免疫组化操作方法简介.ppt

1、免疫组化基本操作,小 新,SP原理,免疫组化实验基本原理,免疫组化实验操作步骤,切片脱蜡至蒸馏水或PBS PBS冲洗2min3次，（如需抗原修复，可在此步后进） 3%H2O2室温孵育10分钟。蒸馏水冲洗，PBS冲洗2min3 滴加一抗工作液，37孵育1.52h或4过夜。PBS冲洗， 2min3次 滴加适当量的检测系统，37孵育1530分钟 PBS冲洗， 2min3次 DAB显色剂显色 自来水充分冲洗，苏木素复染，脱水透明（如需要）、封 片,组织的前期处理,组织固定 烤片,固定时间对染色的影响,固定比较：Vimentin （V-9）,中性福尔马林固定 72小时,中性福尔马林固定48小时,固定时间

2、较长的标本，可通过加强修复 增强染色效果 取材后组织（1.01.40.4cm）推 荐后固定时间4-18小时,Ci pH 6 10Min,Ci pH 6 30Min,TE pH 9 10Min,烤片的温度不宜过高 烤片的时间不宜过长,烤片的影响因素,二个主要因素：,烤片的温度和时间对组织内抗原 的保存有一定的影响，尤其是细 胞核阳性的抗原 推荐烤片温度及时间68-70烤2-4 小时,烤片的影响因素,抗原方式的选择及操作方法 一抗的选择及稀释比 检测系统的恰当匹配,实验中需要注意的问题,关键步骤：,温度和时间的相关性 修复液的pH值亦很重要,抗原修复的主要方法,抗原热修复的主要影响因素：,抗原热修

3、复温度和时间的关系,MBI单克隆抗体免疫组化灵敏度实验,抗原热修复的有效性 =加热温度（T） 加热时间（t）,高温可以缩短修复时间 低温需要更长的修复时间 某些蛋白（抗原）需要较低温度修复,微波炉修复和高压锅修复的比较,不同修复方式CD20的染色结果,单克隆抗体 CD20 高压锅修复,单克隆抗体 CD20 微波修复,抗原热修复:pH值的影响,pH6,A：CD20 B：Ki-67 C：HMB45 D: MOC31,pH8-9,A 稳定型抗体：pH值改变对实验结 果影响不大 B “V”型抗体：强酸强碱修复液效 果好，但强酸条件下，细胞皱缩 变形，影响观察 C 上升型抗体：修复液pH值越高， 效果越

4、好 D下降型抗体：适用于酸性修复液,四种类型的抗体,抗 原 修 复,Calponin: 用不同pH值修复液的实验结果,高压修复： 将修复液烧开后将切片放入高压锅中，然后 盖好盖子，加上气压阀，继续加热。待喷汽后开始计时2.5分钟后停止加热，自然冷却。 微波修复： 将切片放入修复液中，然后将修复液烧开，此时降低火力持续20分钟。然后自然冷却。,抗原热修复方式的推荐,不修复 热修复 ：微波、高压、水浴 酶消化：胃酶、胰酶、蛋白酶K、 XXV酶 双暴露：先热处理后酶消化or先酶 消化后热处理,选择最佳修复方式,正确的克隆号 适当的稀释度 推荐4过夜，可以选择室温1.52h或37 1h,一抗的选择,检测系统的选择,针对不同的组织选择不同的二抗 两步法原理,单克隆抗体 Chromogranin A,多克隆抗体 Chromogranin A,CgA多克隆与兔单抗比较,针对不同组织选择不同的二抗,对于肝脏、肾脏等生物素含量高的标 本一定要选择非生物素的检测系统 酶标二抗可以有效避免生物素的干