核酸检测技术及质量控制(王凤鸣)

1、核酸检测技术及质量控制,常州市疾病预防控制中心 王凤鸣,目 录,一、PCR实验技术操作要点 二、质量控制要点 三、实验室生物安全管理,一、PCR实验技术操作要点,常用仪器设备,加样器,PCR实验室应备有4套连续可调加样器，分别用于试剂准备、样本处理、扩增和产物检测四个试验区。,加样器的类型,单道连续可调式移液器 多通道连续可调式移液器 单道连续移液器 单道移液管配合使用的移液器,加样器的使用,加样器的校准,校准方式 计量局 厂家 自较 时间 视使用频率定（6个月-1年）,加样器-注意事项,根据所需取液量选择相应的移液器及吸头，基因扩增实验要求使用带滤芯的吸头，防止交叉污染。,吸取液体时应缓慢匀

2、速吸取，避免液体溅到移液器头上；打出液体后拇指不应松开按钮，将吸液嘴压掉后再将拇指松开，避免液体回吸。 在调整取液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意计数器显示的数值不要超过其可调范围。 连续可调式移液器不可在无吸头时使用，吸头有液体时不可平放或倒置。,加样器-注意事项,（一）高速（冷冻）离心机,电机 转速 最低转速 最高转速 转头 消毒方式 标准配件系统 噪音,高速（冷冻）离心机-使用方法,离心机应放置在水平坚固的地板或平台上，并力求使机器处于水平位置以免离心时造成机器震动。 打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 按功能选择键，设置各项要求：温度

3、、速度、时间、加速度及减速度，带电脑控制的机器还需按储存键，以便记忆输入的各项信息。 待离心机完全停止转动时打开机盖，取出离心样品，用柔软干净的布擦净转头和机腔内壁，待离心机腔内温度与室温平衡后方可盖上机盖。,机体应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线。 开机前应检查转头按装是否牢固，机腔有无异物掉入。 离心机运行时，离心机周围30cm范围内不能有人和危险物品。 挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐蚀机腔或造成事故。,高速（冷冻）离心机-使用方法,易燃易爆以及易与其他物质发生反应的物质不能离心。 在没有相应的防护措施时，不能离心有毒的

4、、放射性的物质或病原微生物。 离心机运行时不可人为地打开盖子。 如果转头和盖子有可见的腐蚀或磨损的痕迹，则应立即停止使用。 使用的玻璃或塑料离心管应能承受相应的离心力并大小合适。非金属转头不可用紫外照射。,高速（冷冻）离心机-使用方法,全自动核酸提取仪,全自动核酸提取仪,基于核酸的分子诊断技术,病毒颗粒,DNA,RNA,FQ-PCR,RT-FQ PCR,裂解,荧光信号检测,核酸提取,荧光PCR检测系统,荧光定量PCR检测,加样,病毒荧光定量PCR反应,反应体系配置,反应条件设置,对照设置： 阴性对照：灭菌双蒸水代替标本 阳性对照：提取好的阳性核酸标本,典型荧光定量PCR结果,阳性标本扩增曲线

5、阴性标本扩增曲线,二、质量控制要点,PCR实验技术的质量控制要点,分子生物学实验室的质量控制涉及到整个基因检测扩增的所有阶段，确保检测结果的准确性和可靠性，严禁各类交叉污染事故的发生。,PCR实验技术的质量控制要点,PCR实验的过程主要包括： 标本处理与核酸提取 扩增试剂的准备 核酸扩增与产物分析 测定后的结果报告,PCR实验技术的质量控制要点,高质量无污染无降解的核酸制备 严格实行分区操作 试剂储存和准备区 标本处理和核酸制备区 核酸扩增区 扩增产物分析区 实验人员的操作技能,理想的PCR实验室分区设计模式,各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作,“十六字口诀”,PCR实验室设计的一般原则,

6、标本处理与核酸提取的质量控制,核酸提取试剂的选择 核酸扩增试剂的选择 试剂的分装保存 试剂的配置 对照的设立 核酸扩增仪器 扩增参数的设定,扩增产物的检测与分析 荧光定量 普通凝胶电泳 毛细管电泳,污染的控制和预防,常见污染的来源 控制污染的措施 消除污染的措施,三、实验室生物安全管理,为什么关注实验室生物安全？,三起SARS疫情后期的实验室感染事件 2003年9月8日：新加坡国立大学实验室，在P3实验室同时开展西尼罗病毒与SARS病毒的研究，一位27岁华人研究员感染； 2003年12月6日：台湾省国防大学预防医学研究所，一名47岁的中校研究员，在P3实验室内清理SARS实验后的废弃物时，未戴

7、手套，因而感染； 2004年4月22日：中国CDC病毒所，跨室开展SARS病毒研究，并引发三代、9例 病例、1例死亡；另有两例 “隐性”感染者。,引起实验室生物污染的原因很多很多,人员生物安全概念薄弱和技术操作不当； 生物安全柜和高压灭菌容器的不正常使用或使用不当； 样品传递、接受和使用、装有冻干感染性物质安瓿的打开； 匀浆器、组织研磨器、摇床、搅拌器和超声处理器的使用； 离心机内装有潜在感染性物质的离心管发生破裂,生物安全的概念,实验室生物安全 避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室外扩散并导致危害的综合措施。 生物安全三个方面： 一指人类的健康安全；二指人类赖以生存的农业生物安全；三

8、指与人类生存有关的环境生物安全。,微生物实验室生物安全,三项技术措施 样品隔离技术（机械、气幕)：防止传染因子进入环境接触人体 定向气流技术（负压系统)：防止传染因子扩散 消毒灭菌技术（物理、化学)：灭活传染因子,实验室可以分为,基础实验室 一级生物安全水平 基础实验室 二级生物安全水平 防护实验室 三级生物安全水平 最高防护实验室 四级生物安全水平 根据操作不同危险度等级微生物所需的实验室设计特点、建筑构造、防护设施、仪器、操作以及操作程序来决定实验室的生物安全水平。,实验室生物安全防护屏障,一级防护屏障 生物安全柜和个人防护装备等构成的防护屏障。,生物安全柜 高效空气过滤器,。,李燕,44

9、,实验室生物安全防护屏障,二级防护屏障 设施结构和通风系统等构成的防护屏障。,“盒中盒”的结构,实验室生物安全防护水平分级,生物安全水平分级 根据生物因子危害程度和采取的防护措施，将生物安全防护水平（biosafety level，BSL）分为4级（BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示）；动物实验室以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表示。,与一般生物洁净室的区别,1.工作目的 BSL实验室： 保护工作人员和环境为主，也保护产品。安全是首要考虑因素。 生物洁净室：以保护产品（工作对象）为主。洁净是首要考虑因素,2.污染物的种类和来源 BSL实验室：为目标微生物

10、。内部产生。 生物洁净室：粉尘（可能的热源）和微生物。外部进入以及人的活动产生。,与一般生物洁净室的区别,3.空气污染物处理方式 BSL实验室：平面布局和气流流向的作用, 产生环节在一级屏障内进行个体防护。 生物洁净室：主要通过进气净化 减少活动。,4.洁、污概念 BSL实验室：凡有目标微生物即视为污； 凡无目标微生物即视为洁； 对各环节洁、污应仔细分析。 生物洁净室：粉尘、微生物（特别是超标者）和废弃物均视为污。,与一般生物洁净室的区别,5.排气处理方式 BSL实验室：不允许室内 室外； 排气须净化，不许回风。 生物洁净室：一般室内 室外； 排气可回风。,6.实验室软、硬件的作用 BSL实验

11、室：对工作人员保护，实验室软件应是决定性的； 对环境保护，实验室硬件应是决定性的； 生物洁净室：均很重要，但硬件设施作用比较大。,与一般生物洁净室的区别,7.压力递增方向 BSL实验室：缓冲室准备室主实验室 生物洁净室：缓冲室准备室主洁净室,保护对象,操作区,压力,气体排,放方式,设备,结构,设备,造价,生物安全柜,操作者、,样品、环境,负压,净化后排放,复杂,较贵,洁净工作台,样品,正压,直接排放,简单,便宜,生物安全柜与洁净工作台的区别,BSL-1实验室,1) 实验室的门应有可视窗并可锁闭。 2) 实验室门口设挂衣装置，个人便装与工作服分开。 3) 实验室各表面平整、易清洁、不渗水、耐腐蚀

12、。 4) 实验台面防水，耐腐蚀、耐热。 5) 橱柜和实验台牢固，保持一定距离以便于清洁。 6) 实验室可以利用自然通风。如果采用机械通风，应避免交叉污染。,BSL-1实验室,7) 如有可开启的窗户，应设置纱窗。 8) 保证工作照明，避免不必要的反光和强光。 9) 有适当的消毒设备。 10) 若操作有毒、刺激性、放射性挥发物质，应在风险评估的基础上，配备适当的负压排风柜。 11) 应设应急照明装置；应有足够的电力供应。 12) 应有防止节肢动物和啮齿动物进入的措施。,典型的一级生物安全水平实验室,BSL-2实验室,1) 满足BSL-1的要求。 2) 实验室门可自动关闭,门禁系统。 3) 应在实验室工作区配备洗眼装置。 4) 应在实验室或其所在的建筑内配备高压蒸汽灭菌器或其他适当的消毒灭菌设备。 5) 应在操作病原微生物的实验间内配备生物安全柜。 6) 应有可靠的电力供应。,BSL-2实验室,生物危害警告标志。,典型的二级生物安全水平实验室,生物安全柜,生物安全柜的要求: 颗粒经HEPA过滤去除 气流为层流 气流有方向,生物安全柜的分级,I级生物安全柜：保护工作人员和环境 II级生物安全柜：保护工作人员、环境和试样（产品） I