分子生物学实验课：荧光实时定量PCR检

1、荧光实时定量PCR检测技术标准曲线绘制,一 目的： 采用SYBR green I 法绘制荧光定量PCR反应标准曲线，建立CT值与样品量之间的线性关系。 二 概述 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号改变实现实时监测整个PCR进程，并对起始模板进行定量分析的方法。 该法具有特异性更强，灵敏度高，自动化程度高、操作简单等特点。,三 SYBR Green I法原理： SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，在特定波长激发光的照射下发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产

2、物的增加完全同步。 *SYBR Green也能和非特异性的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析。,四、结果解析： 标准曲线分析：以基因组DNA、PCR产物、纯化的质粒DNA，cDNA作为标准品，梯度稀释（稀释倍数通常为10）准确配制标准品系列，然后进行荧光定量反应，绘制标准曲线。 同步进行检测样品的荧光定量PCR反应，根据标准曲线即可获取未知样品的量。,1.标准品制备及注意事项 要求5点以上 制备方法：选择目标、制备、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释。 a. CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间 b.10倍连续梯度稀释操作方法： 1 取1v标准品原液(标准品i) +

3、9v稀释缓冲液，得标准品ii 2 取1v稀释的标准品(标准品ii)+9v稀释缓冲液，得标准品iii 3 取1v稀释2次的标准品(标准品iii) +9v稀释缓冲液，得标准品iv 4 取1v稀释3次的标准品(标准品iv) +9v稀释缓冲液，得标准品v *切不可由标准品i加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v,c. 标准品的性质决定最终结果的性质： 1.DNA标准品，已知拷贝数绝对定量，得未知样品拷贝数 50g/ml 1kb DNA 的摩尔数为4.741013/ml 2.DNA标准品，已知ng/uL绝对定量，得未知样品ng/uL 3.DNA标准品，未知拷贝数或浓度，已知稀释倍数相

4、对定量，得未知样品之间相差倍数 4.RNA标准品，已知ng/uL，与未知样品同样反转录，梯度稀释cDNA相对定量，得未知样品ng RNA/uL,理想的标准曲线 相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。,扩增效率（E）计算方法 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-1/a-1 绝对定量： 优 点 给出的是目标基因的绝对数量 缺 点 必须有标准样品 标准样品的基因数量必须准确测定。,相对定量比较不同样品的基因表达量(无单位) 相对标准曲线方法或者Ct方法 任何DNA或者RNA，只要含有目标基因

5、都可以用来制备相对标准曲线 需要校正加样误差 管家基因（endogenous control）校正 应用最广泛的方法,融解曲线分析 SYBR Green I法进行检出时， 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性,特异性产物,非特异性产物,引物二聚体,目标基因 内对照基因,IL-2 18S,比较Ct法（Ct法）:假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出： 目的基因的量=2-Ct 其中： Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照 2-Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数 Normalization Gene (内对照基因) 其表达水平是

6、恒定的(需要用户自己确认) 校正模板在核酸数量上的差异,比如,Sample Calibrator,比如,处理后 处理前,Calibrator Sample（基准样品） 得出相对于某一个样品的基因表达量, 1X sample. Treated vs. Untreated, 0 hr vs. 6 hr, Normal vs. Diseased.,在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接通过比较Ct法（Ct法）得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线，更为简便省时，也是相当可靠的。,主要试剂及仪器： 试剂：SYBR Premix EX Taq kit(TaKaRa) 标注品DN

7、A 仪器：荧光定量PCR仪（stratagene公司的MX3000P） 实验步骤 1.将标准品样品及荧光定量试剂取出解冻。 2.用easy dilution buffer将DNA样品做系列稀释，按照10倍连续梯度稀释法稀释，做5个梯度。 按下表配制反应体系(为单管反应)，由于同一样品一般至少要重复三次，所以在下反应数量基础上乘3，获得一个总反应体系。,2 master mix 10 l primer mix(2M) 2l DNA 1l 50ROX 0.4 l ddH2O 6.6l total 20l,4 按每管的反应体积分装至专用的定量PCR管的每一管中，最后将不同稀释倍数的标准品按顺序加入各

8、管中，每管1l，盖上盖子，离心。 5.上机。,参数设置： 荧光染料的选择 样品孔的设定： 标注品，未知样品，NC等 反应条件设定：95,30s;95,5s；58,30s；72,30s开始循环，40 cycles; 95,1min,55,30s,95,30s 绘制融解曲线。 结果分析：参考结果解析。,注意事项： 1. 一般推荐的primer终浓度为200 nM ； 2. 由于SYBR Green也能和非特异性的双链DNA结合发光，所以必须反应结束后要做熔解曲线分析； 3. 样品和标准品都要重复，且重复次数须遵循统计学要求； 4. 实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能，避免将核酸从一个实验带入下一个实验，如在操作中，应使用不含荧光物质的一次性手套（经常替换）、一次性移液器吸