加剂的发酵产品以及进行食品发酵，其生产所用菌种必须符合 食品卫生要求。9、什么叫自然选育？自然选育在 艺生产中的意义？ 根据自然变异从自然界或生产中选择符合生产要求的菌种。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致 高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复 突变。 自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的 重要措施。 10、什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？用各种物理、化学的因素人工诱 微生物突变，提高突变频率，从变 异的细胞中筛选出具有所需生产性状的菌株，称为诱变育种。 物理诱变剂：紫外线、X 射线、 y 射线， 快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。许多高产菌 株的选育都用过紫外线，对于一般实验室、中小型工厂都适用，也很 安全。其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由 专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。 化学诱变剂：如碱基类似物、5 氟尿嘧啶、烷化剂等，使用最 多、最有效的是烷化剂。 优缺点：1、大多数情况下，要比电离辐射更有效。2、化学诱变剂经济、简单。3、大部分诱变剂是致癌剂，必须非常谨慎，要避免化学 诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感。11、简述诱变育种的基本流程 （1）出发菌株的选择 * 诱变目的是提高代谢产物或中间产物的产量、质量，或改变原有代谢 途径，产生新的代谢产物（代谢控制育种）等，因此出发菌株的选择 直接关系到诱变效果。 出发菌株应具备一定的生产能力或某种优良特性的菌株，其遗以 下传性状应该是纯的，较高产，遗传性状稳定，对诱变剂敏感。 以下几类菌株常用作出发菌株： * 自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易发生正突变； * 经历生产条件考验的菌株，有一定的生产性状，对生产环境有较好的 适应性； * 经历多次诱变处理的菌株 （2）单细胞或单孢子悬浮液的制备 * 取处于对数生长期的菌体，且尽可能处于同步生长状态的微生物细 胞，芽孢细菌采用芽孢制备悬液，放线菌和霉菌采用其孢子。 要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出 诱变 细胞。 目的：分散的每个细胞与诱变剂机会均等充分接触； 菌悬液用生理盐水或缓冲液稀释：真菌孢子和酵母细胞悬浮液 的浓度为 106 1010 CFU /ml ；放线菌或细菌 108CFU /ml 。 （3）诱变剂的选择：单一诱变剂 两种以上的诱变剂 （4）诱变剂处理： * 预先做诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合 适的处理剂量。一般以致死率 70%-80%为最佳诱变剂量。 不同诱变剂的剂量有不同的表 方法，紫外线和 X 射 线以强度表示 。12、制备不同种类微生物原生质体的方法 细菌和放线菌制备原生质体主要采用溶菌酶：制备酵母菌原生质体，一般采用蜗牛消化酶：制备丝状真菌原生质体时可用蜗牛消化酶、纤维素酶，对丝状真菌一般采用两种或三种酶进行处理才能收到好的效果。13、工 业发酵中菌种的退化原因及防止措施有哪些？ * 菌种衰退：指选育出的优良菌种，在传代和保藏的过程中群体中 某些生理特征和形态特征逐渐减 或完全丧失的现象。 定期使菌种复壮是防止菌种衰 最有效的方法。菌种的复壮是指使衰退的菌种恢复原来优良性状。 狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。 （另一种答案：造成菌种退化的原因主要是保藏方法不妥、保藏操作不当、传代不当、培养基不适、回复突变等； 从菌种选育方法上考虑：1)进行充分的后培养及分离纯化 2)增加突变位点，减少基因回复突变的几率 从菌种保藏方式上考虑：1)尽量减少传代次数 2)选择适宜的保藏培养基 从菌种培养适宜条件上考虑：1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物及时淘汰回复突变细胞。 2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失 从菌种管理的措施上考虑（复壮）：1）定期对保藏菌种分离纯化，淘汰已退化细胞； 2）定期对发酵液进行分离筛选） 14、常见菌种保藏方法的条件和原理是什么？菌种保藏方法的各自优缺点 原理：人工创造条件（如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物 质） ，使菌种的代谢活动降低低，或处于不活动状态即 休眠，以减少变异。 生产菌种常用的保藏方法 : 斜面低温保藏法、石蜡油封保 藏法、砂土保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法 15、 业发酵培养基的基本要求？发酵培养基的组成成分有哪些？ (1)发酵培养基的基本要求 (2)不同的培养基有不同的营养需求。 (3)必须提 合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 (4)有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。 (5)尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。 (6)原料价格低廉，质量稳定，取材容易。 发酵培养基的一般含有： 碳源、氮源、无机盐及微量元素、生长因子和水等菌体生长所必需的元素； 以及合成产物所需的前体和促进剂16、常用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？碳源种类：糖类、油脂、有机酸、正烷烃。 葡萄糖：所有微生物都能利用葡萄糖，但注意葡萄糖效应（又称葡萄糖阻遏或分解代谢产生阻遏作用。葡萄糖或某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象。如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基上，在葡萄糖没有被利用完之前，乳糖操纵子就一直被阻遏，乳糖不能被利用，这是因为葡萄糖的分解物引起细胞内 含量降低，启动子释放 - 蛋白， 聚合酶不能与乳糖的启动基因结合，以至转录不能发生，直到葡萄糖被利用完后，乳糖操纵子才进行转录，形成利用乳糖的酶，这种现象称葡萄糖效应。附简单解释：只在乳糖与葡萄糖共存的情况下，细菌会优先使用葡萄糖作为代谢原料，而只有当葡萄糖浓度低的情况下，乳糖才被作为能量来源的现象，原因是高葡萄糖浓度下 浓度低，无法合成 - 来刺激乳糖操纵子的启动。 ） 糖 蜜 ：是制糖工业的副产物，主要含蔗糖，总糖可达 50%75%。 除含糖外，还有很多杂质，使用前要进行预处理。 淀 粉： 微生物必须有能分泌水解淀粉、糊精的酶类。 来源广泛、价格底、可以解除葡萄糖效应。 难利用、发酵液比较稠，需加入淀粉酶适度水解。 糖的种类对微生物代谢产物的合成具有很大影响 。 17、简述双酶法制备淀粉糖的基本步骤及其优缺点 反应原理：a-淀粉酶 淀粉葡萄糖苷酶淀粉 - 糊精、低聚糖 - 葡萄糖 液化 糖化优点： 作用条件温和，对设备要求低； 副反应少，产品纯度高（酶的作用专一性） ，原料利用率高； 对原料要求较低，淀粉乳浓度高缺点： 所需设备较多 反应时间较长 （2-3 天） ，夏天容易变质 18、常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？无机氮源： 种 类 氨盐、硝酸盐和氨水等。 特 点： 微生物对它们的吸收快，所以也称谓速效氮源。 有机氮源 ：又称迟效氮源 来 源 花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉。成 分：提供氮源外，有些还提供大量的无机盐及生长因子。 可溶性蛋白、生长因子 生物素） 、苯乙酸、乳酸、硫、 例 如 磷、微量元素等。 19、什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？举例百度粘来的答案：无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫 生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的 有积极作用。 20、什么是前体？前体添加的方式？ 是指某些化合物加入到发酵培养基后，能够被微生物直接 用于产物的合成，而其自身的化学结构没有明显的变化， 但产物的产量却大幅度提高，这类化合物称为前体。如苯乙酸作为青霉素前体使用；氯化物作为金霉素的前体等。前体使用时一般都采用流加的方法添加。 21、常用产物促进剂的种类 常用促进剂：各种表面活性剂 （吐温、 、植酸等） 、大豆 油提炼物、甲醇等 22、发酵培养基灭菌的基本要求是什么？ 培养基灭菌的要求：（1） 达到要求的无菌程度（2） 尽量减少营养成分的破坏。在灭菌过程中，培养基组分的破 坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解 23、为什么发酵培养基采用高温短时灭菌效果的更佳，依据是什么？ 从微生物死亡动力学方程可以看出，随着温度的升高，微生物死亡速率加快，而比营养物质分解速度快得多，因此高温短时灭菌可达到相同的灭菌效果，而营养物质破坏大大减少。随温度的升高，灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养成分 破坏反应速度常数增加的倍数。因此，采用高温快速灭菌方法， 即可达到杀死培养基中的全部微 生物的目的，又可减少营养成分 的破坏。 24、简述影响培养基灭菌效果的因素 1、灭菌时间 2、温度 3、培养基 PH 值： 培养基中氢离子浓度 接影响灭菌的效果。培养基的 PH 值越低，所需杀 灭微生物的温度越低。 6.0-8.0 时最难灭菌。 培养基成分： 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物耐热性； 大肠杆菌 . 在水中加热 60-65死亡；在 10%糖溶液中，需要 70加热 46 ，在 30%糖溶液中，需要加热 30 。另一些物质，如高浓度的盐类、色素等的存在等可削弱其耐热性 4、泡沫： 对灭菌极为不利，泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿 透。在易产生泡沫的培养基中加入消泡剂。 5、培养基中微生物数量 ：微生物数量越多，达到要求灭菌效果所需时间也越长。 6、培养基的物理状态 固体培养基比液体培养基灭菌时间长；颗粒越大，灭 菌时蒸汽穿透所需时间越长，灭菌难，对于小于 1mm 的颗 培养基，不必考虑颗 对灭菌的影响，但含有少量大颗 和粗纤维的培养基的灭菌，则要适当提高温度，在不影响培养基质量的条件下，采用粗过滤的方法预先处理，以 防止培养基结块而造成灭菌不彻底。7、 其他：微生物细