Elisa影响因素及措施整理

1、一、 一般检测试剂盒或检测试剂从冷藏或冷冻状态拿到室温使用需先在室温下平衡30 60 min，各试剂在使用前充分混匀。酶标仪测定结果，准确性决定于ELISA板底的平整与透明度、酶标仪的质量和软件的算法。二、 操作不当导致1、 加样多、操作持续时间长，尤其是环境温度高时会导致个板孔间反应进程差异；2、 除包被外，都宜采取45加样，且要避免加到侧壁上；3、 加样器不稳定、枪头不均一、试剂溅出、操作习惯不好等造成空间加样量不均一会对结果造成较大影响。4、 孵育时间过长，会导致非特异性反应增强；5、 显色和终止加液时应避免气泡产生，以免影响检测读数；6、 酶标板不宜叠放以减少受热不均，可采取水浴；7、

2、 贴密封膜，防止污物浸入和液体蒸发。8、 Elisa实验用的各试剂都要妥善配置和保存、避免污染，不合格的蒸馏水都可导致空白值或背景值升高。三、 检测样品处理不当引起溶血或污染1、 血清或血浆标本分离不好或发生溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色；2、 待检标本污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应；3、 在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；4、 标本凝固不完全：血液通常在采集后半小时后开始凝固，1824h完全凝固。如果在血液未凝固时即离心分离血清，则可因纤维蛋白

3、原非特异吸附于微孔而造成假阳性结果。为了缩短标本处理时间，可以在离心前将血液标本置于温箱中温育或者采用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂以加速血清的分离。5、 标本的反复冻融会因其所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，使抗体效价跌落从而引起假阴性结果，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。此外，标本在冻存时会因蛋白质局部浓缩，分布不均，因此重新融解的标本必须混匀，但不要进行剧烈振荡，反复颠倒即可，产生泡沫或样品的过度混合将引起血清蛋白的变性。6、 地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗

4、体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。7、 黄疸血标本中常含有内源性过氧化物酶，如用辣根过氧化物酶为标记物，就有可能产生非特异性显色。血清脂质过高、血红蛋白及血液粘度过大等，都会对Elisa结果产生较大影响。8、 标本管中添加物质的影响 抗凝剂(如肝素、EDTA)、酶抑制剂(如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性)及快速分离血清的分离胶均对ELISA测定有一定的干扰作用。标本为血清，最好将血液先于室温放置l-2h后，再用3000rpm离心l0 min；标本若为血浆，必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后立即颠倒采血管混合5-10

5、次，放置一段时间后，3000rpm离心15 min；血清标本宜在新鲜时检测，如在冰箱中保存过久，其中的蛋白质可发生聚合，在间接ELISA中可使本底加深。一般4放置的血清标本应在5天内测定，再长时间需低温-20或-80冻存样品。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀，且要避免产生气泡。四、 内源性干扰因素内源性干扰因素一般包括类风湿因子、补体、高浓度的非特异免疫球蛋白、异嗜性抗体、某些自身抗体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig抗体、交叉反应物质等。在日常的临床血清（浆）标本中，有相当比例不同程度的含有上述各种干扰物质，从而导致测定结果的假阳性。1、类风湿因子（rheumatoi

6、d factors，RF）在类风湿患者、其他疾病患者以及正常人血清中，常含有较高或不同浓度的RF，RF一般为TgM型，亦有IgG和IgA型，RF具有与变性IgG产生非特异结合的特点，因为在ELISA测定中，其可与固相上包被的特异抗体IgG以及随后加入的酶标的特异抗体IgG结合，从而出现假阳性结果。尤其是在捕获法IgM型特异抗体的测定中表现最为明显，因为此时固相包被的抗体为抗人弘链抗体，IgM型RF的存在可使其大量结合于固相。为避免RF对ELISA测定的干扰，通常可以采取下述措施：1）稀释标本：这在判断急性病原体感染的特异IgM抗体如抗HAV IgM，抗HBc IgM， TORCH的IgM抗体检

7、验等尤为有用。因为急性感染时，血循环中特异的IgM抗体滴度通常很高，而RF滴度通常相对要低得多。因此，在测定前对标本进行稀释，特异的IgM因高滴度存在仍可检出，而非特异的RF则会因为稀释变成非常低的滴度，从而对测定几乎不产生干扰。有些特异IgM检测ELISA试剂盒不要求稀释标本，直接检测，这样虽然方便了实验室技术人员的操作，但容易出现假阳性结果，并且由于某些慢性感染，如HBV的感染，血循环中抗HBe lgM可持续以一定的滴度存在，标本不做稀释即进行检测，即可出现阳性结果，从而失去抗HBc lgM用于HBV急性感染的诊断价值。因此，在临床实验室，一定要使用要求对标本做1:1000稀释的试剂盒进行

8、检验，从而保证相应检测项目结果的可靠性及临床应用价值。2）改变酶标抗体：由于RF结合的是IgG的Fc片段，如果将待酶标抗体的Fc片段切除，仅留下具有特异结合功能的Fab部分做酶标，在测定中即可避免RF的干扰。3）标本中RF用变性IgG预先封闭：将经热变性（63，10min）的动物如兔、羊等的IgG加入到标本稀释液中，或是将该变性IgG连接至一颗粒固相如聚苯乙烯微球或微孔，然后加入临床血清标本，反应后，再吸出标本进行检测。此外，在测定特异IgM时，也可使用抗人IgG去除临床标本中RF和IgG。4）测定抗原时，可在标本中加入可使RF降解的还原剂：如2-巯基乙醇等还原剂可使抗体内的巯基裂解，因而可以

9、去除RF的干扰，但只适用于抗原测定。5）包被或酶标二抗使用特异的鸡抗体IgY：RF不与鸡IgY反应，如果包被和酶标二抗均为鸡IgY抗体，则不受标本中RF的干扰。2.补体在固相酶免疫测定中，来自哺乳动物的固相特异抗体和酶标二抗均有激活人补体系统的功能。一方面，固相抗体和酶标二抗可因为其在固相吸附及结合过程中，抗体分子发生变构，从而其Fc段的补体C1结合位点被暴露出来，这样C1就成为一个中介物将二者交联起来，从而出现假阳性结果。另一方面，固相抗体也会因为活化补体的结合，封闭抗体的抗原表位结合能力，而引起假阳性结果或使定量测定结果偏低。由补体引起的干扰可通过下述方法避免：（1）对临床血清标本加热灭活

10、补体：采用5630min加热可使标本中的补体C1灭活。（2）包被抗体或酶标二抗使用特异的鸡抗体：鸡抗体不激活人的补体系统，因此，使用特异的鸡抗体，不会出现因补体激活而存在的假阳性和假阴性干扰。3、异嗜性抗体（heterophilie antibodies）人类血清中含有抗啮齿类动物（如鼠、马、羊等）的免疫球蛋白（lg）的抗体，即天然的异嗜性抗体。有研究表明，天然的异嗜性抗体（lgG）可分为两类，一类（85%的假阳性由其引起）可结合于山羊、小鼠、大鼠、马和牛IgG的Fab区域，但不与兔IgG的Fab区结合。另一类（15%的假阳性由其引起）可结合于小鼠、马、牛和兔IgG的Fc区表位，但不与山羊和大

11、鼠IgG的Fc区表位结合。异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗而出现假阳性反应。由异嗜性抗体引起的干扰可通过下述方法避免：（1）使用特异的兔F（ab）2片段作为固相或测定酶标抗体。（2）在标本或标本稀释液中加入过量的动物Ig，封闭可能存在的异嗜性抗体。但加入量不足或亚类不同时无效。（3）使用靶特异的非Ig亲和蛋白（affibody）替代固相或酶标抗体之一。采用噬菌展示来自单个金黄色葡萄球A蛋白（SPA）联合文库的人IgA结合亲和蛋白，用于IgA的测定，不受异嗜性抗体的影响。4、人抗动物抗体（HAAA）的干扰HAAA有IgG、IgA、IgM和IgE属，可分为抗独特型和抗同种型，有多种动物I

12、gO抗兔、抗山羊抗体作为免疫分析的第二抗体。由于不同动物Ig分子间蛋白质序列有大量同源性，因此多种动物Ig之间会发生交叉反应。HAAA可由医源性和非医源性因素引起。前者是人体免疫系统对药用性蛋白的正常应答。动物身上可得到的药剂非常多，如：鼠McAb的靶向性药物或成像剂、马抗毒素和抗胸腺细胞Ig、羊抗地高辛Fab、嵌合抗体和胰岛素等。另外还有输血和接种疫苗等途径。它们的存在会对体外的免疫分析产生干扰，也会使治疗抗体失活和干扰小鼠McAb治疗和成像。由人抗鼠抗体（HAMA）引起的干扰可通过下述方法避免：（1）使用的特异的抗体F(ab)2:片段作为固相或测定酶标抗体。（2）在标本或标本稀释液中加入过

13、量的鼠Ig，封闭可能存在的抗鼠抗体。（3）使用特异的鸡抗体IgG作为固相和测定抗体。鸡IgG不与人抗鼠抗体反应。因而，用其作为固相或酶标抗体不会出现假阳性结果。双位点免疫分析中，血清中的HAMA能够非特异性桥联捕捉抗体和示踪抗体而导致假阳性，而假阴性是由于HAAA与捕捉抗体、示踪抗体其中之一结合，使它们不能与分析物结合。Id的干扰机制和HAMA类似。形成Fab-Fab结构。另外分析用抗体Fc片段也会和干扰抗体结合形成干扰物。Id和HAAA的干扰，在竞争性结合分析中很少报道，可能是由于抗原和抗体间的高亲和力，使得HAAA很难与抗原竞争，但当HAAA浓度很高时，也同样造成了干扰。5.自身抗体 自身

14、抗体如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等，能与其相应靶抗原结果形成复合物，在ELISA方法中可干扰相应原抗体的测定。为避免以上情况出现，可在测定前用理化方法将其解离。6. 溶菌酶溶菌酶可与等电点较低的蛋白有强的结合能力。免疫球蛋白等电点约为5，因此，在双抗体夹心法ELISA测定中，溶菌酶可在包被的IgG和酶标的IgG间形成桥接，从而导致假阳性。因此，为保证ELISA测定的可靠性，有必要从标本中去除溶菌酶或将其封闭，Cu2+离子和卵白蛋白可有效地封闭溶菌酶，防止其连接IgG。五、 抗原抗体反应特性导致的影响1、表面效应首先必须明确指出的是，“固相”ELISA与传统的“液相”血清学试验的最大最本质的区别是

15、有一个预先固相抗原或抗体到载体表面的步骤，以及抗原与抗体结合反应由液态环境移到了固相载体表面进行。蛋白质分子在吸附过程中，为了克服与固相载体之间的排斥力，需要重新分布其表面的功能性基因，使疏水性基因充分暴露，然后，局部接触区域的偶极分子脱氢，再通过范德华吸引而固相到载体表面。表面效应可直接影响抗原、抗体的构象和功能。此外，表面效应亦影响抗原和抗体结合反应的动力学过程。（1）固相导致抗原的变化。为了测定抗体水平，需预先将抗原固相（包被）到极性和疏水性的聚苯乙烯（PS）或聚氯乙烯（PVC）酶标板上。用直接物理吸附方法固相蛋白抗原及DNA等，导致的变化是多方面的，可引起分子构象和抗原性发生改变。酶活

16、性测定时可消失。牛血清白蛋白固相之后，其抗原价可由5价降为1价。此外，发现被动吸附方法固相铁蛋白呈团串状不均一的随机分布，这种影响质控的情况具有普遍性。最后，大多数小分子半抗原不易直接吸附到载体表面。解决这一难题的方法，一般是采用在小分子抗原上先偶联上葡聚糖、明胶等手臂后再进行固相包被。对于有多重表达抗原决定簇的大分子抗原，用抗体桥式包被法可避免表面效应的影响。将蛋白抗原吸附于胶体AI（OH）3后再固相也可以避免蛋白变性。用Y射线辐照（400GY）PS板，不但可增加蛋白抗原吸附能力，而且还有降低抗体测定本底的作用。（2）、固相对抗体的影响。直接吸附固相抗体（Igs）分子，除了呈团串状，不均分布

17、和易解吸等一般不利因素之外，Igs分子摊开在载体表面，不但构象发生改变，而且影响抗体的活性，如IgG的结合价减少，可由2价变为1价，甚至完全失活。实验结果表明，单克隆抗体比多克隆抗体更易失活，固相后仍能保持结合能力的分子仅占少数，分别为3%和5%-10%。这不但浪费抗体试剂，更可惜的是空置了有限的微孔表面积。抗体分子N末端为Fab，C末端为Fc，直接被动吸附的随意性，造成一部分Fab结合位点朝向载体一面，或因用量过多而造成的重叠吸附，部分Fab结合位被遮盖，均可导致其总体结合能力下降。为此，出现了可以“锚定”F段在载体表面，而使Fab朝外的共价结合法，即在载体上导入氨基、肼基等活性基因，然后在

18、水溶性碳二胺作用下，与Igs的羧基共价结合，或直接与羟基化糖基产生的醛基共价结合：含溴乙烯基团的PS板，可在双功能交联剂如戊二醛的帮助下与蛋白质共价结合。目前，国外已有有关的酶标板产品（专利）供应。桥式法是一种避免Igs与载体直接接触的固相方法，有几种不同的类型：1）抗抗体法：（二抗桥接锚定）；2）SPA法：葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein，SPA）固定抗体；3）链酶亲和素-生物素法，此方法应用最为成功，只要预先将第一捕捉抗体生物素化；4）抗半抗原抗体法，这需要将捕捉体预先记半抗原。（3）、抗体介导的抗原分子变构。抗原与抗体分子在三维立体空间自由运动，互相碰撞，彼此

19、特异性结合，这种结合不似早期相像中的单纯的“锁-匙”关系，而是一种柔性的诱导契合。抗原分子决定簇可以突入到Fab的深底部，反过来，Fab为了执行其固有生物学功能，主动地发生变角折弯，锥形转动及最N末端可变区的“球穴”摆动，以契合抗原决定簇，Fab亦可突入到大分子抗原的较深的位区。液态中的抗原体分子在完成一级结合反应之后，该复合物可以通过抗原抗体之间的特异性结合，亦可通过抗体Fc-Fc段的非特异性结合而进一步交联，形成肉眼可见的晶格形网络沉淀凝集型的抗原抗体二级反应复合物。纵观全过程，抗原分子一般总能保持其固有的构象，而复合物中的抗体构象变化则较大。相反，在固相抗体测定抗原的过程中，由于表面效应

20、的关系，抗体介导的抗原分子变构具有特殊意义。2、HD-HOOK效应这种发生在固相法实验过程中的可造成“假低值”甚至“假阴性”错误结果的特殊效应，称为“高剂量钩镰（HD-HOOK）效应”。它的产生条件、分子基础、导致的后果等，都与传统的液相沉淀、凝集反应中的“区带现象”不一样。在一步二位点夹心ELISA中，主要是“浓度效应”既待测物中抗原数量过高所致，此竞争结合反应系统中的标记二抗限量，从而产生抗原越多，最终反应信号越低的HD-HOOK效应；次要因素是标记抗体与被捕捉抗原的交叉重叠结合而导致抗原变构。抗原“量”是决定的因素。一般认为二步二位点夹心固相测定法不会产生抗原过剩的“阴滞现象”，此观点早已被Miles的实践否定，只是很少有二步夹心法会产生HD-HOOK