下游技术 综合.pptx

1、,生物工程下游技术,第一章 绪论,下游加工过程在生物技术中的地位,组成： 下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品 费用： 传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的60，而对重组DNA生产蛋白质等基因工程产品， 下游加工的费用可占整个生产费用的8090,下游技术（工程） （downstream processing）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。 下游加工过程的重要性。（组成、费用和关注程度）,生物工业下游

2、技术的发展历程,古代酿造业,古代酿造业包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等。技术原始、家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用 无下游技术,2. 第一代生物技术 主要指19世纪60年代-20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。 发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。,以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。 无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发 一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素（链霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有机酸（核酸、柠檬酸）、酶制剂（淀粉酶）、微生物多糖和单细胞蛋白等。,3. 第二代生物技术,以20世

3、纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。 生物技术在其主要领域：基因工程、酶工程、细胞工程和微生物发酵工程取得了长足进步，一批高附加值的产品开始面世，如乙肝疫苗、干扰素等。 80年代，发现了一大批生理功能性物质，如活性糖质、活性肽、高度不饱和脂肪酸等，生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。,4. 第三代生物技术,下游加工过程的一般流程,产品的收得率和质量控制。,第二章 下游技术的理论基础,第一节 下游技术中的物理学过程,一、基础物性 “分离”可利用各种物质固有性质的差异。物性差异越大，利用价值越大。 二、分类 以物理学过程为基础的分离操作，大致可分为以下三类： 1平衡分离过程

4、 建立在相平衡关系上的。利用相的组成差别进行混合物体系的分离。表2-1为平衡分离的代表性单元操作。,2拟平衡分离操作 在混合物体系本身所占有的空间之外加一个能引起物质分离的势能场，在它的作用下，形成分离场如表2-2所示。 3 非平衡分离操作 除 1、2以外的均划归其中，利用物质移动速度差和广义的、基于“屏蔽效应”的分离操作。 如表2-3所示。,第二节 下游技术中的化学过程,一、化学性分子识别 液液萃取： 利用物质在溶剂中溶解度不同的分离。 如果在萃取溶剂中加入对原料中目标物质有特异性作用的成分(萃取剂、抽提剂)，能达到高选择性。,1分子间相互作用 分子间的相互作用力除了众所周知的范德华力氢键力

5、等，近年来备受注目的分子间作用力是“疏水性”相互作用力，即在水性介质中，各分子的疏水性相互作用的凝聚力，属于热力学性质。 2 分子识别 最典型：酶和底物的专一性结合。 钥匙和锁的关系。只有底物分子才能进入这个口袋。酶分子正是通过对底物的多点识别才显示出它高效、专一的底物识别功能。,第三章 发酵液的预处理,微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生 物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各 种代谢产物。,发酵液成分,目 的,分离菌体和其他悬浮颗粒，除去部分可溶性杂质和 改变滤液的性质，以利于提取和精制后继各工序的顺利 进行。,对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物 转移到液相，然后经

6、固液分离除去固相； 对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞， 经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞 碎片分离。,方 法 选 择,一 、发酵液过滤特性的改变,发酵产物浓度较低，大多为1一10，悬浮液 中大部分是水； 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； 固体粒子可压缩性大； 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生 物污染、蛋白酶水解等作用的影响。 这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。,（一）微生物发酵液的特性,（二）改善发酵液过滤特性的物理化学方法,通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流体 性能，降低滤饼比阻，提高过滤与分离的速率。 1.

7、降低液体粘度： 根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的 粘度成反比，降低液体粘度可有效提高过滤速率。注意加 热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。 有加水稀释法和加热法,pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷 性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。 氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发 酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值 改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染； 细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下 也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。,2. 调整pH,（1） pH直接影响发酵液中某些物质的电离程度和电荷性质，因此适当调节pH值可

8、以改善发酵液的过滤特性。 （2）氨基酸和蛋白质在酸性条件下带正电，碱性条件下带负电，等电点时净电荷为零，两性物质在等电点下的溶解度最小，等电点沉淀法在生物工业分离中广泛使用。 （3）如味精生产，利用等电点沉淀法提取谷氨酸，一般蛋白质也在酸性范围达到等电点；膜分离中可通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，减少膜堵塞和膜污染； 此外，细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在特定pH下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤进行。,pH对发酵液过滤特性的影响（重点）,采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎 片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较 大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除 去杂蛋

9、白和固体杂质，提高滤液质量。,3. 凝聚与絮凝,助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏 松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到 助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。,4. 加入助滤剂,常用的助滤剂,硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等。 最常用的是硅藻土，使用时，通常细粒用量为500 g/m3； 中等粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为700-1000 g/m3。,加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；如发酵液

10、中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。 不影响目的产物，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，提高过滤速率。,5. 加入反应剂：,（三）凝聚与絮凝,凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。 通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的 作用使溶液中带相反电荷的粒子（即正离子）被吸附在其周 围，在界面上形成了双电层。但是这些正离子还受到使它们 均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势， 在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分。,在相距胶核表面约一个离子半

11、径的Stern平面以内， 正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层或紧密层； 在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开 去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓 度，称为扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型， 如图所示。,凝聚：指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排 斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳 定的现象。 凝聚值：使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度。 反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能 力越强。,1、凝 聚,硫酸铝 Al2(SO4)318H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl36H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO47H2O ； 石灰；ZnSO

12、4；MgCO3,阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序,Al3+ Fe3+ H+ Ca2+ Mg2+ K+ Na+ Li+,常用的凝聚剂电解质有：,2、絮 凝,絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。 絮凝剂：是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具有长链状结构， 其链节上含有许多活性官能团， 包括带电荷的阴离子或阳离子基团以及 不带电荷的非离子型基团。,它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作 用，强烈地吸附在胶粒的表面。 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同 的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮 团，这就是絮

13、凝作用。,工业上使用的絮凝剂可分为三类： 1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。,1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、 聚苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。,工业上使用的絮凝剂,絮凝的效果与絮凝剂的加量、相对分子质量和类型、 溶液的pH、搅拌转速和时间等因素有关。在絮凝过程中， 常需加入一定量助凝剂以增加絮凝

14、效果。 较多的絮凝剂有助于增加桥架数量，但过多的添加量 反而会引起吸附饱和，絮凝剂争夺胶粒而使絮凝团的粒径 变小，絮凝效果下降。,对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理； 对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。,3、混 凝,（四）加入助滤剂,1）助滤剂： 最常用：硅藻土 2）使用方法： 在过滤介质表面预涂助滤剂 直接加入发酵液 也可两种方法同时兼用,（五）加入反应剂,不影响目的产物 作用机理： 加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，生成

15、的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤性能。 正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速率提高3-10倍,二、 发酵液的相对纯化,发酵液中杂质很多，其中有些杂质不仅直接影响产 品质量利收得率，同时对后继提取和精制有很大影响。,发酵液中的杂质,（1）高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe2+） 在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质 的交换容量。,在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力， 在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象使两相分离不清。 在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。 因此

16、，在预处理时，应尽量除去这些物质。,（2）杂蛋白,1. Ca2+ ：草酸、草酸钠形成草酸钙沉淀 草酸价格较贵。 可加入硫酸铅，在60下反应生成草酸铅。后者在 9095下用硫酸分解，经过滤冷却、结晶后可以回收草酸。,（一）高价无机离子的去除方法,2.Mg2+： 草酸镁的溶解度较大。故加入草酸不能除尽镁离子要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠，它和镁离子形成可溶性络合物 Na5P3O10Mg2Mg Na3P3O102Na十 用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度 3.Fe2+ 黄血盐，普鲁士兰沉淀 要除去铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀: 4Fe3+ + 3K4Fe(CN)6 Fe4F

17、e(CN)63+ 12K+,蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。 在酸性溶液中带正电荷； 在碱性溶液中带负电荷。 在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小， 称为等电点。,（二）杂蛋白的去除方法,在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀； 在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、Cu2+、Zn2+Fe3+和Pb+等形成沉淀。 由于羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.05.5）。但单靠调节pH至等电点的办法不能将大部分蛋白质除去。,1. 酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成

18、沉淀,加热， 大幅度调节pH值， 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。 不足之处: 加热法只适合于对热较稳定的目的产物； 极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱； 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合,2. 变性法,加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质； 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。,3. 吸附法,三、 固液分离工程及设备,范围：培养基、发酵液、某些中间产品和半成品。 其中发酵液由于种类

19、多、粘度大和成分复 杂，分离 最为困难。 方法：分离筛、重力沉降、浮选分离、离心分离和过滤等，其中用于发酵液固液分离的主 要是离心分离和过滤分离。,重力沉降 浮 选 通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。 用于固液比重差小、直径530m颗粒的分离，污水处理 旋液分离 悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋风分离器轻相由分离器中央排出，重相由分离器下部排出， 但不适合直径5 m颗粒去除（可用丝网分离器）。,介质过滤 霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法 细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心分离 如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。,1.原理：利用转鼓高速转动

20、所产生的离心力， 来实现悬浮液、乳浊液的分离或浓缩。 2.优点：分离速率快、分离效率高、液相澄清度好等。 3.缺点：设备投资高、能耗大。此外，连续排料时， 固相干度不如过滤设备。 4.种类：种类多，按其作用原理不同，可分为过滤式 离心机和沉降式离心机两大类。,（一）离心分离,基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程 不同密度或不同大小及形状的物质在重力作用下的沉降速率不同，在形成密度梯度的液相体系中的平衡位置不同。 离心分离过程就是以离心力加速不同物质沉降分离的过程。被分离物质之间必须存在或经人为处理产生的密度或沉降速率差异才能以离心方法进行分离。

21、离心分离方法中差速离心法操作最简便，使用最广泛，但其分离纯化分辨率低于密度梯度离心。,离心分离法（重点）,（1）差速离心,采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。 主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。,（2）密度梯度离心,样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。 密度梯度系统：梯度介质有足够大的溶解度，不与分离组分反应，不会引起分离组分的凝集、变性或失活。 常用介质：蔗糖、甘油等。 样品铺在密度梯度溶液表面，离心后形成若干条界面清楚的不连续区带。,（3）等密度离心,当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，不

22、同浮力密度的物质颗粒在离心力作用下一直移动到与各自浮力密度相等的位置（等密度点），形成区带。 等密度离心常用的介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr,（二) 过滤,微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或 细胞碎片以及残余的固体培养基成分。 过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。 在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有高的收率。,1.原理：悬浮液通过过滤介质时，固态颗粒与溶液分离。 2.类型： 澄清过滤 滤饼过滤,过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、 塑料颗粒等。 当悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸 附在滤层的颗粒上，使滤液得以澄清。 适合于固体含量少于0.1

23、g/100mL、颗粒直径在 5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒 类和饮料等的澄清。,（1）澄清过滤：,过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤维等无纺布。 当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方法叫做滤饼过滤。 在滤饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用，适合于固体含量大于0.1g/100mL的悬浮液的过滤分离。,（2）滤饼过滤：,广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、 酵母菌和细菌 等多种发酵液的固液分离。适合 于固体含量1-10%的悬浮液的分离。

24、 优点：过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少， 对不同过滤特性的发酵液适应性强。 缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生 条件差，非过滤的辅助时间较长。,3. 常用过滤设备,（1）板框压滤机,（3）硅藻土过滤机,硅藻土：较纯二氧化硅矿石。化学性能稳定，具有极 大的吸附和渗透能力，是良好的介质和助滤剂。 使用方法： a. 作为深层过滤介质，以过滤含少量(01)悬 浮固形物的液体。硅藻土不规则粒子间形成许多曲折的毛细孔道，筛分和吸附作用除去悬浮液中的固体粒子。,(三)其他固液分离方法,又称交叉过滤和十字流过滤，是一种 维持恒压下高速过滤的技术。 其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向

25、流动， 利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体(滤饼)移走， 过滤速率就近似恒定。 (1)用泵循环使悬浮液流经过滤介质。 (2)在过滤介质表面加以搅拌造成流动，产生切向流。,1错流过滤（切向流过滤）,向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不同的两相 轻相中富含某种高分子化合物 重相中富含盐类或另一种高分子化合物，从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。,2双水相萃取,3吸附法,优点 在于设备简单 能耗低 主要的问题是很难选择合适的吸附剂，以保证目的产物不致于吸附而损失。,化学渗透法,优点： (1) 对产物释放具有一定选择性。 (2) 细胞外形保持完整，碎片少

26、，浆液粘度 低，易 于固液分离和进一步提取。 缺点： (1) 通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。 (2) 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50 。 (3) 有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中 需设法分离除去。,层析技术（重点）,层析技术是利用混合物中各组分物理化学性质的差异，使各组分在固定相与流动相两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的技术。 四种基本的层析技术： 分配层析、吸附层析、离子交换层析和排阻层析,分配层析：以互补相溶而极性相异的为固定相和流动相，其原理是通过各组分溶解度的不同进行分离； 吸附层析：以吸附剂为固定相通过疏水力和

27、静电引力来分离组份； 离子交换层析：以离子交换剂为固定相，通过离子键结合力来分离各组份； 排阻层析：以分子筛为固定相，通过排阻效应来分离各组份。,第四章 细胞的破碎与分离,一、细胞壁结构,细胞的结构：细胞壁、细胞膜、细胞核 细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜。 其中细胞壁的破碎最为关键。主要是破碎细胞壁网状结构的共价键。,外层：甘露聚糖（约占30%，以-糖苷键联结（并非所有酵母菌都有） 内层：葡聚糖（约占30-40%，由D-葡萄糖以-糖苷键联结） 中间层：蛋白质（含6-8%，多为酶类）,细胞壁,a.细胞壁结构： 酵母细胞壁呈“三明治”结构,酵母细胞的细胞壁,b.壁外

28、成分： 有些菌壁外含有由多糖构成的类似荚膜的结构。 包括异多糖、甘露聚糖和淀粉类物质。 c.细胞壁的少量组分脂类和几丁质（chitin)：为聚乙酰氨基葡萄糖 几丁质并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因种而异。裂殖酵母一般不含几丁质，酿酒酵母含12%，有的假菌丝酵母含量超过了2%。,植物细胞壁,植物细胞壁由胞间层、初生壁、次生壁组成。 胞间层位于两个相邻细胞之间，为两细胞共有的一层膜； 随着细胞生长，原生质分泌纤维素、果胶质及结构蛋白，形成初生壁； 初生壁内继续积累纤维素和半纤维素，称为次生壁。,二、细胞破碎动力学,细胞破碎的目的： 使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，增大其通透性，使细胞

29、内的目标产物得到释放。,破碎率的评价,直接计数： 直接对适当稀释后的样品进行计数，可以通过平板计数技术或在血球细胞器上用显微镜观察来实现最终染色细胞的计数。 （1）计数器 （2）平板计数 （3）显微镜,三、细胞破碎方法,主要采用各种机械破碎法和非机械法（化学破碎法），或机械破碎法和化学破碎法相结合。 机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力。 化学破碎又称化学渗透，利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。,（一）机械破碎 主要有高压匀浆法、珠磨法、撞击破碎和超声波破碎 特点

30、：处理量大，破碎效率高，速度快。,细胞化学破碎法,细胞物理破碎法,1、高压匀浆法,结构和原理高压匀浆器，由高压泵和匀浆阀组成。,原理：细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力的综合作用下破碎。 操作压力：5070MPa,2) 影响破碎率的因素,3) 适用范围和操作注意点 酵母和大多数细菌细胞的破碎，料液细胞浓度可达到20%左右，团状和丝状及小的G+菌不适。,压力 循环操作次数温度 细胞浓度 细胞生长速率,2、珠磨法,1)研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，

31、使达到细胞的某种程度破碎。 适用大多数微生物的细胞破碎,将细胞在珠磨机中破碎被认为是最有效的一种细胞物理破碎法。 破碎微生物细胞用的珠磨机有多种形式。,影响破碎效果的因素： 磨珠大小、搅拌速度、流量、细胞浓度、装珠量、温度等。要想获得一个最大破碎率，要有较高的装珠量、较高的搅拌速度、较小的磨珠直径和适中的细胞浓度。 珠磨的细胞破碎效率随细胞种类而异，随搅拌速度和悬浮液停留时间的增大而增大。 珠磨法适用于绝大多数微生物细胞的破碎。,对于释放胞内酶而言，细胞完全破碎是不必要的，胞内酶的释放速率取决于其在细胞中的位置； 细胞浓度对破碎过程有着非常重要的影响，一般通过响应曲面法分析优化，得到一个最佳细

32、胞浓度和珠磨时间。,(3)喷雾撞击破碎,细胞是弹性体，难于破碎，将其冷冻成为刚性球体，可以降低破碎难度。 悬浮液以喷雾状高速冻结，形成微粒子，在高速载气作用下送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。,声频高于1525KHZ的超声波在高强度声能输入下，利用空化现象引起的冲击波和剪切力使细胞破碎。 超声波气泡形成气泡长大破碎 超声波的声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型均影响破碎效率。 缺点：产生化学自由基团氧化产物，且噪声大。,4、超声波破碎,4、其他类型机械破碎法,X-press法： 将浓缩的细胞悬浮液低温冷却形成冰晶，再施以高压，高压力冲击造成冰晶磨损使细胞破裂。 微波法： 胞

33、内物质局部受热，内压升高使细胞表面出现孔洞或裂纹，小分子能够出入细胞，细胞仍保持其形态。此法处理蛋白质分子三维结构随微波场方向变化而被破坏，蛋白质分子缠绕成球，改变溶解性，便于包含体中重组蛋白的回收。,（二）化学和生物化学渗透,酸碱法 加入酸或碱调节溶液pH值，改变两性物质的电荷性，从而使蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的相互作用力下降而易于溶解。 盐法： 高浓度盐可产生高的渗透压，破坏细胞壁的通透性，使细胞失水，质壁分离，造成细胞自身破裂释放出内容物（化学渗透学说）。,酶溶法 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法进一步破坏。 酶的主要作用是破坏

34、细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,4.化学渗透法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质

35、释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,变性剂法 加入变性剂，可削弱氢键作用，使胞内产物相互之间的作用力减弱而易于释放。如盐酸胍。 温和化学渗透剂处理 渗透剂一般采用分子量较小的非极性甘氨酸、丙氨酸，其更易渗透到细胞壁中，通过氢键、范德华力、静电引力等化学亲和力改变细胞壁结构，从而改变细胞的通透性。同时能维持ADH的高活性，有广泛的应用前景。,（三）物理破碎法,冻融法 将细胞冻结后再融化。

36、破坏细胞膜的疏水键，增加亲水性和通透性。同时由于细胞内水结晶使细胞内外产生浓度差，而导致渗透压产生，并且细胞内形成的冰晶也会破坏细胞壁。 低温玻璃化法 低温断裂是从超微结构上损伤细胞，使细胞壁、细胞膜等成分破坏。避免了高温高压、强酸强碱对营养活性成分的破坏。,选择细胞破碎方法的依据（重点）,机械法依靠专用设备，利用机械力的作用将细胞切碎，所以细胞碎片细小、胞内物质一般都全部释放，故细胞浆液中核酸、杂蛋内等含量高，料液黏度大，给固液分离带来较大困难；但也具有很多优点，如设备通用性强，破碎效率高，操作时间短，成本低，大多数方法都适合大规模工业化等。 非机械法是利用化学试剂或物理因素等来破坏局部的细

37、胞壁或提高壁的通透性，故细胞破碎率低胞内物质释放的选择性好，固液分离容易。但往往破碎率较低，耗费时间长，某些方法成本高，一般仅适合小规模。,选择细胞破碎方法的依据,1）细胞的处理量：若具大规模应用前景的，则采用机械法。若仅需实验室规模则选非机械法。 2）细胞壁的强度和结构：细胞壁的强度除取决于网状高聚物结构的交联程度外，还取决于构成壁的聚合物种类和壁的厚度，如酵母和真菌的细胞壁与细菌相比，含纤维素和几丁质强度较高，故在选用高压匀浆法时，后者就比较容易破碎。某些植物细胞纤维化程度大、纤维层厚、强度很高，破碎也较因难。 3）在机械法破碎中，破碎的难易程度还与细胞的形状和大小有关，如高压匀浆法对酵母

38、菌、大肠杆菌、巨大芽孢杆菌和黑曲霉等微生物细胞都能很好适用，但对某些高度分枝的微生物，由于会堵塞匀浆器阀而不能适用。,三、胞内产物的溶解及复性,利用微生物大规模生产蛋白质药物或多肽，成为一个有效的蛋白质生产新途径，其中以大肠杆菌为宿主最为常用。 大肠杆菌中高效表达的蛋白质常在胞内聚集，形成不可溶、无生物活性的包含体。包含体必须经过变性、复性才能获得生物学功能。,1、包含体及其形成,包含体是聚集蛋白形成的浓密颗粒， 在适当条件下，其中蛋白可达细胞中总蛋白的50%甚至更多。 包含体中主要是重组蛋白，几乎不含宿主蛋白、核糖体组分或DNA、RNA片段。,包含体是蛋白的沉积与溶解的不平衡状态形成的一种动

39、力学结构。 包含体蛋白的聚体是个可逆过程，蛋白质水平的表达、蛋白质形成错误的二硫键、重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏相应的翻译后加工功能，蛋白折叠过程中缺乏酶和辅助因子等是包含体形成的主要原因。,2、包含体的分离和溶解,包含体蛋白没有生物活性，需要有效的溶解、折叠和纯化工艺恢复其活性。 细胞破碎后，分离出来的包含体中主要是重组蛋白，也含有上些细胞碎片、膜蛋白、脂类、核酸及其他杂质，需要进行分离。包含体密度较大，用低速离心即可分离纯化。,包含体中重组蛋白处于错误折叠状态,主要靠非共价键连接,唯一的共价键是二硫键，因此要获得正确的折叠首先要破坏二硫键和非共价键。 方式：蛋白质解体变性，不溶的聚体成

40、为可溶性蛋白。强变性剂破坏次级键，引起构象解体。去污剂与蛋白质疏水区作用，避免蛋白形成疏水核心。还原剂有助于半胱氨酸维持还原态，可防止碱性条件下形成二硫键而聚集。螯合剂可防止金属催化的半胱氨酸空气氧化。,3、蛋白质复性,变性剂去除或浓度降低后，蛋白质会自发地从不稳定状态向稳定状态转变，形成具有生物学活性的天然结构。 复性步骤： 包含体自大肠杆菌中分离； 聚集蛋白的溶解； 溶解蛋白的折叠和纯化。,（一）蛋白质复性方法（重点）,1、稀释与透析复性法 （1）稀释复性： 将变性蛋白质溶液直接加入到复性缓冲液中，蛋白质周围变性剂浓度降低，从而使蛋白质折叠成天然构象。 优点：操作简单、快速。是目前最常用的

41、蛋白质复性方法之一。 缺点：变性蛋白质会发生错误折叠或重新形成聚集体，造成复性率下降。 改进：将变性蛋白质加入到复性液中。 现状：需大容器、大量缓冲液和浓缩，成本较高，不适用于大规模。,（2）透析复性： 将变性蛋白质装入透析袋中，对复性缓冲液进行透析。也是基于去除变性剂的机理使蛋白质复性。 特点：透析过程主要是扩散作用，需时间较长，易造成蛋白质聚集。 改进：缓慢透析法，使变性剂浓度下降连续，不会出现变性剂浓度突变，可减少蛋白质复性中产生沉淀，提高活性蛋白效率。,3色谱复性技术 （1）凝胶过滤色谱 也称体积排阻色谱，可实现变性剂去除与蛋白质复性同时进行。 采用适宜大小的凝胶过滤体系，根据折叠中间

42、体的半径，通过捕获其不同形式将蛋白分子相互分开，减少中间体的相互作用，提高复性率。梯度缓冲液可有效增加活性蛋白质得率。,（2）吸附色谱 利用色谱固相介质对变性蛋白的吸附作用，将其固定在介质表面，使蛋白质分子彼此分开。 疏水作用基质有提高复性率的效果。疏水作用基质与变性蛋白大量暴露疏水基团之间有疏水作用，能进一步降低聚集。,3、反胶束萃取复性法 将变性蛋白萃取到反胶束中，达到蛋白质分子彼此分开，从而提高蛋白质的复性率。 变性剂存在会抑制变性蛋白萃取过程。,第五章 沉淀分离,一 概 述,1、定义 沉淀分离法是利用沉淀反应有选择地沉淀某些离子，而其它离子则留于溶液中从而达到分离的目的。它发生的必要条

43、件是溶液体系对某些离子是饱和的。 沉降：指当悬浮液静置时，密度较大的固体颗粒在重力的作用下逐渐下沉，这一过程成为沉降。 2、沉淀分离法分类 沉淀法主要包括：沉淀分离法和共沉淀分离法 。 两种方法的区别主要是：沉淀分离法主要使用于常量组分的分离（毫克数量级以上或一般0.01mol/L)；而共沉淀分离法主要使用于痕量组分的分离和富集（小于1mg/mL )。,3、共沉淀现象及其分类,1） 共沉淀现象 当沉淀从溶液中析出时，溶液中的某些原本可溶的组分被沉淀载带而混杂于沉淀中，这种现象称为共沉淀现象。,共沉淀现象常使沉淀被污染，是重量分析中误差的主要来源,但是，正是利用共沉淀剂对某些微痕量组分的定量沉淀

44、能力，产生了在分离和富集上有广泛应用的共沉淀分离法。,2） 共沉淀现象的分类,按其机理的不同可分为：结晶共沉淀和吸附共沉淀 结晶共沉淀： 微量物质的离子、分子或小的晶格单位取代沉淀物晶格上的常量物质，并进入到晶格内部而从液相转移到固相的一种现象。 (选择性比较高) 吸附共沉淀： 微量物质吸附在常量物质沉淀表面而从溶液相转移到固相的一种现象。（选择性不高）,4、共沉淀分离法,1） 定义 共沉淀分离法是加入某种离子与沉淀剂生成沉淀，加入的某种离子作为载体，将痕量组分定量地沉淀下来，然后将沉淀分离（溶解在少量溶剂中、灼烧等方法），以达到分离和富集的目的的一种分析方法。,2） 共沉淀剂要求及分类 (1

45、) 沉淀剂要求 要求对欲富集的痕量组分回收率高。 要求共沉淀剂不干扰待富集组分的测定。,1） 氢氧化物沉淀： 如：Fe(OH)3, Al(OH)3, MnO(OH)2等，主要利用表面吸附作用使痕量金属离子共沉淀。 2） 硫化物沉淀： 如：PbS、HgS等，共沉淀是除吸附、吸留作用 3）某些晶形沉淀： 如：BaSO4，SrSO4，SrCO3等，可与生成相似晶格的离子形成混晶（如BaSO4-RaSO4、BaSO4-PbSO4等）而共沉淀。,(一）无机共沉淀剂,(2) 沉淀剂按使用载体类型不同分： 无机共沉淀剂 有机共沉淀剂,（1）热饱和溶液冷却（等溶剂结晶），适用于溶解度随温度升高而增加的体系；同

46、时，溶解度随温度变化的幅度要适中； （2）部分溶剂蒸发法（等温结晶法），适用于溶解度随温度降低变化不大的体系，或随温度升高溶解度降低的体系； （3）真空蒸发冷却法，使溶剂在真空下迅速蒸发，并结合绝热冷却，是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种结晶方法。（ 4）化学反应结晶，加入反应剂产生新物质，当该新物质的溶解度超过饱和溶解度时，即有晶体析出。,饱和溶液形成的方法（重点）,1、概念 由于处于微量和低浓度状态下的放射性物质的使用，使得实验操作很困难，会带来非正常实验误差，因此常加入非放射性物质载体和反载体来克服之。 载体；反载体；体积分配；表面分配；回收率；富集因素,二 结晶共沉淀,1）载体(C

47、arrier)： 沉淀微量组分时，往往需要加入某常量组分，当常量组分沉淀时，微量组分也一起被沉淀下来，加入的常量组分起着载带微量组分的作用，因此称为载体。 若二者同位素关系，则称为同位素载体否则称为非同位素载体。（例如Ca2+及草酸沉淀剂可使45Ca2+沉淀析出，226Ra2+会随Ba2+与SO42-形成Ba(Ra)SO4沉淀，Ba为Ra2+非同位素载体。,6） 包藏（吸留或包埋） 沉淀速度过快，表面吸附的杂质来不及离开沉淀表面就被随后沉积下来的沉淀所覆盖，包埋在沉淀内部，这是一种因吸附而留在沉淀内部的共沉淀现象。 减少或消除方法： 包藏是在结晶内部，不能用洗涤方法除去，可通过陈化或重结晶的方

48、法予以减少。 7） 后沉淀(继沉淀)现象 溶液中被测组分析出沉淀之后在与母液放置过程中，溶液中其它本来难以析出沉淀的组分（杂质离子)在该沉淀表面继续沉积的现象 注：后沉淀经加热、放置后会更加严重 消除方法： 缩短沉淀与母液的共置时间,4、重结晶和分级结晶,1） 重结晶： 在第一次结晶以后，经固液分离，尾液弃去，结晶固体重新溶解溶液后，在同样条件下再次结晶沉淀。以此类推，这种结晶溶解再结晶的过程叫多次结晶。 优点：经多次结晶，提高微量组分和常量组分之间的分离效率 缺点：微量组分损失量大一些。 2） 分级结晶： 每次结晶后含有微量组分的尾液蒸发后重新结晶，其操作流程类似于分液漏斗模拟的逆流萃取。

49、优点及缺点： 由于对每次结晶后尾液进行了利用，从避免了微量组分的损失,三 吸附共沉淀,吸附：利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。 吸附共沉淀由于沉淀或结晶表面对其它溶质的 吸附造成的共沉淀。 吸附共沉淀能力的强弱，与载体沉淀的组成、形 成方式、表面带电性质有关，还与被吸附物质本 身性质及外界电解质有关。,四 结晶动力学 研究结晶物质的结晶形成方式和过程以及结晶速率对时间、温度和分子结构等影响因素的依赖关系。,结晶过程概括为以下几步: (1) 溶液达到过饱和； (2) 晶核生成； (3) 晶核生长形成晶体。,晶体(沉淀)的形成过程,* 均相成核：构晶

50、离子在过饱和溶液中，通过离子的缔合 作用，自发形成晶核。 * 异相成核：溶液中混有的固体微粒，在沉淀过程中起着 晶种的作用，诱导沉淀的形成。,盐析沉淀法 有机溶剂沉淀 等电点沉淀法 成盐沉淀法 高分子聚合物沉淀 选择性变性沉淀法,五、蛋白质沉淀,（一） 盐析沉淀法,盐析法： 在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 盐析：利用不同物质在高浓度的盐溶液中溶解度的差异，向溶液中加入一定量的中性盐，使原溶解的物质沉淀析出的分离技术。,（一）基本原理 蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。 这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白

51、质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等参数的影响。,蛋白质在自然环境中通常是可溶的， 表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团,蛋白质呈稳定的分散状态,两性物质，一定pH下表面带有一定的 电荷，静电斥力作用使分子间相互排斥,蛋白质周围的水分子有序排列，在表面形成水化膜，这一层能保护蛋白质粒子避免因碰撞而聚沉。,当向蛋白质溶液中加入中性盐时：,低盐-盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大),高盐-盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小),盐离子部分中和蛋白质的电性，使分子间排斥作用减弱,中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水

52、中发生水化作用从而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区域,蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。,（二）无机盐的选择,在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4, Na2SO4， MgSO4，NaH2PO4，NaCl， Na3PO4, K3PO4。,(NH4)2SO4原因,廉价 在水中溶解度大，且溶解度随温度变化小，低温下仍具有较大的溶解度 对大多数蛋白质的活力无损害,盐析效果：阴离子 阳离子 尤其以高价阴离子更为明显。,阳离子对盐析效果的影响： Al3+ H+ Ba2+ Sr2+ Ca2+ Cs+ Rb

53、+ NH4+ K+ Na+ Li+,（三）影响盐析的各种因素,无机盐的加入量 蛋白质的浓度 温度 pH 操作方式,3.温度的影响,低盐浓度：温度升高，溶解度升高 高盐浓度：温度升高，溶解度降低,温度适当提高有利于蛋白质沉淀。 高温容易导致蛋白质变性。 蛋白质盐析一般在室温下进行，某些温度敏感性的蛋白质盐析最好在低温下进行。,4.pH的影响 蛋白质在pI时的溶解度最小，最容易从溶液中析出，因此选择在被盐析的蛋白质的pI附近。 耗盐少，蛋白质收率也高,6.盐析法的优缺点,（1）优点： 室温下沉淀物在硫酸铵盐析溶液中长时间放置不会失活，且无机盐不容易引起蛋白质变性失活； 非蛋白的杂质很少被夹带沉淀；

54、 适用范围广，几乎所有蛋白质和酶都能采用 设备简单，操作方便。,（2）缺点： 沉淀物中含有大量盐析剂 硫酸铵容易分解产生氨的恶臭味，产品不能直接用于医药上,盐析法可以作为初始的提取方法，再与多种精制手段结合起来，如采用超滤、凝胶色谱、透析等方法将无机盐去除，就可制得高纯度产品。,（二）有机溶剂沉淀法,在蛋白质等生物大分子的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能显著降低蛋白质等生物大分子的溶解度，使其沉淀析出。 不同蛋白质沉淀时所需有机溶剂的浓度不同，因此调节有机溶剂的浓度，可以使混合物中的蛋白质分段析出，达到分离纯化的目的。 不仅适于蛋白质的分离纯化，还常用于酶、核酸、多糖等的分离纯化。,（一

55、）基本原理,加入有机溶剂后，会使系统（水和有机溶剂的混合液）的介电常数减小，而使溶质分子（如蛋白质分子）之间的静电引力增加，从而促使它们互相聚集，并沉淀出来。 水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与溶质结合的自由水，使其表面的水化层破坏，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生凝聚，沉淀析出。,常用于生物大分子沉淀的有机溶剂： 甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等， 其中乙醇是工业上最常用的,（二）影响沉淀效果的因素,温度 pH 中性盐浓度 金属离子,1.温度的影响,有机溶剂存在下，多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著的减小，因此低温下（最好低于0oC）沉淀得完全，有机溶剂用量可减少。 实际操作中： 有机溶

56、剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加对蛋白质的变性作用。,整个操作过程应在低温下进行。 具体操作时： 将待分离溶液和有机溶剂分别进行预冷： 蛋白质溶液冷却到0oC左右， 有机溶剂预冷到-10oC以下 为避免温度骤然升高损失蛋白质活力，操作时应不断搅拌、少量多次加入。 使沉淀在低温下短时间处理后即进行过滤或离心分离，接着真空抽去剩余溶液或将沉淀溶入大量缓冲溶液中以稀释有机溶剂，旨在减少有机溶剂与目的物的接触。,温度的控制应根据蛋白质的稳定性而不同，稳定性较差的物质，冷却至低温是必要的；但对于稳定性较好的物质，如淀粉酶，温度不需过低，10-15oC。,2.pH的影响,在等

57、电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂沉淀时溶液pH多控制在蛋白质等电点附近。 pH的控制必须考虑蛋白质的稳定性： 某些酶的等电点在pH4-5之间，比其稳定的pH范围低，因此pH应首先满足蛋白质稳定性的条件。 控制pH时应使大多数蛋白质分子带相同电荷，不要让目的物与主要杂质分子带相反电荷，以免共沉。,3.无机盐的离子强度,少量的中性盐能够减少蛋白质变性。在有机溶剂沉淀时中性盐浓度以0.01-0.05 mol/L为宜。 常用中性盐: 乙酸钠、乙酸铵、氯化钠 中性盐浓度较高时（0.2 mol/L以上），由于盐溶作用会增大蛋白质的溶解度，此时需增加有机溶剂的用量才能使沉淀析出。 对盐析后的上清液或沉淀

58、物，如进一步用有机溶剂沉淀法纯化，必须先脱盐。,4.金属离子,一些金属离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并减少有机溶剂用量。 使用时避免能与这些金属离子形成难溶盐的阴离子存在（如磷酸根）。 常用的锌盐：醋酸锌或硫酸锌,5.有机溶剂沉淀法的优缺点,（1）优点： 乙醇等有机溶剂易挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净（不需要脱盐处理）； 有机溶剂密度低，沉淀物与母液间的密度差较大，分离容易，适于用离心分离收集沉淀物。,（2）缺点： 容易使蛋白质变性，操作需要在低温下进行，使用上有一定的局限； 采用大量有机溶剂，成本较高。 为

59、节省用量，通常将蛋白质溶液适当浓缩，并回收溶剂。 有机溶剂易燃易爆，工业生产上车间和设备都应有防护措施。,等电点沉淀法 成盐沉淀法 高分子聚合物沉淀 选择性变性沉淀法,（三） 其他沉淀方法,1.等电点沉淀法 两性物质在pH=pI时，分子表面净电荷为零，分子间静电排斥作用减弱，因此吸引力增大，能相互聚集，发生沉淀。 不同的两性物质，pI不同，如不同蛋白质。根据这一特性，用依次改变溶液pH的方法可将不同的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。,只适用于水化程度不大、在pI时溶解度很低的两性物质，如酪蛋白。 对于亲水性很强的两性物质，在pI及pI附近仍有相当的溶解度，用该法沉淀不完全，而且许多生物分子的pI很接近，因此很少单独使用。 往往与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法结合起来。 采用该法时必须注意：