生化工程实习..ppt

1、生化工程實習 (PROTEIN),實驗二 蛋白質分子量測定- SDS-聚丙 烯醯胺凝膠電泳,一、實驗目的： 1.學習SDS-PAGE測定蛋白質分子量的原理 2.掌握SDS-PAGE測定蛋白質分子量的操作 方法,二、實驗原理： 1.Stokes 方程式 2.電泳只需兩件儀器： (1).直流電源 (2).緩衝劑容器(貯池)系,3.SDS-PAGE是PAGE的一種特殊型式，SDS是帶負 電荷的陰離子去污劑。 4.各種蛋白質分子在SDS-PAGE中，只能按其分子 量大小而分離。 5.電泳技術的廣泛應用已需要發展一種方法來用 在看見大分子在丙烯醯胺膠上分離，方法如 下： (1).Coomassie 亮藍

2、染色 (2).螢光染色技術,三、實驗儀器： 1. 夾心式垂直板電泳槽凝膠模 (1351001.5mm) 2. 直流穩壓電源(電壓 300600V，電流 50100mA),四、實驗藥品及試劑： 1.分子量測定標準蛋白質 2.連續體系SDS-PAGE有關試劑 (1).0.2M pH 7.2 磷酸鹽緩衝液： (2).樣品溶解液： (3).凝膠貯液： (4).凝膠緩衝液： (5).1% TEMED： (6).10% 過硫酸銨(AP)： (7).電極緩衝液(0.1% SDS，0.1M PH 7.2 磷酸鹽緩衝液)： (8).1%瓊脂醣：,3.不連續體系SDS-PAGE 有關試劑 (1).10%(W/V)

3、SDS溶液： (2).1% TEMED(V/V)： (3).10% 過硫酸銨(AP)(W/V)： (4).樣品溶解液： (5).凝膠貯液： (6).凝膠緩衝液： (7).電極緩衝液(內含0.1% SDS，0.05M Tris-0.384M甘胺酸緩衝液 PH 8.3)： (8).1%瓊脂醣： 4.固定液： 5.染色液：,6.脫色液：,五、實驗步驟： (一)、實驗步驟(一)： 1.安裝夾心式垂直板電泳槽 2. 配膠及凝膠板的製備 (1).配膠 (2).凝膠板的製備 3.樣品的處理與加樣 (1).樣品的處理 (2).加樣 4.電泳 5.凝膠板剝離與固定 6.染色與脫色 7.繪製標準曲線,(二)、實驗

4、步驟(二)： 蛋白質電泳-1 1.養菌 菌液(100L)+LB(100mL)+Amp(100L)+IPTG(100L) (1).配製培養基200mL 利用250mL錐形瓶 (2).調整PH值 (PH=7.0) (3).分裝於2瓶錐形瓶(每瓶錐形瓶100mL)，並 於每瓶錐形瓶用鋁鉑封口。 (4).置於滅菌鍋滅菌，操作時間約1小時 (5).滅完菌後，取出冷卻 (6).於錐形瓶中加入100L的菌種、100L的Amp 及100L IPTG.(於無菌操作台操作) (7).置於恆溫振盪器中培養16小時,蛋白質電泳-2 1.養菌：菌液(100L) + LB(100mL) +Amp(100L)+ IPTG(

5、100L) 2.離心，上層液不要，取下層沈澱物。 3.每支有沈澱物的離心管中加5mL磷酸緩衝液 (Pi buffer)溶解沈澱物用玻棒溶解沈澱物 4.溶解沈澱物均勻後，利用超音波震破機震破 細胞的細胞壁若酵素為胞外酵素，則不需此 程序；若酵素為胞內酵素，則需此程序將沈 澱物震破，以能取出胞內酵素 5.震破完後，離心，取上層液(即為酵素液)而 下層為細胞壁的殘骸，則滅菌後丟棄 6.上層液，測酵素活性：,(1).活性測試法： .先取5支1.5mL的離心管，每支加入200uL膠狀 chitin。 .離心完成後，先在25支加入800uL上層液(酵 素液)，將25置入37恆溫槽(維持酵素有活 性)，並開

6、始記時。 .而第1支(當Blank用)則加入800uL的上層液 (酵素液)，並加入200uL的DNS溶液，置入 95恆溫槽(破壞酵素活性)，反應10min。 .其餘25支置入37恆溫槽，每30分鐘取1支 出來，再加入200uL DNS溶液，在95反應 10min，其餘以此類推。 .觀察是否有顏色變化，若愈來愈深的話表示 此酵素液中含有此酵素。,7.酵素純化 8.跑蛋白質電泳(SDS-PAGE) (1).gel之配製 .玻璃置入組合架上，螺絲對角鎖緊 .裝入支撐架上，螺絲向內，有一響聲 .測試是否有漏水，水裝至小玻璃頂端， 若沒有漏水，則將水倒掉，再用拭鏡紙 將水吸乾。 .依配方配製好runni

7、ng gel後，倒入大小 玻璃之夾縫中，液位約在組合架凹洞的 底端。 .再加入n-butanol用以壓平 gel的液面,.待gel凝固後，則倒掉 n-butanol後，可用 水沖洗，再用拭鏡紙吸乾gel之液面水分 .將配製好的stacking gel倒入大小玻璃的 夾縫中(不能有氣泡)TEMED最後加入，再 立即倒入，否則stacking gel很容易凝固 .立刻置入齒梳，愈接近running gel愈好。 .凝固後(可用烘箱)，取出組合架，置入電泳 槽中 .槽中需放有4X running buffer .將置入槽中之組合架中的gel之齒狀凹洞中， 用注射筒吸取running buffer清洗

8、每個齒狀 凹洞。,.一切就緒後，開始注入處理過的sample 及 marker A.各管取 30L sample 置入 1.5mL tube 中，再加入 5L 之 5X sample buffer B.輕微離心 C.取 5L 之 protein marker D.各管置入dry bath 95 2min E.取出，預備注入膠片之溝槽中 註：marker在注入溝槽時，可能因加熱過 程中損失，可加入running buffer稀 釋，再注入溝槽中。,.注射完後，將組合架之電極蓋上，紅-紅； 黑-黑。Power supply之使用： A. 開power B. 按enter C. 按memory D. 按1 E. 按1 F. 按enter G. 按start .按完後，即可開始進行 SDS-PAGE .SDS-PAGE 執行完，由兩片玻璃間拆下gel ，要小心，盡量不要使gel破掉。,.將 gel (此時沒有band)置入含有 stain solution的盤子中，約1小時的震盪搖晃