高效毛细管电泳.ppt

1、高效毛细管电泳,High performance capillary electrophoresis, HPCE,毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳(HPCE)或毛细管电分析法（CESM）。 它是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术。 毛细管电泳是凝胶电泳技术的发展，是高效液相色谱分析的补充。,简介,特点,毛细管电泳突出的优点： 高效（105TP/m-107TP/m）、快速（几十秒至几十分钟）； 分离模式多，选择自由度大； 分析对象广，小到无机离子大至整个细胞，具有“万能”分析功能或潜力。 操作可高度自动化； 样

2、品与试剂消耗量小，运转费用低，无环境污染问题。,特点,缺点 制备能力低 需要高灵敏度检测方法 在毛细管中填充非液体介质如凝胶需要专门技术 毛细管侧面积相对大而容积小，管壁对样品的作用容易被放大，不利于有吸附性的样品如蛋白质的分析； 电渗变化影响分离重现性和分离模式的选用，必须对电渗进行定量的控制。,毛细管电泳仪工作示意图,结构组成,毛细管电泳仪主要由5部分组成：毛细管、进样系统、高压系统、检测系统和数据采集系统组成。,高压电源,（1）稳定、连续可调的直流电源，一般最高电压可达到30-50kV，最大电流为200-300mA ； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （

3、4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换； （6）有良好的绝缘性能。,毛细管,（1）材料：要求具有化学、电学惰性，紫外-可见光透光性，柔韧性，高强度，价廉。 普通玻璃毛细管：价格便宜，但电渗大，吸附作用大。 石英玻璃毛细管：常用，外层涂聚酰亚胺。性能稳定，电渗较大，但也有一定的吸附。 聚四氟乙烯毛细管：新材料，电渗小，但性能不太稳定。 （2）规格：内径20200m，外径350400m；长度=1m ；,毛细管电泳进样方式进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小进样系统：手动进样系统和自动进样系统。,进样方式一般有： 电动进样 压差进样 扩散进样,电动进样,将毛细管的阳极直接与样品接

4、触，短时间内施加电压，使样品通过电迁移的方式进入毛细管的阳极端。 进样量：与溶质浓度，加电压的强度，电迁移时间，电迁移速度，电渗速度等因素有关。 优点：进样准确，容易控制重复性好。 缺点：对浓度低的组分有歧视效应。,压差进样,(1)虹吸进样： 进样时将阳极槽抬高形成槽的落差，利用液体重力差将样品吸入阳极端的毛细管内。 进样：量与落差、样品浓度、进样时间成正比，与样液粘度成反比 优点：操作简便，重复性好。 缺点：比较适于自由电泳，而不适于凝胶电泳。,(2)加压进样：,进样时将阳极端密闭，施加一定的液压把样品吸入毛细管内。 进样量：与液压强度、样品浓度、进样时间成正比，与样液粘度成反比。,(3)真

5、空进样,利用两端的气压差将样品送入毛细管内。 进样量：与真空度、样品浓度、进样时间成正比，与粘度成反比。,扩散进样,当将毛细管插入一样品溶液时，样品分子因管口界面存在浓度差而向管内扩散。 进样量：与扩散系数，样品浓度，进样时间 成正比。,类型 检测限/mol 紫外-可见 10-1310-15 荧光 10-1510-17 激光诱导荧光 10-1810-20 电导 10-1810-19,检测器 毛细管电泳配置的检测器与高效液相色谱使用的检测器大致相同，都属于超微量分析，对检测器的灵敏度要求比较高， 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；,检测器,紫外检测器：氘

6、灯（波长范围190-400nm），有机物一般在254nm波长处有吸收。 也可进行全波长扫描。,(1)空气制冷：在毛细管分析室内输入制冷空气使毛细管迅速冷却，达到制冷的目的。 (2)液体制冷：在毛细管的夹层中输入制冷液体达到制冷的目的。,热效应： 在高电场下毛细管中的电解质和电流发生剧烈的摩擦，产生大量的热，这种自热现象，称之为热效应。,制冷系统,基本原理,在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下以不同的速度定向迁移的现象叫电泳。 CE所用的石英毛细管柱，在pH3的情况下，其内表面带负电，和溶液接触时形成双电层。在高电压的作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体向负极方向迁移的现象叫电渗。电渗是毛细

7、管中的溶剂因轴向直流电场的作用而发生的定向流动。,各种粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和。 正离子的运动方向和电渗流一致，故最先流出； 中性粒子的电泳速度为零，故其迁移速度等于电渗流速度； 负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳速度，故它将在中性粒子之后流出。 各种粒子因迁移速度不同而实现分离。,基本原理,CE分离原理示意图,毛细管电泳的分离分析类型,用途,可用于分析有机化合物、无机离子、中性分子、药物、手性化合物、蛋白质和多肽、DNA及其碎片、糖及糖蛋白、细胞分离等。 可应用于分子生物学、基因组学、蛋白质组学、糖生物学、各种生物技术、生物

8、化学、细胞学等生物或生命科学以及医药、食品、环境、公安侦破、农业、化学和化工等不同领域。,阳离子分析,迁移方向和电渗流方向一致； 4.5min内分离了24种金属离子； 阳极进样，阴极检测； 具有很高的灵敏度；,阴离子分析,阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低； 质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测； 加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴极进样，阳极检测； 离子价态及存在形态分析；,药物分析,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析； 尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段； 采用毛细管区带电泳方式，在11min内分离