ultra-centrifuge超速离心PPT演示课件.ppt

1、超离心实验技术分子生物学研究手段之一,您真正了解离心分离的原理吗？ 您知道如何正确的使用离心机吗？ 您知道如何利用现有的文献，使用现有离心设备离心吗？ 四种超离心转头，应该使用哪种转头分离我的样本？又该如何分离？ 哪些不当使用会导致离心机出现故障？,您了解吗？,系统生物学的研究是这时代最令人关注的前沿研究方向，它所研究的已经不是某一个特定的基因、蛋白或细胞的功能，而注重将基因组、蛋白组、细胞生物学作为一个整体来研究，看看它们在生命状态及特定条件下的相互作用，从而进一步认识生命本身，揭示疾病的发生发展过程，为新药的开发提供更精确的信息和技术平台。 在整个系统生物学的研究过程中，离心技术可说是“无

2、处不在”，不论在核酸、蛋白还是细胞，我们都可以使用不同的离心机，不同的离心技术作分离的工具。此外，离心机更可作分析的手段。蛋白的结构、蛋白与蛋白或小分子的相互作用及分子量的测定等等，这都是分析超速离心机可以帮助科学家进一步研究蛋白的不同层面 。所以，离心技术可以说是整个系统生物学研究不可缺少的重要部分。,内 容,重要参数 转头的介绍 离心技术的选择 不同生物样本的分离模式,重要参数 离心力,离心力才是样本分离的重要实验参数 离心技术的基本功能是将不同大小的颗粒从溶液中分离，对于生物医学样品来说，颗粒意味着像细胞、细胞器、病毒、核酸或大分子之类的东西。如蛋白，由于不同颗粒的沉降系数各异，分离所需

3、的时间亦有不同，而时间的长短就大大取决于分离时作用在颗粒上的离心力。因此，在众多的参考文献中都是以离心力（g force）作为实验参数的说明而非转速（rpm）。因此，体现离心机最高功能的指标就是离心力。,重要参数 相对离心力（g）,离心分离时，作用在悬浮颗粒上的力常用相对离心力数值来表示，这就是说，同一颗粒在离心时同地球重力相比较后得到值称为相对离心力（RCF） RCF=离心力/重力=m2x/mg= 2x/g RCFmax=1.12 rmax（RPM/1000）2 Or RPM=103 RCF/1.12rmax r：旋转中心至转头内离心管某一部分的半径（以mm为单位）RPM：转头每分钟旋转的转

4、数,离心力的大小与旋转速度以及旋转半径成正相关性。,下图为离心管在不同类型转头中的Rmax及Rmin,重要参数 RCF与RPM的关系,RCFmax=1.12 rmax（RPM/1000）2 RPM=103 RCF/1.12rmax t1RCF1=t2RCF2,重要参数 沉降系数,颗粒在单位离心力的作用下的移动速度称沉降系数 S=（dx/dt）2x dx：颗粒与转子中心之间的距离；dt颗粒沉降所需时间； 2x角速度与转子半径 1S=110-13S， 例：10S=1010-13S 沉降系数以秒为单位，其物理意义是被测定颗粒达到极限速度时所需时间，换句话说，如100S的颗粒，从原来静止状态，速度等于

5、零，在加速经过10010-13S的时间后，颗粒便达到极限的速度。,重要参数 沉降系数,如何计算沉降系数？ V=d2（Pp-P)g/18u v：颗粒沉降速度 d：颗粒直径 Pp：颗粒密度 P：溶液密度 u：溶液介质粘度 g：重力,重要参数 沉降系数,生物颗粒及大分子的沉降系数,重要参数 沉降系数,Table：Sedimentation coefficients of marker molecules,重要参数 沉降系数,几种蛋白质的物理性质,重要参数 沉降系数,重要参数 沉降系数,Optima MAX 是现时唯一超过一百万离心力 （1,019,000 g)的超速离心机，比其他厂家高出100,00

6、0 g，因此可以覆盖广泛应用。 MLA-130定角转头，离心力 高达1,019,000 g,重要参数 沉降系数,沉降系数（S）参考表 蛋白、酶、肽2-25S 核酸 3-100S 核糖体 20-200S 病毒 40-1000S 溶酶体 4000S 细胞膜 100-100103S 线粒体 20103-70103S 细胞核 4000103- 40000103S,Optima MAX实验时间参考 蛋白质的区带分离时间：1小时 病毒分离：1小时 亚细胞组分分离：20分钟内 细胞膜分离：15分钟 RNA分离：1小时 以氯化铯进行质粒DNA提取：30分钟 脂蛋白分离：2.5小时,重要参数 k 因子,离心时间

7、的计算： K因子与每个转头的离心效率有关，可以用于推算颗粒经过水溶液形成沉淀所需要的时间（小时）。离心头的K值一般由出售离心机公司提 供。知道k因子和S值(沉降系数）就可以计算出离心时间 t=K/S 提供的k因子是指最高速度时的k值，但并不是所有的离心都在最高速 度，减低速度后所需的离心时间，则应 Kadj=K(reter speed of rotor/run speed)2 由上可以看出k值越小，离心时间短，离心头的离心效率高；k值越大，离心时间长，离心头的离心效率低 K=(Inr2-Inr1) 2.5 1011(r/min)2 （r1=最小半径， r2=最大半径）,重要参数,转头的性能指标

8、 - 能形成的RCF - k因子：根据此值可以算出沉降已知S系数的颗粒所需的时间 t = K/S K1/t1 = K2/t2 - 如在甲转头中沉降某种颗粒所需时间为t1，可根据下式算出在乙转头中沉降同样颗粒所需时间t2 t2 =K2t1/K1 - t1RCF1 =t2RCF2 t2 = t1RCF1/RCF2,重要参数,离心转头的减速计算 离心转头只能在样品密度不超过厂家设计的密度（一般为1.2g/cm3，也有为1.7g/cm3）时，才可采用最高速度。在离心高于规定密度的样品时要减速，对水平离心转头尤为重要。用下列公式可计算出在所用样品密度时应采取的最高离心速度。 Qd = Qn （D/E）

9、D为离心转头设计的密度。E为离心样品的密度， Qn是正常最高离心速度， Qd是所求的离心速度。,重要参数,颗粒在介质中的速度大小同下列因素有关 沉降速度大小与颗粒直径的平方（d2）成正比 沉降速度与颗粒密度同介质密度之差（Pp-Pm）成正比，当颗粒密度等于介质密度时，沉降速度接近于零 沉降速度与外加离心场（2X）成正比 沉降速度ui介质粘滞度成反比，随着粘滞度增加速度减慢 沉降速度与颗粒形状有关，当颗粒偏离球形越大，则f/f0的摩擦比也越大，导致速度减慢 * f/f0非球形颗粒受到阻力f与同等体积球形颗粒受到的阻力相比的值,归 纳,离心方法已被广泛地应用于生物化学、生物物理学、细胞学、分子生物

10、学和医学研究之中。 分离细胞或其他的悬浮颗粒，去除细胞周围的杂质，从混有多种细胞的悬浮液中分离出来某一细胞。 从组织匀浆中分离各种细胞器，包括细胞核、线粒体、叶绿体、高尔基体、溶酶体、过氧化酶体、质膜、内质网和多聚核糖核蛋白体亚单位等等。 分离病毒和大分子，包括DNA、RNA、蛋白质和脂类。 测定大分子的物理参数，如沉降系数、分子量、浮动密度和扩散系统等。 通过离心分离或离心分析有的可直接获得有关细胞、细胞器、病毒和生物大分子的信息，有的为进一步作化学分析、生物学功能测定以及形态学上观察超微结构提供了基础。,归 纳,超速离心 超速离心是生物化学和分子生物学不可缺少的技术手段。广泛应用于大分子、

11、细胞、细胞器等的分离、纯化。根据不同的目的，可以采用不同的方法和技术。溶液经过超速离心可以分为上清与沉淀，但得到的沉淀与上清都是不均一的。前者含有最初溶液中所有的颗粒，而后者也仍含有少量的颗粒，但其大小必沉淀颗粒要小得多。这样得到的上清，可进一步用更高速度的离心来分离其中的成分，称为差速离心。如需得到纯的物质，则应采用分析超离技术。应用密度超速离心可以了解物质的某些物理性质，如沉降系数及近似密度并得到一定量的较纯物质。,细胞结构,真核细胞结构,典型的植物细胞,典型的动物细胞,转头,转头时离心技术的核心 利用离心转头分离样本，除了离心机是必需之外，转头也是不可缺少的内容。要达到良好的分离效果，转

12、头的选择是非常重要的。样品分离后的纯度、分离的时间及转头类别的关系大致如下：,纯度,分离速度,垂直转头,近垂直转头,固定角转头,水平转头,转头,Table: Type of rotors and their applications,aNVT rotors are not recommended for pelleting samples.,离心方法,差速离心法 等密度梯度离心法 速率区带法,密度梯度离心,离心方法-差速离心法,差速离心法（differential centrifugation) 特点：最常用的方法操作简便，但其分离的纯度不高。 基本原理：逐次增加离心力，每次可沉降样品溶液中的

13、一些组分。 在这种方法中，离心管在开始时 装满了均一的样品溶液（见图）。 通过在一定速度下一定时间的离 心后，就可得到两个部分：沉淀 和上清 通常在第一次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组分大部分仍留在上清液中，然后将收集到的上清液以更高速度离心，把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当，使大部分不需要的更小粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心，直至达到所需的分离纯度为止。,离心方法-差速离心法,差速离心后的细胞组分 -组织样品的亚细胞分离,离心管中离心前后的样品,离心方法-差速离心法,固定角转头,离心方法-密度梯度离心法,密度梯度离心法 （dens

14、ity gradient centrifugation） 特点：可以同时使样品中几个或全部组分分离，具有很好的分辨率 这方法在操作上比差速离心稍为负责，但可以补偿差速离心之不足，共有两种不同方法： - 速率区带法（rate-zonal) - 等密度离心法（Isopyonic）,离心方法,区别沉降速度离心和沉降平离心,离心方法-速率区带法,速率区带法基本原理：根据样品中不同粒子所具有的不同尺寸大小及沉降速度（S）来分离。样品粒子的密度必须大于梯度溶液中任一点的密度，而离心过程必须在区带到达管子底部前停止 在分离过程中（见图）： 1）在离心管中装入密度梯度溶液，溶液的 密度从离心管顶部至底部逐步增

15、加（正 梯度） 2）将所需分离的样品小心地加至密度梯度 溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成 一负梯度。 3）由于不同大小的粒子在离心力作用下梯度 中移动的速度不一样，所有经过离心后， 会形成几条分开的样品区带。,离心方法-速率区带法,速率区带离心常用的介质,离心方法-速率区带法,等密度梯度介质的应用,*+ 很好， + 好，+ 可以， 不适用,离心方法-速率区带法,各种大分子在蔗糖梯度溶液中的大约密度,离心方法-速率区带法,离心方法-速率区带法,梯度形状的选择：梯度形状对于分离是否成功非常重要，下图列举了常用的梯度形状。 1）线形密度梯度，分离蛋白质、 酶、激素、核糖体和一些植物病 毒有良好的分

16、离效果。 2）向下凹的梯度，适用于脂蛋白 或一些需要上浮分离的样品。 3）不连续或阶梯式梯度，最适用 于分离整个细胞、植物或动物组织 匀浆中的亚细胞组分，以及纯化一 些哺乳 动物病毒或昆虫病毒。 此外，等速梯度是指这样一种梯度，其中粒子的沉降速度和梯度液柱的长度无关，各区带沉降速度不变，常用的5-20%蔗糖线形梯度就是这样一种梯度。 巨大分子如核糖亚基、多核糖体以及一些植物病毒，需要一种陡峭以及长液柱以增进分离能力。,样品铺置到梯度液柱上去的方法,Distance from meniscus (mm),Conditions for density gradient separations,加样

17、,阶梯梯度分离效应,转头- 水平转头,从鼠肝匀浆的组分经不连续蔗糖梯度纯化的亚细胞组分,不同细胞器纯度鉴定- 电子显微镜下的形态学（morphology）鉴定,标志酶鉴定： 测定为某种细胞器所特有的某种专一的酶，这种酶不存在于细胞的其他部位： 过氧化氢酶 过氧化氢酶体 琥珀酸脱氢酶 线粒体 组织蛋白酶C 胞质溶胶 酸性磷酸酶 胞质溶胶 碱性磷酸酶 质膜,离心方法- 等密度离心法,基本原理：根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。 在分离开始前，样品可与梯度介质混合 在一起，或铺在密度梯度液上面。在离 心力的作用下，梯度物质在离心管中重 新分布，因而形成了

18、所需要的浓度（和 密度）梯度。同时，样品颗粒，开始时 就分布在整个管子中的，沉降或悬浮到 它们的等密度位置上（见图）。 这种自我生产梯度技术，常常需要很多小时的分离。例如，等密度DNA带在氯化铯自我形成梯度情况下，就需要36-48小时。特别要注意，增进转速并不能缩短运转时间；其结果只是改变了在离心管中带的位置，因为在更大的离心力下，梯度物质将重新分布而更进一步的下到管底部。而密度梯度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。,垂直转头,（a）,（b） Centrifugal force,固定角转、水平转头CsCl自成梯度状况,Bottom,Top,Short Technical Reports,细胞分离的假象问题,1、细胞凝块（凝聚）现象： 影响纯化，降低回收率。 采用低细胞浓缩，增进组合，白蛋白，血清，DNase（减少凝胶化）。蛋白酶或EDTA于介质中。 工作于4，减少凝块，例：窦状活细胞，分离初期遭受到凝块，可采取工作稳定大约20 。,细胞分离的假象问题,2、含有细胞样品液超负载 合适的细胞数量，不能超过梯度液容量。 超负载细胞梯度液会造成宽区带。 表面粘团，细胞沉淀。,细胞分离的假象问题,3、壁效应： 离心管不平行离心管-固定角转头。 由于本身密度梯度增进，引起干扰梯度的稳定性。 增长从旋转中心到离心管间距梯度，减少壁效应，细胞丧失-水平