基因工程6 dna的体外重组

1、LOGODNA重组LOGODNA与载体之间连接方式黏性末端的连接、平末端的连接和PCR产物的T载体连接以及基于噬菌组的gateway克隆技术。点特导性重LOGO方式：(1) 同一限制酶切位点连接(2) 不同限制酶切位点连接特点：速度快一、黏性末端连接p102LOGOGGATCCBam H切割反应CCTAGGGATCCGG CCTAGBam H切割载体Bam H切割目的基因G CCTAGG CCTAG+GATCCGGATCCGT4 DNA连接酶15C（一）同种酶产生的黏末端的连接LOGOG CCTAGG CCTAG+GATCCGGATCCGT4 DNA连接酶15CGGATCC CCTAGGGGA

2、TCCGGATCC CCTAGGGGATCCGGATCC CCTAGGGGATCCCCTAGGCCTAGGCCTAGG载体自连重组体目的基因自连LOGO（一）同种酶产生的黏末端的连接LOGO正向插入G-3CTTAA-55-AATTCG目的基因DNA连接酶GAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAG重组DNAG5-AATTCCTTAA-53-G载体DNA转录方向LOGO反向插入G-3CTTAA-55-AATTCG目的基因DNA连接酶GAATTCGAATTC CTTAAGCTTAAG重组DNAG5-AATTCCTTAA-53-G载体DNA转录方向LOGO（二）不同种酶产生的黏性末端的连接GA

3、ATTC CTTAAGAGATCT TCTAGABg l切割位点Eco R切割位点AGATCT TCTAGAGAATTC CTTAAGEcoR +Bg l双酶切EcoR +Bg lAATTCGGATCTA双酶切+A TCTAGAATTCGA TCTAGAATTCGLOGOAATTCGGATCTA+A TCTAGAATTCGA TCTAGAATTCGT4 DNA连接酶15CGAATTC CTTAAGAGATCTTCTAGA重组体LOGOGAATTC CTTAAGAGATCT TCTAGAEco R切割位点Bg l切割位点AGATCT TCTAGAGAATTC CTTAAGEcoR+ Bg l双酶

4、切Eco R+ Bg l双酶切AATTCGGATCTAA TCTAGAATTCGA TCTAG+AATTCGT4 DNA连接酶15CGAATTC CTTAAGAGATCTTCTAGA重组体 定向连接 取代式插入LOGO二、 平齐末端连接适用于：连接平齐末端的DNA目的基因RERE重组体目的基因自连载体自连T4 DNA ligase ，15C载体v daociLOGOLOGO（一）平末端连接的缺陷1. 连接效率低；2. 黏性末端补平或切平的平末端连接常常破坏RE 原有的识别序列；3. 平末端DNA在载体中的插入无方向性，可双向插入；4. 在较高底物浓度下，可产生多拷贝外源DN段插入载体的现象。L

5、OGO（二）平末端DNA或非互补黏性末端的连接策略非互补的黏性末端平末端黏性末端连接平末端连接常采用：同聚物加尾法衔接物连接法DNA接头连接法等LOGO1.同聚物加尾法 （1）末端脱氧核苷酸转移酶：在二价离子（ Mg2十）存在的情况下，不需要模板便可以催化dNTP加到DNA的3-OH端上；DNA可以是单链，也可以是双链，主要是3端突 出的双链底物要有一定长度，至少是3ntLOGO2.原理5-特异核酸外切酶或能产生3-突出末端的内切酶LOGOLOGO注意：两个互补尾巴的长度往往不完全相等，可用DNA聚合酶I或K1enow大片段聚合酶去填补由此产生的缺口，然后再由DNA连接酶将二者连接起来。LOG

6、O（1）优点能把任何片段连接起来载体和外源片段的末端是互补的黏性末端， 不存在自身环化现象（2）缺点：操作繁琐；外源片段难以回收；不能把插入片段再切下来添加同聚物尾巴可能会影响外源基因的表达重组连接后往往会重新产生某种RE的切点3. 特点LOGO（二）衔接物连接法用化学法合成的，由10-12bp组成的具有一个或多个RE识别位点的平齐末端的双链寡核苷酸链,其5端 是OH1.衔接物：LOGO多核苷酸激酶2.原理与步骤LOGO(三) 接头连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。无-pBamHI adapter5-GATCCCGG-OH3GGCC-p5

7、1.adapterLOGOCIP处理接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC55GATCCCGG-OH HO-GGCC55CCGG-OHHO-GGCCCTAG55p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P无-p的原因防止自我连接P-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5LOGO小牛肠碱性磷酸酶(CIP) 小牛肠道细菌碱性磷酸酶(BAP)大肠埃细菌能够催化核酸脱掉5-磷酸基团5-P末端转换成5-OH末端碱性磷酸酶2. 相关酶LOGOT4多核苷酸激酶催-磷酸从ATP分子转移给DNA或RNA的5-OH端先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）P57LOGO接头链接法LOGO3. 注意事项可以在平末端DN段两端添加希望的酶切位点衔接物连接时，在外源DN 含有衔接物的酶切位点。段的序列中不能LOGO4. 衔接物或接头分子连接比较（1）相同点：化学合成的寡聚核苷酸片段，5端都是5-OH，连接前都需要T4多核苷酸激酶处 理使5-OH形成5-Pi。（2）不同点衔接物连接后，必须用相应的